乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用的制作方法

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用。

背景技术：

动物血清有报道可作为肿瘤细胞的抑制剂，可以作为肿瘤治疗的一种药物，可以抑制肿瘤细胞的生长而对正常细胞无影响。近些年来，血清以其独特的保健作用越来越引起人类的关注，其产业也迅速崛起，成为极有发展潜力的新兴领域。有研究发现豚鼠血清对人淋巴瘤细胞有抑制，而对正常的细胞无影响；也有观察到不同种属来源和浓度的动物血清对体外培养的肿瘤细胞(a549、mcf-7、bgc-823)生长的影响，结果表明虽然不同种属来源的动物血清对肿瘤细胞生长的影响作用各不相同，但随着加入量的增加，大多数血清会对肿瘤细胞的生长产生负效应等等。

乌龟(chinemysreevesii)是人类普遍饲养的动物，其肉味鲜美营养丰富，应用价值广泛，龟甲、龟血、龟肉等具有抗肿消炎增强免疫力等多方面的作用，是我国首批列为药食同源的保健疗效食品之一。近年来，乌龟(chinemysreevesii)由于其较高的营养价值、药用价值、研究价值和观赏性已经得到了人们的广泛认可，作为这么一类药用价值极高的动物，目前却尚未见到关于其血清对肿瘤细胞抑制作用的研究报道。

技术实现要素：

鉴于以上所述，本发明的目的在于提供乌龟血清在人肺癌细胞中增殖抑制的应用。

本发明采用的技术方案为：乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用，步骤如下：

(1)提取乌龟血清：无菌条件下于乌龟心脏采血，室温静置2h彻底凝固后，3000r/min，离心20min，分离血清，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃条件下低温保存，备用，使用前用dmem培养液分别配置成含有1％、5％和10％乌龟血清的dmem细胞培养液；

(2)cck-8法测定乌龟血清对人肺癌肿瘤细胞增殖的影响：将对数生长期的肺癌肿瘤细胞浓度调整为1×10⁴个/ml，加入96孔板中，100μl/孔，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃上清，分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，每个浓度设6个复孔，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照实验，继续培养24h，cck-8法测定450nm纳米处吸光度od值，重复实验三次，记录下平均数据；

(3)dapi染色检测细胞核形态变化：把处于对数生长期的肺癌肿瘤细胞接种于6孔板，密度约2×10⁸/l，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照组，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h后用pbs洗清多次，避光条件下用质量浓度为1mg/l的dapi染色3min，染色结束后再用pbs避光条件下清洗多次，将染色清洗处理好的细胞放置在荧光显微镜下观测和拍照分析；

(4)westernbloting检测akt/mtor/s6磷酸化情况：提前24h把对数生长期的肺癌肿瘤细胞接种于6孔板，密度约2×10⁸/l，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照组，培养24h后，每孔加入150μl细胞裂解液，在冰上裂解40min，然后加入150μl2×sdsloadingbuffer的十二烷基硫酸钠蛋白上样缓冲液，水浴煮沸5min，再依次使用质量浓度为5％的浓缩胶和质量浓度为10％的分离胶进行sds-page蛋白电泳，转膜至pvdf膜上，最后用质量浓度为5％脱脂牛奶溶液封闭1h，孵育一抗4℃过夜，荧光二抗孵育1h，使用胶片曝光进行成像；

(5)annexinv-fitc/pi检测细胞凋亡率：提前24h把对数生长期的肺癌肿瘤细胞接种于6孔板，密度约2×10⁸/l，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照组，培养24h后，使用质量分数为0.25％的胰酶消化，消化后在800r/min的转速下离心3min收集细胞样品，然后使用提前预冷过的pbs清洗多次，清洗处理后采用annexinv-fitc/pi试剂盒再处理细胞样品，然后用流式细胞仪上机检测和数据分析，每次计数1×10⁴个细胞。

在步骤(1)中，所述dmem培养液为高糖型dmem培养液。

在步骤(4)中，所述细胞裂解液为western及ip细胞裂解液，货号为p0013。

在步骤(5)中，所述annexinv-fitc/pi试剂盒处理步骤为：加入1×bindingbuffer400μl重悬细胞样品后，再依次加入annexinv-fitc5μl和pi5μl的标记液，避光室温孵育细胞样品15min。

本实验主要对人肺癌肿瘤h1299细胞进行增值抑制实验检测，实验以快速提取乌龟血清为基础，然后通过cck-8检测h1299细胞增值的抑制率和dapi细胞核染色观察其形态变化，发现乌龟血清确实会对h1299细胞会有一定的抑制作用，后续实验继续发现乌龟血清对于人肺癌肿瘤h1299细胞的抑制作用是通过抑制akt-mtor-s6这条信号通路的表达来进行，并且最终导致肿瘤细胞发生了一定程度的凋亡。

同时，本发明还对人肝癌7721细胞和人乳腺癌mda-mb-231细胞进行增值抑制实验检测，得出乌龟血清对肝癌7721细胞和乳腺癌mda-mb-231细胞也具有一定的细胞增值抑制作用，只是相对于人肺癌h1299细胞较低一点，但是其细胞凋亡程度不明显。

本发明的有益效果：通过细胞功能实验，我们发现乌龟血清对人肺癌h1299细胞的增殖有明显的抑制作用，且同时实验验证发现乌龟血清还可以一定程度的诱导人肺癌h1299细胞的细胞凋亡。

附图说明

图1为实施例1步骤(2)中不同含量的乌龟血清对人肺癌肿瘤h1299细胞的cck-8法测定细胞增殖影响的示意图；

图2为实施例1步骤(3)中不同含量的乌龟血清对人肺癌肿瘤h1299细胞的dapi染色检测细胞核形态变化的示意图；

图3为实施例1步骤(4)中不同含量的乌龟血清对人肺癌肿瘤h1299细胞的westernbloting检测akt/mtor/s6磷酸化情况的示意图；

图4为实施例1步骤(5)中不同含量的乌龟血清抑制人肺癌肿瘤h1299细胞的凋亡率的示意图；

图5为对比例1步骤(2)中不同含量的乌龟血清对人肝癌7721细胞的cck-8法测定细胞增殖影响的示意图；

图6为对比例2步骤(2)中不同含量的乌龟血清对人乳腺癌mda-mb-231细胞的cck-8法测定细胞增殖影响的示意图。

其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不局限于这些实施例。实施例中，所有试剂等都为安耐吉试剂产品。

实施例1

乌龟血清在人肺癌肿瘤h1299细胞中抑制作用的应用，步骤如下：

(1)提取乌龟血清：无菌条件下于乌龟心脏采血，室温静置2h彻底凝固后，3000r/min，离心20min，分离血清，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃条件下低温保存，备用，使用前用dmem培养液分别配置成含有1％、5％和10％乌龟血清的dmem细胞培养液；

(2)cck-8法测定乌龟血清对人肺癌肿瘤h1299细胞增殖的影响：将对数生长期的肺癌肿瘤h1299细胞浓度调整为1×10⁴个/ml，加入96孔板中，100μl/孔，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃上清，分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，每个浓度设6个复孔，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照实验，继续培养24h，cck-8法测定450nm纳米处吸光度od值，重复实验三次，记录下平均数据；

(3)dapi染色检测细胞核形态变化：把处于对数生长期的肺癌肿瘤h1299细胞接种于6孔板，密度约2×10⁸/l，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照组，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h后用pbs洗清多次，避光条件下用质量浓度为1mg/l的dapi染色3min，染色结束后再用pbs避光条件下清洗多次，将染色清洗处理好的细胞放置在荧光显微镜下观测和拍照分析；

(4)westernbloting检测akt/mtor/s6磷酸化情况：提前24h把对数生长期的肺癌肿瘤h1299细胞接种于6孔板，密度约2×10⁸/l，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照组，培养24h后，每孔加入150μl细胞裂解液，在冰上裂解40min，然后加入150μl2×sdsloadingbuffer的十二烷基硫酸钠蛋白上样缓冲液，水浴煮沸5min，再依次使用质量浓度为5％的浓缩胶和质量浓度为10％的分离胶进行sds-page蛋白电泳，转膜至pvdf膜上，最后用质量浓度为5％脱脂牛奶溶液封闭1h，孵育一抗4℃过夜，荧光二抗孵育1h，使用胶片曝光进行成像；

(5)annexinv-fitc/pi检测细胞凋亡率：提前24h把对数生长期的肺癌肿瘤h1299细胞接种于6孔板，密度约2×10⁸/l，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照组，培养24h后，使用质量分数为0.25％的胰酶消化，消化后在800r/min的转速下离心3min收集细胞样品，然后使用提前预冷过的pbs清洗多次，清洗处理后采用annexinv-fitc/pi试剂盒再处理细胞样品，然后用流式细胞仪上机检测和数据分析，每次计数1×10⁴个细胞。

对比例1

乌龟血清在人肝癌7721细胞中抑制作用的应用，步骤如下：

(1)提取乌龟血清：无菌条件下于乌龟心脏采血，室温静置2h彻底凝固后，3000r/min，离心20min，分离血清，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃条件下低温保存，备用，使用前用dmem培养液分别配置成含有1％、5％和10％乌龟血清的dmem细胞培养液；

(2)cck-8法测定乌龟血清对肝癌7721细胞增殖的影响：将对数生长期的肝癌7721细胞浓度调整为1×10⁴个/ml，加入96孔板中，100μl/孔，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃上清，分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，每个浓度设6个复孔，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照实验，继续培养24h，cck-8法测定450nm纳米处吸光度od值，重复实验三次，记录下平均数据。

对比例2

乌龟血清在人乳腺癌mda-mb-231细胞中抑制作用的应用，步骤如下：

(1)提取乌龟血清：无菌条件下于乌龟心脏采血，室温静置2h彻底凝固后，3000r/min，离心20min，分离血清，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃条件下低温保存，备用，使用前用dmem培养液分别配置成含有1％、5％和10％乌龟血清的dmem细胞培养液；

(2)cck-8法测定乌龟血清对乳腺癌mda-mb-231细胞细胞增殖的影响：将对数生长期的乳腺癌mda-mb-231细胞浓度调整为1×10⁴个/ml，加入96孔板中，100μl/孔，在37℃，5％co2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃上清，分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的dmem细胞培养液，每个浓度设6个复孔，以含有10％小牛血清的dmem细胞培养液为对照实验，继续培养24h，cck-8法测定450nm纳米处吸光度od值，重复实验三次，记录下平均数据。

通过附图1-6和细胞功能实验，我们发现乌龟血清对肺癌h1299细胞、肝癌7721细胞和乳腺癌mda-mb-231细胞的增殖有明显的抑制作用，其中对肺癌h1299细胞的抑制作用最明显，对肝癌7721细胞和乳腺癌mda-mb-231细胞的抑制作用相对较低，同时实验验证发现乌龟血清还可以一定程度的诱导肺癌h1299细胞的细胞凋亡。