本发明属于生物催化及生物制造领域，具体涉及一种利用固定化酵母细胞催化5-羟甲基糠醛选择性还原制备2,5-二羟甲基呋喃的方法。
背景技术：
近年来，生物基能源及平台化合物的开发和利用逐渐受到了学术界和工业界的关注。5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,hmf)是一种重要的生物基平台化合物(greenchem.,2010,12,539)，可以通过碳水化合物脱水制备得到。hmf分子有多个活性基团如羟基、醛基及碳碳双键，故易转化为各种高附加值化学品。2,5-二羟甲基呋喃(2,5-dihydroxymethylfuran,dhmf)是hmf分子中醛基选择性还原产物，在医药、高分子等领域具有重要的应用价值。例如，dhmf既可用于生产医药中间体及冠醚(acscatal.,2016,6,381；j.am.chem.soc.,1974,96,7159；jpn.kokai1973,73,763)，又可用于合成具有特定功能的生物基高分子材料，如具有形状记忆和自我修复功能的聚合物(macromolecules,2013,46,1794；acsappl.mater.interfaces,2014,6,2753)。
当前，化学催化仍是合成dhmf的主流方法(acscatal.,2018,8,2959)。尤其是，人们对基于金属催化剂的相关方法进行了较为广泛的研究，并取得了较好的进展。例如，alamillo等利用固定化在ceox载体上的钌催化hmf还原，在130℃下，反应2h后，底物完全转化，产物中dhmf含量为81％(greenchem.,2012,14,1413)。ohyama等利用al2o3担载的金纳米簇作为催化剂，在6.5mpa氢气、120℃下选择性将hmf还原为dhmf，产率达96％(rscadv.,2013,3,1033)。lin等报道了廉价的zro(oh)2能高效催化hmf还原为dhmf，在150℃下反应2.5h后，hmf转化率达94％，合成dhmf的选择性为89％(greenchem.,2016,18,1080)。尽管如此，但化学法仍存在反应条件不温和、选择性不佳、需要使用环境不友好的催化剂及有机溶剂等问题。近年来，生物催化无论是在工业上还是在学术上均受到了广泛的关注，因为该法能有效克服化学法的上述诸多问题。然而，与化学法相比，生物催化hmf还原合成dhmf研究仍处于起步阶段，仍存在诸多问题。此外，hmf对微生物具有较强的抑制和毒性作用，因此生物催化hmf还原仍颇具挑战。he等报道了重组菌escherichiacolicczu-k14对hmf具有较好的耐受性，并且能选择性催化hmf还原合成dhmf；当底物浓度为200mm时，反应72h后，目标产物产率达91％(bioresour.technol.,2018,247,1215)。然而，he等报道的催化体系过于复杂，需要添加大量的辅底物和其他添加剂(200mm葡萄糖，400mm木糖，250mm谷氨酸，1.5mmmg2+,40mmβ-环糊精及12.5mm溴化十六烷基三甲基铵)，这不仅大大降低了该工艺的经济性和实用性，而且加大了后续产物分离纯化的难度。同时，该生物催化工艺反应时间过长，需要72h。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种高活性、高底物耐受性、易重复利用的固定化生物催化剂；并基于该固定化生物催化剂，提供一种简单、高效、且高选择性合成dhmf的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种选择性合成2,5-二羟甲基呋喃方法，包括如下步骤：
(1)季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)sc1103经驯化、活化和固定化后，获得固定化细胞；所述酵母驯化方法为：将季也蒙毕赤酵母sc1103菌种接入含5-羟甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，将培养后的菌悬液接入新鲜的含5-羟甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，继续培养；随后，将上述菌悬液接入5-羟甲基糠醛浓度逐步提高的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中进行逐步驯化；驯化后的菌株保藏于马铃薯葡萄糖琼脂斜面；
(2)将上述固定化细胞加入含有5-羟甲基糠醛和辅底物的缓冲液中，在10～40℃、搅拌条件下反应，得到2,5-二羟甲基呋喃；所述辅底物中还原糖的摩尔浓度为5-羟甲基糠醛的摩尔浓度的0.3～1.0倍；所述5-羟甲基糠醛浓度为50～350mm。
优选地，步骤(1)所述酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基的组成为1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，余量为水。
优选地，步骤(1)所述酵母驯化方法为：将季也蒙毕赤酵母sc1103菌种接入含5mm5-羟甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，于30±5℃、搅拌下培养12±6h后，以2％～10％的接种量将该菌悬液接入新鲜的含5mm5-羟甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，30±5℃、搅拌下培养12±6h；随后，以2％～10％的接种量将上述菌悬液先后接入含10mm及15mm5-羟甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中进行逐步驯化。
优选地，步骤(1)活化方法为：将驯化后的季也蒙毕赤酵母sc1103菌种接入含有15mm5-羟甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，于30±5℃、搅拌下培养12±6h后，以2％～10％的接种量将该菌悬液接入新鲜的含15mm5-羟甲基糠醛的酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中，30±5℃、搅拌下培养12±6h，收集菌体细胞。
优选地，步骤(1)固定化方法为：将收集的菌体细胞按200～500mg(细胞湿重)/ml的浓度与2.5％(w/v)海藻酸钠溶液混合均匀；然后，滴入cacl2溶液中静置固化，用tris-hcl缓冲液洗涤即可(存于4℃冰箱备用)。
优选地，步骤(2)所述菌体浓度为20～60mg(细胞湿重)/ml缓冲液；所述5-羟甲基糠醛浓度为120～300mm。
优选地，步骤(2)反应温度为20～35℃，反应时间为5～48h。
优选地，步骤(2)所述辅底物为葡萄糖、木糖及水稻秸秆水解液。
优选地，步骤(2)所述辅底物中还原糖的摩尔浓度为5-羟甲基糠醛摩尔浓度的0.5～0.7倍。
优选地，步骤(2)所述缓冲液为乙酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液；所述缓冲液ph介于5.0～9.0，缓冲液的摩尔浓度为5-羟甲基糠醛摩尔浓度的0.5～2.0倍。
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：
1)利用固定化季也蒙毕赤酵母sc1103作为催化剂，不仅能克服了化学催化剂环境不友好的缺点，而且在反应结束后可以通过简单的离心回收生物催化剂，既可实现催化剂的重复利用，又易于产物的分离纯化。
2)本发明的固定化生物催化剂对底物具有高耐受性，能高效、高选择性催化高浓度底物还原合成目标产物，产物时空收率高。
3)本发明反应过程简单，易控、条件温和，活泼的hmf在反应过程中不易发生副反应，不仅提高产品品质高、降低了能耗，而且有利于简化后续目标产物的分离纯化工艺。
附图说明
图1为hmf(a)及dhmf(b)的结构图。
图2为固定化季也蒙毕赤酵母sc1103的形态图。
图3为反应液定量分析的液相色谱图(5-羟甲基糠酸、dhmf及hmf的保留时间分别为6.9、8.0及9.7min)。
具体实施方式
通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。
实施例1
季也蒙毕赤酵母(meyerozymaguilliermondii)sc1103驯化与活化：季也蒙毕赤酵母sc1103菌种接入含5mmhmf的酵母浸出粉胨葡萄糖(ypd)液体培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨及2％葡萄糖)中，于30℃、200r/min下培养12h后，以2％的接种量将上述菌悬液接入新鲜的含5mmhmf的ypd液体培养基中，30℃、200r/min下培养12h。随后，以2％的接种量将上述菌悬液先后接入含10及15mmhmf的ypd液体培养基中，采用类似的步骤逐步进行驯化。将上述驯化后的季也蒙毕赤酵母sc1103菌种接入含有15mmhmf的ypd液体培养基中，于30℃、200r/min下培养12h后，以2％的接种量将上述菌悬液接入新鲜的含15mmhmf的ypd液体培养基中，30℃、200r/min下培养12h，收集菌体细胞。
实施例2
季也蒙毕赤酵母sc1103固定化：称取2.5g海藻酸钠于三角瓶中，加入100ml蒸馏水，加热溶解。待溶液冷至室温后，按200mg/ml～500mg/ml(按细胞湿重计)的浓度加入经实施例1驯化及活化的细胞。用无菌注射器逐滴滴入0.2mcacl2溶液中静置固化4h后，tris-hcl缓冲液(100mm，ph7.2)洗涤3次，存于4℃冰箱备用。
实施例3
将50mmhmf和30mm葡萄糖加入4ml乙酸盐缓冲液(50mm,ph5.0)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。利用液相色谱监控反应(图3)。9h后，液相色谱分析表明dhmf产率为63％，选择性为99％。
实施例4
将50mmhmf和30mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph9.0)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。5h后，液相色谱分析表明dhmf产率为96％，选择性为99％。
实施例5
将50mmhmf和30mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于20℃及200r/min下反应。18h后，液相色谱分析表明dhmf产率为95％，选择性为99％。
实施例6
将50mmhmf和30mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于40℃及200r/min下反应。12h后，液相色谱分析表明dhmf产率为62％，选择性为99％。
实施例7
将200mmhmf和60mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。36h后，液相色谱分析表明dhmf产率为65％，选择性为99％。
实施例8
将200mmhmf和140mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。48h后，液相色谱分析表明dhmf产率为92％，选择性为99％。
实施例9
将200mmhmf和120mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。48h后，液相色谱分析表明dhmf产率为87％，选择性为99％。
实施例10
将200mmhmf和120mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按60mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。7h后，液相色谱分析表明dhmf产率为86％，选择性为99％。
实施例11
将300mmhmf和180mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按50mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。24h后，液相色谱分析表明dhmf产率为82％，选择性为99％。
实施例12
将350mmhmf和210mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按50mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。36h后，液相色谱分析表明dhmf产率为61％，选择性为99％。
实施例13
将400mmhmf和240mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按50mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。36h后，液相色谱分析表明dhmf产率为23％，选择性为99％。
实施例14
将200mmhmf和120mm葡萄糖加入20mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按50mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。7h后，液相色谱分析表明dhmf产率为85％，选择性为99％。dhmf的时空收率达3.1g/lh。反应后，过滤除去固定化细胞，然后加入过量nacl，使反应液形成nacl饱和溶液，然后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经无水na2so4干燥过夜，旋蒸除去溶剂后获得粗产物，为淡黄色固体。其萃取回收率达92％，纯度为90％。
实施例15
将50mmhmf和水稻秸秆水解液(含30mm还原糖)加入2mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按50mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。6h后，液相色谱分析表明dhmf产率为88％，选择性为89％。
实施例16
将50mmhmf和30mm木糖加入2mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按50mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。19h后，液相色谱分析表明dhmf产率为78％，选择性为77％。
实施例17
生物催化剂重复利用：将100mmhmf和60mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按50mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入实施例2制备的固定化季也蒙毕赤酵母sc1103细胞，于35℃及200r/min下反应。3h后，hmf浓度降至7.7mm，dhmf浓度达90.0mm，随后加入0.4mmolhmf和0.24mmol葡萄糖；再反应4h后，hmf浓度降至8.4mm，dhmf浓度达176mm，产率达88％，选择性为99％。通过过滤收集固定化细胞，并用tris-hcl(100mm,ph8.0)缓冲液洗涤3次后，加入新鲜反应中进行下一批次反应。在第2至第4批次中，dhmf产率为81-89％，选择性为99％。
对比例1
将50mmhmf和30mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph9.0)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加野生型季也蒙毕赤酵母sc1103游离细胞，于35℃及200r/min下反应。7h后，液相色谱分析表明dhmf产率为91％，选择性为99％。
对比例2
将200mmhmf和120mm葡萄糖加入4mltris-hcl缓冲液(100mm,ph8.0)，混合均匀后，按60mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加入野生型季也蒙毕赤酵母sc1103游离细胞，于35℃及200r/min下反应。60h后，液相色谱分析表明dhmf产率为45％，选择性为99％。
对比例3
将200mmhmf和200mm葡萄糖加入4ml磷酸盐缓冲液(100mm,ph7.2)，混合均匀后，按20mg(细胞湿重)/ml(缓冲液)的浓度加野生型季也蒙毕赤酵母sc1103游离细胞，于35℃及200r/min下反应。48h后，液相色谱分析表明dhmf产率为42％，选择性为99％。