本发明涉及一种新型海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶的制备方法，属于生物化工领域。
背景技术：
水凝胶是通过化学或物理交联产生的具有三维网络结构的亲水性聚合物。它能吸收大量水溶胀并保持一定的形状。典型的水凝胶常常呈果冻状，柔软而且富有弹性。良好的吸水、保水及缓释特性使其在组织工程，伤口敷料和药物缓控释等领域都展现了良好的应用前景。
制备水凝胶的材料可分为天然高分子材料和化学合成高分子材料两大类，制备方法通常为物理交联和化学交联，其中物理交联指通过离子键、氢键及疏水键相互作用使分子相互缠结而形成的网络结构。物理交联在自然界中非常普遍，尤其在维持生物大分子（如蛋白质、酶及核酸等）的三维空间结构、参与很多生物学反应过程均发挥着非常重要的作用。物理交联常常是动态的、可逆的，对维护水凝胶的强度和韧性方面具有显著作用。化学交联是指运用化学交联剂或光聚合、辐射聚合等技术，引发共聚或缩聚反应产生共价键从而形成的共价交联网络。与物理交联方式相比，化学交联形成的水凝胶力学强度好但韧性差，并且会引入其他物质，因此其生物相容性不如物理交联方法制备的水凝胶。
聚乙烯醇是一种高分子亲水性聚合物，由于其良好的水溶性及生物相容性而被广泛研究用于生物医学领域。聚乙烯醇溶液在低温和室温下反复冷冻-解冻，形成由氢键为主要作用的物理交联，具有优异的机械性能。但该方法制备的水凝胶通常不具有大孔结构，限制了其应用范围。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种具有大孔结构、孔隙率高、生物相容性优异的新型海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶及其制备方法。
本发明实现过程如下：
一种海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶的制备方法：向聚乙烯醇溶液加入聚乙二醇，搅拌至聚乙二醇充分溶解，于室温静置，当混合溶液由澄清变浑浊时，加入纳米羟基磷灰石，搅拌，使纳米羟基磷灰石均匀地分散在混合溶液中，将混合好的溶液转移到模具中常温放置，通过循环冷冻/熔融法制备成水凝胶，用去离子水洗涤除去聚乙二醇和纳米羟基磷灰石以获得具有大孔结构的聚乙烯醇水凝胶。
上述大孔聚乙烯醇水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）将聚乙烯醇溶解在85-98℃去离子水，得到质量体积比浓度为8-12%的聚乙烯醇溶液；
（2）将质量体积比浓度为3-10%的聚乙二醇溶液加至步骤（1）的聚乙烯醇溶液中，在常温放置0.5-1h；
（3）待聚乙烯醇和聚乙二醇澄清混合溶液变浑浊时，将纳米羟基磷灰石以质量体积比浓度6-10%的含量溶于步骤（3）的聚乙烯醇和聚乙二醇混合溶液中；
（4）将步骤（3）混合溶液于常温放置1-1.5h；通过循环冷冻/熔融法制备成胶，其中冷冻温度为-18℃至-20℃，熔融温度为室温，循环次数3-7次；
（5）将制备好的水凝胶在去离子水中除去聚乙二醇和纳米羟基磷灰石，获得海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶。
上述步骤（1）中，聚乙烯醇的分子量为80,000-120,000da，醇解度大于99%。
上述步骤（1）中，将聚乙烯醇溶解在95℃去离子水中。
上述步骤（2）中，聚乙二醇的分子量为1000-4000da。
上述步骤（3）中，纳米羟基磷灰石的粒径为10-30nm。
本发明具有以下优点：本发明将乙二醇溶于聚乙烯醇溶液中后，通过降低温度使混合溶液发生相分离，然后向已发生相分离的混合溶液中添加纳米羟基磷灰石以稳定相分离体系。通过循环冷冻/熔融方法使水凝胶成型，洗涤出聚乙二醇和纳米羟基磷灰石，获得具有大孔结构的聚乙烯醇水凝胶。与不添加羟基磷灰石而仅通过循环冷冻/熔融方法制备的聚乙烯醇水凝胶相比，本发明所制备的水凝胶具有类似海绵的外观及弹性、三维贯通的多孔结构，高孔隙率（孔径为30~100μm），良好的机械性能及生物相容性。本发明中的海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶在烧烫伤敷料、止血等生物医用材料领域具有良好的应用潜力。
附图说明
图1为实例1聚乙烯醇水凝胶湿样外观图；
图2为实例1聚乙烯醇水凝胶湿样冷冻干燥后的样品图；
图3为实例1聚乙烯醇水凝胶样品的扫描电镜图；
图4为实例1聚乙烯醇水凝胶样品在去离子水中的溶胀率；
图5为实例1聚乙烯醇水凝胶样品在25℃下的保水率；
图6为实例1聚乙烯醇水凝胶样品的cck-8细胞毒性检验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明所涉及的以聚乙烯醇、聚乙二醇和纳米羟基磷灰石为原料，制备新型海绵状大孔聚乙烯醇水凝的制备方法，通过循环冷冻熔融过程获得，其中聚乙烯醇与聚乙二醇混合溶液通过冷却造成相分离，纳米羟基磷灰石的加入稳定了混合溶液的相分离，这种相分离是形成大孔水凝胶的原因。溶液通过循环冷冻/熔融过程形成具有三维结构的水凝胶，使用去离子水洗去纳米羟基磷灰石，聚乙二醇最终得到具有大孔、高孔隙率的水凝胶。具体制备方法由以下步骤实现：
步骤一：将聚乙烯醇溶解在95℃去离子水得到质量体积比浓度为8-12%的聚乙烯醇溶液；
步骤二：将聚乙二醇以质量体积比浓度3-10%的含量溶于步骤一的聚乙烯醇溶液；
步骤三：将步骤二的聚乙烯醇和聚乙二醇混合溶液于常温放置0.5-1h；
步骤四：待步骤三的聚乙烯醇和聚乙二醇澄清混合溶液变浑浊将纳米羟基磷灰石以质量体积比浓度6-10%的含量溶于步骤三的聚乙烯醇和聚乙二醇混合溶液中；
步骤五：将步骤四中混合好的溶液于常温放置1-1.5h；之后通过循环冷冻/熔融法制备成胶，其中冷冻温度为-18℃至-20℃，熔融温度室温，循环次数3-7次。制备好的混合凝胶在去离子水中除去聚乙二醇和纳米羟基磷灰石，获得所述的新型海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶。
步骤一中，聚乙烯醇分子量为80,000-120,000da，醇解度大于99%。
步骤二中，聚乙二醇的分子量为1000-4000da。
步骤四中，纳米羟基磷灰石的粒径为20nm。
步骤五中，通过循环冷冻/熔融法制备成胶，其中冷冻温度为-18℃至-20℃，熔融温度为室温，循环次数3-7次。
实施例1
步骤一：称量分子量为89000da的聚乙烯醇溶于20ml去离子水中，得到质量体积比浓度为10%的聚乙烯醇溶液，置于95℃水浴锅中搅拌使其充分溶解；
步骤二：向上述溶液中加入分子量为1500da的聚乙二醇使其充分混合均匀，形成均一溶液，使聚乙二醇质量体积比浓度为8%；
步骤三：将上述聚乙烯醇和聚乙二醇混合溶液于常温放置1h；
步骤四：待上述混合溶液变浑浊将纳米羟基磷灰石以质量体积比浓度10%的含量溶于该浑浊混合溶液中；
步骤五：将上述混匀的溶液于常温放置1h；之后通过循环冷冻/熔融法制备成胶，其中冷冻温度-20℃，熔融温度为室温，循环次数5次。制备好的混合凝胶在去离子水中除去聚乙二醇和纳米羟基磷灰石，获得所述的新型海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶。
实施例2
步骤一：称量分子量为98000da的聚乙烯醇溶于20ml去离子水中，得到质量分数为10%的聚乙烯醇溶液，置于95℃水浴锅中搅拌使其充分溶解；
步骤二：向上述溶液中加入分子量为1500da的聚乙二醇使其充分混合均匀，形成均一溶液，使聚乙二醇质量体积比浓度为8%；
步骤三：将上述聚乙烯醇和聚乙二醇混合溶液于常温放置1h；
步骤四：待上述混合溶液变浑浊将纳米羟基磷灰石以质量体积比浓度6%的含量溶于该浑浊混合溶液中；
步骤五：将上述混匀的溶液于常温放置1h；之后通过循环冷冻/熔融法制备成胶，其中冷冻温度-20℃，熔融温度为室温，循环次数5次。制备好的混合凝胶在去离子水中除去聚乙二醇和纳米羟基磷灰石，获得所述的新型海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶。
实施例3
步骤一：称量分子量为98000da的聚乙烯醇溶于20ml去离子水中，得到质量分数为8%的聚乙烯醇溶液，置于95℃水浴锅中搅拌使其充分溶解；
步骤二：向上述溶液中加入分子量为3000da聚乙二醇使其充分混合均匀，形成均一溶液，使聚乙二醇质量体积比浓度为4%；
步骤三：将上述聚乙烯醇和聚乙二醇混合溶液于常温放置1h；
步骤四：待上述混合溶液变浑浊将纳米羟基磷灰石以质量体积比浓度10%的含量溶于该浑浊混合溶液中；
步骤五：将上述混匀的溶液于常温放置1h；之后通过循环冷冻/熔融法制备成胶，其中冷冻温度-20℃，熔融温度为室温，循环次数5次。制备好的混合凝胶在去离子水中除去聚乙二醇和纳米羟基磷灰石，获得所述的新型海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶。
实施例4
步骤一：称量分子量为89000da的聚乙烯醇溶于20ml去离子水中，得到质量分数为8%的聚乙烯醇溶液，置于95℃水浴锅中搅拌使其充分溶解；
步骤二：向上述溶液中加入分子量为4000da聚乙二醇使其充分混合均匀，形成均一溶液，使聚乙二醇质量体积比浓度为3%；
步骤三：将上述聚乙烯醇和聚乙二醇混合溶液于常温放置1h；
步骤四：待上述混合溶液变浑浊将纳米羟基磷灰石以质量体积比浓度10%的含量溶于该浑浊混合溶液中；
步骤五：将上述混匀的溶液于常温放置1h；之后通过循环冷冻/熔融法制备成胶，其中冷冻温度-20℃，熔融温度为室温，循环次数5次。制备好的混合凝胶在去离子水中除去聚乙二醇和纳米羟基磷灰石，获得所述的新型海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶。
实施例5
步骤一：称量分子量为89000da聚乙烯醇溶于20ml去离子水中，得到质量分数为10%的聚乙烯醇溶液，置于95℃水浴锅中搅拌使其充分溶解；
步骤二：向上述溶液中加入分子量为1500da聚乙二醇使其充分混合均匀，形成均一溶液，使聚乙二醇质量体积比浓度为8%。
步骤三：上述均一溶液通过循环冷冻/熔融法制备成胶，其中冷冻温度-20℃，熔融温度为室温，循环次数5次。制备好的混合凝胶在去离子水中除去聚乙二醇，获得聚乙烯醇水凝胶。
上述实施例中，实施例5为对比实施例，对上述本发明的实施例1和实例5中制备的海绵状大孔聚乙烯醇水凝胶的各项性能参数进行测定，包括微观结构、溶胀性能、保水性能、细胞毒性，结果参见附图3-6。
1、本发明中的水凝胶湿样如图1所示，水凝胶类似于海绵状的半透明凝胶。
2、本发明中的水凝胶样品经冷冻干燥的形貌如图2所示，材料呈白色并且表面平整。
3、水凝胶微观结构检测。
将所制备的样品切成大约2µm的薄片，采用冷冻真空干燥进行干燥并在其表面喷金。在电子显微镜下进行水凝胶的微观结构研究。
如图3所示，由图可以看出，与实施例5相比实施例1中本发明水凝胶，其微观结果呈多孔状，孔径分布均匀且孔径大小在30-100µm之间。
4、水凝胶溶胀性能检测。
在37℃的去离子水中测定水凝胶的溶胀率。称取冷冻干燥后的水凝胶样品，其质量记为m0。浸入去离子水中并在设定时间点取出，用滤纸擦去表面水分后，称重并记为m1。(m1-m0)为水凝胶吸水后的质量，m0为水凝胶的干重，比值即为溶胀率。
如图4所示，与实施例5相比实施例1中本发明水凝胶，经过30min后就能达到溶胀平衡，溶胀率大约为1500%；而实例5中的水凝胶经过120min后才能达到溶胀平衡，溶胀率仅大约为500%。
5、水凝胶保水性能检测。
将达到溶胀平衡的湿水凝胶m0置于每个烧杯中，然后放置在37℃环境下测定重量随时间的变化。在预定的时间点，将水凝胶取出并称重m。m和m0的比值即为保水率。
如图5所示37℃下，两种水凝胶的保水率随时间的变化，经过48h保水率仍大于50%，并且实施例1和实施例5与对比实例差别不大。
6、水凝胶细胞毒性检测。
按照gb/t16886.5-2003（《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》）中规定的试验方法进行试验。
图6结果表明：采用l929细胞cck-8法检验材料浸提液的细胞毒性。培养五天后，细胞存活率大于90%，本实验结果表明：根据国家标准，材料毒性等级均为1级，属于可放心使用的生物医用材料。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。