本发明属于发酵
技术领域：
，涉及一种发酵制备苏氨酸的培养基。
背景技术：
：苏氨酸（threonine，简写为thr），学名2-氨基-3-羟基丁酸，属于脂肪族氨基酸，微甜，因结构与苏糖相似而得名，是构成人和动植物蛋白质的一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、营养强化剂，可以强化乳制品，具有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果。近年来，随着经济的发展，市场对苏氨酸需求持续稳定增长，是需求增长最快的氨基酸品种之一，特别是在化学及生化、食品添加剂、饲料添加剂等方面的用量增长迅速，大有取代色氨酸而成为除赖氨酸、蛋氨酸以外的发展最迅速的第三大氨基酸。随着氨基酸行业逐步发展，微生物发酵法成为苏氨酸生产最有前途的生产技术，在苏氨酸生产方面，微生物发酵法亦表现出潜在的优势，但在微生物发酵液制备过程中，存在发酵培养基成本高的缺陷。申请人之前的授权专利技术“cn201510168444，一种制备颗粒型苏氨酸的工艺”对黄色短杆菌进行了种子培养和发酵培养，其中，种子培养基为（1l）：葡萄糖6g，酵母膏3g，硫酸铵0.1g，磷酸二氢钾0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.02g，其余为水，ph值7.0；发酵培养基组分为：葡萄糖40g/l、玉米浆8g/l、酵母膏2g/l、甜菜碱1g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钾0.3g/l、硫酸镁0.2g/l、七水硫酸亚铁0.01g/l、硫酸锰0.01g/l，ph值7.0。上述培养基发酵效果较好，苏氨酸产量较高，但是酵母膏的价格较高，大规模发酵用量较大，如何较少或者替换酵母膏，以降低发酵成本是我们需要解决的技术问题。对于上述技术问题，申请人的研究成果“一种苏氨酸生产中豆粕酶解液代替酵母粉的方法”，采用复合菌酶解豆粕获得酶解液，可以替代培养基中价格较高的酵母膏组分，营养丰富，价格低廉，降低了企业成本；但是仍然需要一定的葡萄糖碳源以及其他无机盐。申请人之前的研究成果“颗粒苏氨酸的发酵制备工艺”，采用里氏木霉来酶解玉米秸秆破碎和玉米皮，通过添加无机盐组分，获得发酵培养基，可用于发酵产苏氨酸。在该研究成果的基础上，申请人继续对上述培养基进行了改进。北方地区是小麦的主要种植区，小麦秸秆和麦麸属于小麦生产和加工的副产物，含有大量的纤维素、木质素，还含有部分植物蛋白、碳水化合物以及无机盐等，经济利用价值较低，如何对其进行有效利用，以提高附加值，是现代农业需要解决的技术问题。技术实现要素：本发明的目的是解决现有技术中苏氨酸发酵成本较高的缺陷，提供了一种发酵制备苏氨酸的培养基。本发明是通过如下技术方案来实现的：一种发酵制备苏氨酸的培养基，其按照如下工艺制备而得：步骤1）制备复合物，步骤2）制备培养液，步骤3）制备发酵培养基。具体地，所述培养基按照如下工艺制备而得：步骤1）制备复合物：将小麦秸秆破碎，然后与麦麸混合，再粉碎至粒径为50目以上，然后添加到4-5倍重量的水中，以200rpm的搅拌速度边搅拌边升温至60℃，保温条件下，超声处理，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得复合物；步骤2）制备培养液：将绿色木霉种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照1-2:2-3的体积比混合，得到混合接种液，将混合接种液按照6-8%的接种量接入到含有步骤1）所得复合物的发酵罐中进行培养，温度为30-32℃，罐压为0.03-0.04mpa，风量为500l/h，培养时间为72-96h，得到培养液；步骤3）制备发酵培养基：超声处理培养液，再调整温度为55℃，加硫酸调整ph为6，分别加入溶菌酶和酸性蛋白酶，保温条件下，酶解12小时，然后通过过滤网进行过滤，过滤网孔径为5-50微米，去除絮状物，收集滤过液，然后100℃灭酶5min，自然冷却至室温，再添加相同体积的水，然后添加甜菜碱和甲醇，搅拌均匀，121℃蒸汽处理5min，自然冷却至室温，即得发酵培养基。优选地，所述溶菌酶的添加量为2万u：1l溶液，酸性蛋白酶的添加量为1万u：1l溶液。优选地，所述甜菜碱的终浓度为1-4g/l。优选地，所述甲醇的终浓度为100-200mg/l。优选地，所述小麦秸秆和麦麸的质量比为1:1。优选地，所述步骤1）中，超声时间为10-20min，超声功率为500w。优选地，所述步骤3）中，超声时间为20-30min，超声功率为500w。本发明实施方式中具体使用的菌株为绿色木霉atcc9275，地衣芽孢杆菌atcc12759；也可以使用同一种属中功能类似的其他菌株。本发明菌株种子液还可以按照现有技术记载的其他培养方式来制备，只需达到合适的接种浓度即可。与现有技术相比，本发明制备的培养基的优点主要包括以下几个方面：本发明通过对小麦秸秆和麦麸进行加热浸泡和超声处理，利用的超声波的空化作用，产生局部高压高温进行冲击，有助于纤维、蛋白以及碳水化合物的分离，更容易被菌株利用；绿色木霉可以产生纤维素酶，地衣芽孢杆菌可以产生蛋白酶和淀粉酶，本发明采用绿色木霉和地衣芽孢杆菌联合对小麦秸秆和麦麸处理物进行发酵酶解处理，然后酶解菌体，得到含有糖类化合物、菌体蛋白、多肽以及无机矿物质的培养基，供大肠杆菌使用，提高了发酵效率，并且利用了农业废弃物，降低了成本。本发明利用的超声波的空化作用，产生局部高压高温，对菌体细胞进行冲击，导致细胞变形和破裂，辅助溶菌酶进行破壁溶解，并且采用酸性蛋白酶进行辅助，提高了菌体蛋白的酶解效率。甜菜碱含有苏氨酸发酵所需要的生长因子，并且能够保护微生物避免受渗透压激变的影响，提高了微生物的成活率；合适浓度的甲醇对菌体没有伤害，可以提高菌体的通透性，提高苏氨酸的分泌水平。附图说明图1：甜菜碱添加量对苏氨酸产量的影响；图2：甲醇添加量对苏氨酸产量的影响。具体实施方式本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1一种发酵制备苏氨酸的培养基，其按照如下工艺制备而得：步骤1）将小麦秸秆破碎，然后与麦麸按照1：1的质量比混合，再粉碎至粒径为50目以上，然后添加到4倍重量的水中，以200rpm的搅拌速度边搅拌边升温至60℃，保温条件下，超声处理20min，超声功率为500w，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得复合物；步骤2）将绿色木霉种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照1:2的体积比混合，得到混合接种液，将混合接种液按照6%（占步骤1）所得复合物的体积比）的接种量接入到含有步骤1）所得复合物的发酵罐中进行培养，温度为30℃，罐压为0.03mpa，风量为500l/h，培养时间为72h，得到培养液；步骤3）超声处理培养液，超声时间为30min，超声功率为500w，再调整温度为55℃，加硫酸调整ph为6，分别加入溶菌酶和酸性蛋白酶，溶菌酶的添加量为2万u：1l溶液，酸性蛋白酶的添加量为1万u：1l溶液，保温条件下，酶解12小时，然后通过过滤网进行过滤，过滤网孔径为10微米，去除絮状物，收集滤过液，然后100℃灭酶5min，自然冷却至室温，再添加相同体积的水、终浓度为2g/l的甜菜碱和200mg/l的甲醇，搅拌均匀，121℃蒸汽处理5min，自然冷却至室温，即得发酵培养基。所述绿色木霉种子液的制备方法为：将绿色木霉划线接种在pda培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到pda液体培养基进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的绿色木霉种子液；所述地衣芽孢杆菌种子液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种到lb固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到lb液体培养基上进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的地衣芽孢杆菌种子液。实施例2一种发酵制备苏氨酸的培养基，其按照如下工艺制备而得：步骤1）将小麦秸秆破碎，然后与麦麸按照1：1的质量比混合，再粉碎至粒径为50目以上，然后添加到5倍重量的水中，以200rpm的搅拌速度边搅拌边升温至60℃，保温条件下，超声处理10min，超声功率为500w，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得复合物；步骤2）将绿色木霉种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照2:3的体积比混合，得到混合接种液，将混合接种液按照8%（占步骤1）所得复合物的体积比）的接种量接入到含有步骤1）所得复合物的发酵罐中进行培养，温度为30-32℃，罐压为0.04mpa，风量为500l/h，培养时间为96h，得到培养液；步骤3）超声处理培养液，超声时间为30min，超声功率为500w，再调整温度为55℃，加硫酸调整ph为6，分别加入溶菌酶和酸性蛋白酶，溶菌酶的添加量为2万u：1l溶液，酸性蛋白酶的添加量为1万u：1l溶液，保温条件下，酶解12小时，然后通过过滤网进行过滤，过滤网孔径为20微米，去除絮状物，收集滤过液，然后100℃灭酶5min，自然冷却至室温，再添加相同体积的水、终浓度为1g/l的甜菜碱和100mg/l的甲醇，搅拌均匀，121℃蒸汽处理5min，自然冷却至室温，即得发酵培养基。所述绿色木霉种子液的制备方法为：将绿色木霉划线接种在pda培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到pda液体培养基进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的绿色木霉种子液；所述地衣芽孢杆菌种子液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种到lb固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到lb液体培养基上进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的地衣芽孢杆菌种子液。实施例3本发明培养基中各主要成分含量：设置对照组来检验菌株对培养基主要成分含量的影响，对照组1：仅采用绿色木霉；对照组2：仅采用地衣芽孢杆菌。具体结果见表1：表1成分指标糖组分g/l大分子蛋白（5万da以上）小分子蛋白（5万da以下）钙离子mg/l钾离子mg/l二价铁离子mg/l实施例176.118.223.9135.3349.467.6对照组168.916.014.889.7213.543.1对照组236.519.211.468.3161.133.8如表1所示，与采用单一菌株的对照组1-2相比较，采用绿色木霉和地衣芽孢杆菌联合处理获得的培养基组分更丰富全面，符合大肠杆菌发酵产酸的使用标准。实施例4本发明培养基产酸性能测试：发酵工艺采用已知工艺：将大肠杆菌工程菌k12△dapa种子液（1×108cfu/ml）按照10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度32℃，罐压为0.05mpa，风量为600l/h，转速为100rpm，发酵时间培养为96h。采用对照组1-2（同实施例3）、实施例1的培养基来验证生物量和产苏氨酸量，具体结果见表2：表2成分指标生物量g/l（干重）产苏氨酸量g/100ml实施例123.113.3对照组117.211.2对照组215.610.4如表2所示，实施例1的生物量和产酸量均高于对照组1和2，其中，生物量分别提高了34.3%、48.1%，产酸量分别提高了18.7%、27.9%。实施例5甜菜碱和甲醇添加量对苏氨酸产量的影响：1、甜菜碱的浓度分别设置为0,0.5,1,2,4,8（g/l）；培养基制备方法同实施例1。如图1所示，随着甜菜碱浓度的增大，苏氨酸产量也在增加，待浓度增大到2g/l后，苏氨酸产量并没有明显增加；甜菜碱含有苏氨酸发酵所需要的生长因子，并且能够保护微生物避免受渗透压激变的影响，提高了微生物的成活率。2、甲醇浓度分别设置为0,50,100,200,400,800（mg/l）；培养基制备方法同实施例1。如图2所示，随着甲醇浓度的增大，苏氨酸产量也在增加，待浓度增大到200mg/l后，苏氨酸产量达到峰值，随后苏氨酸产量下降明显，合适浓度的甲醇可以提高菌体的通透性，提高苏氨酸的分泌水平，甲醇浓度过高对菌体有损伤。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。当前第1页12