本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种生产丁二酸的大肠杆菌发酵培养基及发酵工艺。
背景技术：
丁二酸又称作琥珀酸，是一种重要的二元羧酸，可以合成多种复杂有机物，在医药、食品、合成塑料、生物可降解材料等领域有广泛的应用。
目前化学制备丁二酸的生产工艺相对成熟，但存在能耗高、污染大、产率和纯度不高、依赖石化资源等缺点，抑制了其作为大宗化学品的发展潜力。
相比传统的化学合成方法，微生物发酵工艺利用可再生的生物质资源和co2为原料，不仅能耗低、污染小，而且开辟了温室气体co2利用的新途径，是一种高效低耗的新型“绿色化工”生产工艺，成为近年来的研究热点而受到国内外科研人员的关注。
但是，现有的丁二酸微生物发酵工艺生产成本高，是制约其发展的关键。发明人通过对丁二酸微生物发酵工艺进行研究发现，生产成本高低的关键在于发酵工段的制作成本，发酵工段制作成本占总生产成本的70％，因此发酵工段产酸、转化率和能耗的高低，是控制生产成本的关键。
目前，丁二酸微生物发酵工艺采用大肠杆菌作为发酵菌株，发酵菌株依次经过一级种子罐和二级种子罐中种子培养基的厌氧发酵培养后，进入到发酵罐中，经发酵罐中发酵培养基厌氧培养后产生大量菌体，同时分泌代谢产生丁二酸等产物，后经提取、干燥工序生产制得丁二酸，经发明人研究发现，现有技术中导致丁二酸生产成本居高不下的原因主要体现在以下两个方面：
第一方面：总发酵时间太长。一级种子罐发酵时间14h，二级种子罐发酵时间12h，发酵罐发酵时间84h，总发酵时间达到110h，能耗较高；
第二方面：发酵生产丁二酸能力为68g/l，糖酸转化率为94％，转化率较低，且产物浓度较低，导致后续提取成本增加。
因此，针对上述问题开发一种生产丁二酸的大肠杆菌发酵培养基及发酵工艺，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
技术实现要素：
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供一种生产丁二酸的大肠杆菌发酵培养基及发酵工艺，以解决现有丁二酸微生物发酵工艺总发酵时间长、糖酸转化率低以及产物浓度低的问题，从而降低丁二酸的生产成本。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种生产丁二酸的大肠杆菌发酵培养基，配方为：玉米浆干粉：1.4～1.6g/dl、酵母浸出物：0.5～2.5g/l、mgso4：0.2～1.4g/l、(nh4)2hpo4：2.5～4.5g/l、c5h11no2·hcl：0.6～2.0g/l、kcl：0.2～1.0g/l、cuso4：50～60mg/l、feso4·7h2o：35～50mg/l，ph值为6.5～6.8，用蒸馏水定容。
在本发明中，作为一种改进，发酵培养基配方为：玉米浆干粉：1.45～1.55g/dl、酵母浸出物：1～2g/l、mgso4：0.5～1g/l、(nh4)2hpo4：3～4g/l、c5h11no2·hcl：1.0～1.6g/l、kcl：0.4～0.8g/l、cuso4：53～58mg/l、feso4·7h2o：40～45mg/l，ph值为6.5～6.8，用蒸馏水定容。
在本发明中，作为一种改进，发酵培养基配方为：玉米浆干粉：1.5g/dl、酵母浸出物：1.5g/l、mgso4：0.8g/l、(nh4)2hpo4：3.5g/l、c5h11no2·hcl：1.3g/l、kcl：0.6g/l、cuso4：56mg/l、feso4·7h2o：42mg/l，ph值为6.5～6.8，用蒸馏水定容。
在本发明中，作为一种改进，所述酵母浸出物为酵母浸粉。
一种生产丁二酸的发酵工艺，以大肠杆菌为发酵菌株，采用一级种子罐、二级种子罐和发酵罐作为发酵设备，所述发酵菌株依序在所述一级种子罐和所述二级种子罐中进行好氧富集，再进入发酵罐中进行厌氧发酵，生产制得丁二酸，其中，发酵罐中采用上述发酵培养基。
在本发明中，作为一种改进，好氧富集阶段，一级种子罐和二级种子罐内种子培养基组分为：葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、kh2po4：1g/l、mgso4·7h2o：0.5g/l，ph值为6.8～7.2，用蒸馏水定容。
在本发明中，作为一种改进，好氧富集阶段，所述一级种子罐运行条件为：温度控制30～35℃、风量控制0.6～1.0vvm、do控制15～25％、搅拌转速300～350r/min、罐压0.05mpa。
在本发明中，作为一种改进，好氧富集阶段，所述二级种子罐运行条件为：温度控制30～35℃、风量控制0.8～1.5vvm、do控制10～15％、搅拌转速150～200r/min、罐压0.05mpa。
在本发明中，作为一种改进，厌氧发酵阶段，所述发酵罐运行条件为：温度控制30～35℃、搅拌转速为300～350r/min、罐压0.05mpa，充co22min。
在本发明中，作为一种改进，所述一级种子罐的风量控制为0.85vvm，所述二级种子罐的风量控制为1.1vvm。
采用了上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
(1)一级种子罐和二级种子罐均提高了菌株的活性和单位体积的菌体密度，缩短了培养时间。
现有技术中，一级种子罐和二级种子罐均对菌株进行厌氧培养，一级种子罐菌株培养条件为：风量控制0vvm，do控制2％，最大转速350r/min(1m3罐)；二级种子罐菌株培养条件为：风量控制0vvm，do控制2％，最大转速200r/min(20m3罐)。一级种子罐的最大菌体量为od5505.0，培养时间为14h；二级种子罐的最大菌体量为od55013，培养时间为12h；
本发明中，将现有技术中一级种子罐和二级种子罐对菌株的厌氧培养改为好氧富集，一级种子罐运行条件为：温度控制30～35℃、风量控制0.6～1.0vvm、do控制15～25％、搅拌转速300～350r/min、罐压0.05mpa；二级种子罐运行条件为：温度控制30～35℃、风量控制0.8～1.5vvm、do控制10～15％、搅拌转速150～200r/min、罐压0.05mpa。培养过程中，通过风量控制增加了罐体的供氧量，并实时监测控制罐中的do值，最终一级种子罐最大菌体量提高至od55016，培养时间缩短为11h；二级种子罐最大菌体量提高至od55022～24，培养时间缩短为6h。
因此本发明与现有技术相比，一级种子罐最大菌体量提高了od55011，培养时间缩短了3h；二级种子罐最大菌体量提高了od5509～11，培养时间缩短了6h。
(2)发酵罐提高了菌株的产酸速率及糖酸转化率。
现有技术中，发酵罐中的发酵培养基配方为：mgcl2：0.8g/l、(nh4)2hpo4：1.5g/l、nh4h2po4：2.3g/l、c5h11no2·hcl：1.3g/l、kcl：0.6g/l、cucl2：56mg/l、fecl3：42mg/l。此配方中nh4+过量，菌株增殖阶段抑制了菌株生长，且配方中含有渗透压较高的氯化物，促进菌株生长的生长因子和微量元素含量不足，导致大肠杆菌菌体生长速度较慢，菌体对数生长期不明显，菌体活性不够，发酵时间长达84h，发酵的产酸能力较低，仅为68g/l，糖酸转化率略低，为94％，如此导致后续丁二酸的提取成本增加，生产成本居高不下。
本发明中，发酵罐中的发酵培养基配方做了如下修改：
①配方中增加了玉米浆干粉和酵母浸出物两种组分；
②减掉多余的nh4h2po4，并将原有配方中的mgcl2、cucl2、fecl3分别改为mgso4、cuso4、feso4·7h2o；
③调整了配方中各个组分的配比。
由于玉米浆干粉中含有大量的蛋白质及微量元素，为菌株的发酵提供了丰富的碳源和氮源，另外还提供了丰富的生长因子；酵母浸出物富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分，在发酵过程中能够提供完全液化的营养成分，易于菌株充分吸收利用，其与与玉米浆干粉协同作用，利于提高菌株的生长量与代谢水平，提高菌株发酵单位，利用度高，发酵残留少，利于清洁生产和产物的提取纯化。
由于配方中减掉了nh4h2po4，调整了配方中nh4+含量，为菌株的增殖提供了适量的无机氮源，促进菌体代谢平衡；另外，配方中减少了cl-含量，降低了配方的渗透压，利于菌株对营养物质及微量元素的吸收代谢。
由于调整了配方中各个组分的配比，为菌株的生产提供了合理配比的碳源、氮源、无机盐类及生长因子，各种组分相互协同，共同促进了菌种的活性和菌种繁殖速度，最终使菌种进入发酵罐可以较快的分泌代谢产物。
因此本发明与现有技术相比，发酵罐由原来的发酵84h产酸浓度68g/l，转化率94％，提高至发酵40h产酸浓度72～90g/l，糖转化率95～99％。
综上所述，本发明与现有技术相比，总体发酵周期缩短41h，产物浓度提高4～22g/l，糖转化率提高1～5％。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
将大肠杆菌(e.coli)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入一级种子罐(1m3)中种子培养基中，温度控制31℃、风量控制0.85vvm、do控制25％、搅拌转速350r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵11h；
大肠杆菌(e.coli)在一级种子罐好氧发酵11h后，按照3％(v/v)接种量转入二级种子罐(20m3)中的种子培养基中，温度控制31℃、风量控制1.1vvm、do控制15％、搅拌转速200r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵6h；
一级种子罐和二级种子罐中种子培养基组分为：葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、kh2po4：1g/l、mgso4·7h2o：0.5g/l，加入5mol/lnaoh外源流调节培养基液的ph值至7.0，一级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至一级种子罐罐体容积的一半，二级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至二级种子罐罐体容积的一半，蛋白胨优选酵母蛋白胨。
大肠杆菌(e.coli)在二级种子罐好氧发酵6h后，按照7％(v/v)接种量转入发酵罐(150m3)中的发酵培养基中，温度控制31℃，搅拌转速为350r/min，罐压0.05mpa，充co22min，厌氧发酵40h，产生制得丁二酸；
发酵罐中的发酵培养基配方为：玉米浆干粉：1.5g/dl、酵母浸出物：1.5g/l、mgso4：0.8g/l、(nh4)2hpo4：3.5g/l、c5h11no2·hcl：1.3g/l、kcl：0.6g/l、cuso4：56mg/l、feso4·7h2o：42mg/l，加入5mol/lnaoh外源流调节发酵培养基液的ph值至6.8，用蒸馏水定容至发酵罐罐体容积的三分之一，酵母浸出物为酵母浸粉，优选酵母浸粉fm812。
实施例2：
本实施例与实施例1的不同仅在于：调整了发酵罐中发酵培养基的配方配比。
将大肠杆菌(e.coli)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入一级种子罐(1m3)中的种子培养基中，温度控制31℃、风量控制0.85vvm、do控制25％、搅拌转速350r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵11h；
大肠杆菌(e.coli)在一级种子罐好氧发酵11h后，按照3％(v/v)接种量转入二级种子罐(20m3)中的种子培养基中，温度控制31℃、风量控制1.1vvm、do控制15％、搅拌转速200r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵6h；
一级种子罐和二级种子罐中的种子培养基组分为：葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、kh2po4：1g/l、mgso4·7h2o：0.5g/l，加入5mol/lnaoh外源流调节培养基液的ph值至7.0，一级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至一级种子罐罐体容积的一半，二级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至二级种子罐罐体容积的一半，蛋白胨优选酵母蛋白胨。
大肠杆菌(e.coli)在二级种子罐好氧发酵6h后，按照7％(v/v)接种量转入发酵罐(150m3)中的发酵培养基中，温度控制31℃，搅拌转速为350r/min，罐压0.05mpa，充co22min，厌氧发酵40h，产生制得丁二酸；
发酵罐中的发酵培养基配方为：玉米浆干粉：1.4g/dl、酵母浸出物：0.5g/l、mgso4：0.2g/l、(nh4)2hpo4：2.5g/l、c5h11no2·hcl：0.6g/l、kcl：0.2g/l、cuso4：50mg/l、feso4·7h2o：35mg/l，加入5mol/lnaoh外源流调节发酵培养基液的ph值至6.2，用蒸馏水定容至发酵罐罐体容积的三分之一，酵母浸出物为酵母浸粉，优选酵母浸粉fm812。
实施例3：
本实施例与实施例1的不同仅在于：调整了发酵罐中发酵培养基的配方配比。
将大肠杆菌(e.coli)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入一级种子罐(1m3)中的种子培养基中，温度控制31℃、风量控制0.85vvm、do控制25％、搅拌转速350r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵11h；
大肠杆菌(e.coli)在一级种子罐好氧发酵11h后，按照3％(v/v)接种量转入二级种子罐(20m3)中的种子培养基中，温度控制31℃、风量控制1.1vvm、do控制15％、搅拌转速200r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵6h；
一级种子罐和二级种子罐中种子培养基为：葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、kh2po4：1g/l、mgso4·7h2o：0.5g/l，加入5mol/lnaoh外源流调节培养基液的ph值至7.0，一级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至一级种子罐罐体容积的一半，二级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至二级种子罐罐体容积的一半，蛋白胨优选酵母蛋白胨。
大肠杆菌(e.coli)在二级种子罐好氧发酵6h后，按照7％(v/v)接种量转入发酵罐(150m3)中的发酵培养基中，温度控制31℃，搅拌转速为350r/min，罐压0.05mpa，充co22min，厌氧发酵40h，产生制得丁二酸；
发酵罐中的发酵培养基配方为：玉米浆干粉：1.55g/dl、酵母浸出物：2g/l、mgso4：1g/l、(nh4)2hpo4：4g/l、c5h11no2·hcl：1.6g/l、kcl：0.8g/l、cuso4：58mg/l、feso4·7h2o：45mg/l，加入5mol/lnaoh外源流调节发酵培养基液的ph值至6.8，用蒸馏水定容至发酵罐罐体容积的三分之一，酵母浸出物为酵母浸粉，优选酵母浸粉fm812。
实施例4：
本实施例与实施例1的不同仅在于：调整了一级种子罐和二级种子罐的运行条件。
将大肠杆菌(e.coli)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入一级种子罐(1m3)中的种子培养基中，温度控制31℃、风量控制0.6vvm、do控制15％、搅拌转速300r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵11h；
大肠杆菌(e.coli)在一级种子罐好氧发酵11h后，按照3％(v/v)接种量转入二级种子罐(20m3)中的种子培养基中，温度控制31℃、风量控制0.8vvm、do控制10％、搅拌转速150r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵6h；
一级种子罐和二级种子罐中种子培养基组分为：葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、kh2po4：1g/l、mgso4·7h2o：0.5g/l，加入5mol/lnaoh外源流调节培养基液的ph值至6.8，一级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至一级种子罐罐体容积的一半，二级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至二级种子罐罐体容积的一半，蛋白胨优选酵母蛋白胨。
大肠杆菌(e.coli)在二级种子罐好氧发酵6h后，按照7％(v/v)接种量转入发酵罐(150m3)中的发酵培养基中，温度控制31℃，搅拌转速为350r/min，罐压0.05mpa，充co22min，厌氧发酵40h，产生制得丁二酸；
发酵罐中的发酵培养基配方为：玉米浆干粉：1.5g/dl、酵母浸出物：1.5g/l、mgso4：0.8g/l、(nh4)2hpo4：3.5g/l、c5h11no2·hcl：1.3g/l、kcl：0.6g/l、cuso4：56mg/l、feso4·7h2o：42mg/l，加入5mol/lnaoh外源流调节发酵培养基液的ph值至6.8，用蒸馏水定容至发酵罐罐体容积的三分之一，酵母浸出物为酵母浸粉，优选酵母浸粉fm812。
实施例5：
本实施例与实施例1的不同仅在于：调整了一级种子罐和二级种子罐的运行条件。
将大肠杆菌(e.coli)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入一级种子罐(1m3)中的种子培养基中，温度控制35℃、风量控制1.0vvm、do控制25％、搅拌转速350r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵11h；
大肠杆菌(e.coli)在一级种子罐好氧发酵11h后，按照3％(v/v)接种量转入二级种子罐(20m3)中的种子培养基中，温度控制35℃、风量控制1.5vvm、do控制15％、搅拌转速200r/min、罐压0.05mpa，好氧发酵6h；
一级种子罐和二级种子罐中种子培养基组分为：葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、kh2po4：1g/l、mgso4·7h2o：0.5g/l，加入5mol/lnaoh外源流调节培养基液的ph值至7.0，一级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至一级种子罐罐体容积的一半，二级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至二级种子罐罐体容积的一半，蛋白胨优选酵母蛋白胨。
大肠杆菌(e.coli)在二级种子罐好氧发酵6h后，按照7％(v/v)接种量转入发酵罐(150m3)中的发酵培养基中，温度控制31℃，搅拌转速为350r/min，罐压0.05mpa，充co22min，厌氧发酵40h，产生制得丁二酸；
发酵罐中的发酵培养基配方为：玉米浆干粉：1.5g/dl、酵母浸出物：1.5g/l、mgso4：0.8g/l、(nh4)2hpo4：3.5g/l、c5h11no2·hcl：1.3g/l、kcl：0.6g/l、cuso4：56mg/l、feso4·7h2o：42mg/l，加入5mol/lnaoh外源流调节发酵培养基液的ph值至6.8，用蒸馏水定容至发酵罐罐体容积的三分之一，酵母浸出物为酵母浸粉，优选酵母浸粉fm812。
对比实施例：
将大肠杆菌(e.coli)活化后，按照3％(v/v)接种量转接入一级种子罐(1m3)中种子培养基中，温度控制31℃、风量控制0vvm、do控制2％、搅拌转速350r/min(1m3罐)、罐压0.05mpa，厌氧发酵14h；
大肠杆菌(e.coli)在一级种子罐好氧发酵14h后，按照3％(v/v)接种量转入二级种子罐(20m3)中的种子培养基中，温度控制31℃、风量控制0vvm、do控制2％、搅拌转速200r/min、罐压0.05mpa，厌氧发酵12h；
一级种子罐和二级种子罐中种子培养基组分为：葡萄糖：20g/l、蛋白胨：10g/l、kh2po4：1g/l、mgso4·7h2o：0.5g/l，加入5mol/lnaoh外源流调节培养基液的ph值至7.0，一级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至一级种子罐罐体容积的一半，二级种子罐中的培养基用蒸馏水定容至二级种子罐罐体容积的一半。
大肠杆菌(e.coli)在二级种子罐厌氧发酵12h后，按照7％(v/v)接种量转入发酵罐(150m3)中的发酵培养基中，温度控制31℃，搅拌转速为350r/min，罐压0.05mpa，充co22min，厌氧发酵40h，产生制得丁二酸；
发酵罐中的发酵培养基配方为：mgcl2：0.8g/l、(nh4)2hpo4：1.5g/l、nh4h2po4：2.3g/l、c5h11no2·hcl：1.3g/l、kcl：0.6g/l、cucl2：56mg/l、fecl3：42mg/l，加入5mol/lnaoh外源流调节发酵培养基液的ph值至6.8，用蒸馏水定容至发酵罐罐体容积的三分之一。
针对上述实施例1-5及对比实施例，对最终的发酵液进行丁二酸浓度测定；通过检测葡萄糖浓度计算出糖酸转化率；对好氧发酵完成的一级种子罐和二级种子罐内的大肠杆菌进行od550值测定，以此来反应菌体量的大小；对总发酵时间进行统计。
丁二酸浓度检测方法：取10ml发酵液在2000r.p.m离心10min后，上清液释用比色分析法测定丁二酸的浓度；
葡萄糖浓度检测方法：取10ml发酵液在2000r.p.m离心10min后，上清液稀释20倍，用快速斐林式快速滴定法分析葡萄糖浓度；
od550值检测方法：取种子或发酵液稀释5倍(发酵液需加lml20％盐酸溶解caco3)，然后在可见光550nm处测定其吸光值。
检测结果如表1所示：
表1
表1结果表明：
(1)实施例1为本发明最佳；
(2)与现有技术相比，实施例1-5修改了发酵罐中发酵培养基的配方，新配方增加了菌种繁殖需要的生长因子和微量元素，促进了菌种的活性和菌种繁殖速度，最终使菌种进入发酵罐可以较快的分泌代谢产物；同时，修改原来一级种子罐和二级种子罐的运行工艺参数，由原来的厌氧发酵，修改为好氧发酵，通过发酵培养过程中增加供给氧，以及实时监测物料中do值，为菌种繁殖提供适量的氧，最终使菌种能够快速的繁殖，并且保持菌种的活性；
(3)通过对比本发明最佳实施方案-实施例1与现有技术可知：
①总体发酵周期缩短53h，发酵时间节省48.1％，因此，发酵罐建设投资费降低约50％，发酵电耗成本降低39.5％，发酵总成本降低11％；
②产酸浓度提高22g/l，因此丁二酸的提取成本降低6％；
③糖酸转化率提高5％，因此原料成本降低5％。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。