本发明特别涉及一种从虫草蛹中萃取核苷类和氨基酸类活性物质的方法，属于药用真菌分离提纯技术领域。
背景技术：
蛹虫草通常是由子座(即草部分，又称子实体)与菌核(即昆虫的尸体部分)两部分组成的复合体。中医认为，蛹虫草既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是一种能同时平衡、调节阴阳的中药。
目前通常将蛹虫草与其它中草药配伍，以作为药物或者保健品使用。或者，将蛹虫草进行粉碎、破壁等处理后作为保健品使用。但这些方式对于蛹虫草内的功能成分的利用率很低。
近年来，业界关注的热点是蛹虫草中虫草素的提取。这主要是因为虫草素能干扰细胞rna和dna的合成，抑制不正常细胞(癌细胞)的分裂，并能作为区别细胞中不同的rna聚合酶的工具，具有修复基因，保护生命体遗传密码的特殊功效。然而这些方法会造成蛹虫草中诸多有效成分的流失，无法实现蛹虫草的充分利用。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种从虫草蛹中萃取核苷类和氨基酸类活性物质的方法，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种从虫草蛹中萃取核苷类和氨基酸类活性物质的方法，包括：
(1)将摘除子实体的虫草蛹以丙三醇消毒吹干，将所述虫草蛹置于培养室中于16～20℃、相对湿度为65～70％的黑暗条件下处理36～48h，其中采用包含虫草菌丝的悬浮液喷洗培养室调节并保持湿度；
(2)将经步骤(1)处理后的虫草蛹于-20～-10℃、惰性气氛内保存处理3～6h，之后直接粉碎过60～100目筛，再于室温下加入石油醚脱脂，滤去石油醚得到蛹虫粉末；
(3)在真空条件下将所述蛹虫粉末以1～3℃/min的升温速率从室温升温至60～80℃并保温30～80min，再按照1：10～15的料液质量比将蛹虫粉末加入体积比为1：1：1～1：3：5的n,n-二甲基-n-(2-羟基-乙氧基乙酯)丙酸铵、乙酸乙酯与水的混合溶剂，并以功率为30～50w的超声辅助处理1～3h，之后以4000～6000rpm的转速离心过滤，分离获得滤出物和棕黄色提取液，其后将所述提取液与分子量为2～3万道尔的壳聚糖按照10:1～2的质量比混合，再于50～60℃、0.05～0.09mpa的条件下减压浓缩，获得核苷类活性物质的浓缩物；
(4)将所获滤出物与木瓜蛋白酶、乙醇按照1：0.1～0.2：6～10的质量比混合形成混合体系，调节混合体系的温度为30-55℃、ph值为5.5～6.5，保持10min～25min，其后向混合体系中依次加入纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶，之后以功率为200～300w的超声波处理0.5～1h；
(5)将步骤(4)中的混合体系加入填充有阳离子交换树脂的层析柱，之后采用氨水进行洗脱，将收集的洗脱液置入-15～-10℃冷冻干燥，收集所获晶体粉末；
(6)以水溶解步骤(5)所获晶体粉末形成溶液，并加入活性炭，于-15～-10℃搅拌过滤后，在室温条件下将滤液以300～350kd的渗透膜渗析过夜，获得氨基酸类活性物质。
进一步的，步骤(4)中所述纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶的总用量占所述混合体系质量的1～3％。
进一步的，步骤(4)中所述纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶的质量比为1～3：1～5：1。
进一步的，步骤(6)中所述活性炭与溶液的用量比为0.5～1g:200ml。
与现有技术相比，本发明提供的方法流程工艺简单，使用的溶剂等材料廉价易得无污染，可以实现蛹体中核苷类、氨基酸类活性物质的高效提取，而且这些核苷类活性物质利于促进生物组织的修复和抑制细菌感染，这些氨基酸类活性物质呈现出很好的抗肿瘤特性，有望在医疗领域广泛应用。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将结合若干实施例对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
实施例1
(1)将摘除子实体的虫草蛹以丙三醇消毒吹干，将所述虫草蛹置于培养室中于16℃、相对湿度为70％的黑暗条件下处理48h，其中采用包含1g/l虫草菌丝的悬浮液喷洗培养室调节并保持湿度；
(2)将经步骤(1)处理后的虫草蛹于-20℃、惰性气氛内保存处理3h，之后直接粉碎过100目筛，再于室温下加入石油醚脱脂，滤去石油醚得到蛹虫粉末；
(3)在真空条件下将所述蛹虫粉末以1℃/min的升温速率从室温升温至60℃并保温80min，再按照1：10的料液质量比将蛹虫粉末加入体积比为1：1：1的n,n-二甲基-n-(2-羟基-乙氧基乙酯)丙酸铵、乙酸乙酯与水的混合溶剂，并以功率为30w的超声辅助处理1h，之后以6000rpm的转速离心过滤，分离获得滤出物和棕黄色提取液，其后将所述提取液与分子量为3万道尔的壳聚糖按照10:1的质量比混合，再于60℃、0.09mpa的条件下减压浓缩，获得核苷类活性物质的浓缩物。以hplc、lc-ms分别对该浓缩物进行分析，可以发现其应为多种短链寡聚核苷酸的复合物。
(4)将所获滤出物与木瓜蛋白酶、乙醇按照1：0.1：6的质量比混合形成混合体系，调节混合体系的温度为55℃、ph值为5.5，保持25min，其后向混合体系中依次加入纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶(三者的质量比为1：1：1，总用量占所述混合体系质量的1％)，之后以功率为200w的超声波处理1h；
(5)将步骤(4)中的混合体系加入填充有阳离子交换树脂的层析柱，之后采用氨水进行洗脱，将收集的洗脱液置入-10℃冷冻干燥，收集所获晶体粉末；
(6)以水溶解步骤(5)所获晶体粉末形成溶液，并加入活性炭(活性炭与溶液的用量比为1g:200ml)，于-10℃搅拌过滤后，在室温条件下将滤液以约350kd的渗透膜渗析过夜，获得氨基酸类活性物质。以hplc、lc-ms分别对该氨基酸类活性物质进行分析，可以发现其应为多种小分子多肽的复合物。
实施例2
(1)将摘除子实体的虫草蛹以丙三醇消毒吹干，将所述虫草蛹置于培养室中于18℃、相对湿度为65％的黑暗条件下处理36h，其中采用包含2g/l虫草菌丝的悬浮液喷洗培养室调节并保持湿度；
(2)将经步骤(1)处理后的虫草蛹于-15℃、惰性气氛内保存处理6h，之后直接粉碎过60目筛，再于室温下加入石油醚脱脂，滤去石油醚得到蛹虫粉末；
(3)在真空条件下将所述蛹虫粉末以3℃/min的升温速率从室温升温至80℃并保温30min，再按照1：15的料液质量比将蛹虫粉末加入体积比为1：2：4的n,n-二甲基-n-(2-羟基-乙氧基乙酯)丙酸铵、乙酸乙酯与水的混合溶剂，并以功率为30w的超声辅助处理2h，之后以5000rpm的转速离心过滤，分离获得滤出物和棕黄色提取液，其后将所述提取液与分子量为2万道尔的壳聚糖按照5:1的质量比混合，再于50℃、0.05mpa的条件下减压浓缩，获得核苷类活性物质的浓缩物；以lc-ms对该浓缩物进行分析，可以发现其谱图与实施例1所获相应谱图基本相同。
(4)将所获滤出物与木瓜蛋白酶、乙醇按照1：0.2：8的质量比混合形成混合体系，调节混合体系的温度为45℃、ph值为6.5，保持15min，其后向混合体系中依次加入纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶(三者的质量比为2：5：1，总用量占所述混合体系质量的2％)，之后以功率为300w的超声波处理1h；
(5)将步骤(4)中的混合体系加入填充有阳离子交换树脂的层析柱，之后采用氨水进行洗脱，将收集的洗脱液置入-15～-10℃冷冻干燥，收集所获晶体粉末；
(6)以水溶解步骤(5)所获晶体粉末形成溶液，并加入活性炭(活性炭与溶液的用量比为0.5g:200ml)，于-15℃搅拌过滤后，在室温条件下将滤液以约350kd的渗透膜渗析过夜，获得氨基酸类活性物质。以lc-ms对该氨基酸类活性物质进行分析，可以发现其谱图与实施例1所获相应谱图基本相同。
实施例3
(1)将摘除子实体的虫草蛹以丙三醇消毒吹干，将所述虫草蛹置于培养室中于20℃、相对湿度为70％的黑暗条件下处理42h，其中采用包含3g/l虫草菌丝的悬浮液喷洗培养室调节并保持湿度；
(2)将经步骤(1)处理后的虫草蛹于-10℃、惰性气氛内保存处理5h，之后直接粉碎过80目筛，再于室温下加入石油醚脱脂，滤去石油醚得到蛹虫粉末；
(3)在真空条件下将所述蛹虫粉末以2℃/min的升温速率从室温升温至70℃并保温60min，再按照1：12的料液质量比将蛹虫粉末加入体积比为1：3：5的n,n-二甲基-n-(2-羟基-乙氧基乙酯)丙酸铵、乙酸乙酯与水的混合溶剂，并以功率为50w的超声辅助处理2h，之后以4000rpm的转速离心过滤，分离获得滤出物和棕黄色提取液，其后将所述提取液与分子量为2万道尔的壳聚糖按照6:1的质量比混合，再于60℃、0.06mpa的条件下减压浓缩，获得核苷类活性物质的浓缩物；以lc-ms对该浓缩物进行分析，可以发现其谱图与实施例1所获相应谱图基本相同。
(4)将所获滤出物与木瓜蛋白酶、乙醇按照1：0.1：10的质量比混合形成混合体系，调节混合体系的温度为45℃、ph值为6.5，保持20min，其后向混合体系中依次加入纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶(三者的质量比为3：5：1，总用量占所述混合体系质量的3％)，之后以功率为300w的超声波处理0.5h；
(5)将步骤(4)中的混合体系加入填充有阳离子交换树脂的层析柱，之后采用氨水进行洗脱，将收集的洗脱液置入-15℃冷冻干燥，收集所获晶体粉末；
(6)以水溶解步骤(5)所获晶体粉末形成溶液，并加入活性炭(活性炭与溶液的用量比为1g:200ml)，于-15℃搅拌过滤后，在室温条件下将滤液以约350kd的渗透膜渗析过夜，获得氨基酸类活性物质。以lc-ms对该氨基酸类活性物质进行分析，可以发现其谱图与实施例1所获相应谱图基本相同。
对比例1：与实施例1基本相同，但未包含步骤(1)。该对比例所获核苷类活性物质的浓缩物、该氨基酸类活性物质的hplc谱图较之实施例1所获相应的谱图，有部分的色谱峰消失，且峰强度明显减小。
对比例2：与实施例1基本相同，区别支出在于，步骤(3)为：在真空条件下将所述蛹虫粉末以1℃/min的升温速率从室温升温至60℃并保温80min，再按照1：10的料液质量比将蛹虫粉末加入体积比为1：1的乙酸乙酯与水的混合溶剂，并以功率为30w的超声辅助处理1h，之后以6000rpm的转速离心过滤，分离获得滤出物和棕黄色提取液，其后将所述提取液与分子量为3万道尔的壳聚糖按照10:1的质量比混合，再于60℃、0.09mpa的条件下减压浓缩，获得核苷类活性物质的浓缩物。该对比例所获核苷类活性物质的浓缩物的lc-ms谱图与实施例1所获相应的谱图有显著差异，其中几乎有50％的峰消失。
对比例3：与实施例1基本相同，区别支出在于，步骤(4)为：将所获滤出物与乙醇按照1：10的质量比混合形成混合体系，调节混合体系的温度为45℃、ph值为6.5，保持20min，其后向混合体系中依次加入纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶(三者的质量比为3：5：1，总用量占所述混合体系质量的3％)，之后以功率为300w的超声波处理0.5h。该对比例所获氨基酸类活性物质的lc-ms谱图与实施例1所获相应的谱图有显著差异，其中仅有约10％的峰重叠。
对比例4：
(1)粉碎脱脂：将虫草蛹烘干，粉碎，加石油醚脱酯，滤去石油醚，干燥，得到虫草蛹粉末；
(2)乙醇浸提：脱脂后的虫草蛹粉末用乙醇浸提，过滤，浓缩，浓缩液用水洗涤至少两次，收集滤液，即虫草素粗提液；
(3)萃取：向虫草素粗提液中加入乙酸乙酯，萃取，取有机相减压蒸馏至干；
(4)纯化：步骤(3)所得物加水至恰好溶解，过滤除杂，d1400树脂层析，将层析液浓缩干燥得虫草素和少量的氨基酸类活性物质(lc-ms谱图中的部分峰与实施例1重叠)。
分别取实施例1-实施例3、对比例1-对比例4所获的氨基酸类物质以生理盐水稀释100-1000倍后对500只患有胰腺癌的小白鼠进行注射实验，另外取生理盐水对500只患有胰腺癌的小白鼠进行注射实验(空白组)，置于相同的饲养环境中培养180天，每隔五天抽血取样，并观测记录小白鼠体内的癌细胞于淋巴系统中的扩散情况。实验结果表明，空白组的小白鼠存活率约为20％，注射实施例1-3中的氨基酸类活性物质的小白鼠存活率约为97％，而注射对比例1、2、3、4中的氨基酸类活性物质的小白鼠存活率分别约为50％、74％、42％、38％。
另外，本案发明人还发现，实施例1-3所获核苷类活性物质在以去离子水稀释后涂覆到人体皮肤表面的创痕处时，能有效抑制伤口处的感染，并能促进伤口的愈合。而对比例1-3所获的核苷类活性物质均无此功效。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。