本发明涉及昆虫细菌病害研究领域，具体涉及一种昆虫病原细菌分离及鉴定方法。
背景技术：
为研究昆虫病害原理，研究人员需要对昆虫病原细菌进行分离和鉴定。现有昆虫病原菌分离时通常使用全虫组织，无法避免昆虫肠道共生菌的影响，干扰病原菌的培养和鉴定结果。
中国专利cn200610054049.0“一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法”，提出了从感染昆虫的血淋巴中分离病原真菌的思路，物理上隔绝了病原菌中混杂昆虫肠道共生菌的可能，但该技术仍未解决以下问题：
一是该专利的目的是构建病原真菌基因文库以揭开虫生真菌侵染机制，其提供的病原菌分离方法需酶解去除昆虫组织，还需经pcr和rt-pcr监控昆虫组织去除效果，耗费人力物力；
二是该方法中分离获得的病原菌由于经过酶解处理，改变了自然生理状态，主要用作提取病原真菌的dna和mrna，分离得到的病原真菌继续培养以获得病原菌纯培养物的效果不确定，尤其对于细菌的适用性更不乐观；
三是由于革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁结构不同，革兰氏阳性菌主要成分是肽聚糖，革兰氏阴性菌细胞壁较薄，除肽聚糖外还有脂多糖、磷脂双分子层与脂蛋白，因此二者需要采取不同的总dna抽提方法，增加了昆虫病原细菌提取和鉴定步骤的工作量和劳动成本，不便于病原菌大规模鉴定，在该专利方法中并未针对上述不同之处提及优化方式。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种昆虫病原细菌分离及鉴定方法，可以避免肠道共生菌的影响，同时适用于革兰氏阳性和阴性病原菌的分离鉴定，提高分离鉴定步骤的工作效率。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种昆虫病原细菌分离及鉴定方法，包括以下步骤：
s1、对带有病原细菌的昆虫体表消毒后提取其血淋巴，稀释至合适浓度涂布lb平板培养，挑取单菌落得到病原菌纯培养，转接lb液体培养基，取菌体涂玻片，简单染色后油镜观察分离株形态学特征；
s2、依次使用溶菌酶和sds处理所述步骤s1中培养获得的菌体，破碎菌体后，分离纯化总dna；
s3、扩增分离株16srdna全长，并进行测序聚类分析，结合分离株形态学特征，确定分离株种属。
在上述技术方案的基础上，所述步骤s1具体包括：
选取刚死或将死的感染昆虫，经75％酒精体表消毒、无菌水冲洗后，吸取其体腔血淋巴，经10倍磷酸缓冲盐溶液系列稀释后，涂布至lb平板；在28℃下培养过夜后，挑取单菌落，接种至液体lb培养基至od600值0.8左右。涂片，染色，油镜观察内容
在上述技术方案的基础上，所述步骤s2具体包括：
s201、取1ml菌液，在12000rpm转速下离心1min，去上清；
s202、加入400mlste缓冲液打散，12000rpm转速下离心2min，吸净上清液；
s203、加150μl溶液i打散，加入10μl溶菌酶(50-100mg/ml)，冰上静置3-4hr或者过夜；
s204、加300μl2％sds，混匀，55-60℃，震荡温育30-60min，直到溶液清亮；
s205、加入150μl5mol/l的nacl混匀，室温或冰上静置5-10min；
s206、加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提两次，12000rpm转速下离心5min，取上清；
s207、加入两倍体积的无水乙醇沉淀，在-20℃下保存2-3小时或者过夜后，在12000rpm转速下离心15min弃上清；
s208、用70％乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm转速下离心10min，室温干燥；
s209、将沉淀溶于20-50μl重蒸水或10mg/ml核糖核酸酶或te缓冲液中，在-20℃保存。
在上述技术方案的基础上，所述步骤s3具体包括：分离菌株dna稀释50-100倍后作为模板，使用通用引物27f和1492r扩增16srdna，pcr产物送样测序，测序引物包括27f、1492r、515f、926r；将测序结果与已有16srdna数据比对确定分离株种属。
在上述技术方案的基础上，当27f或1492r一端测序出现双峰时，选择515f或者926r补充测序：
515f：5’-gtgccagctgccgcggtaa-3’；
926r：5’-ccgtcaattcttttcagttt-3’。
在上述技术方案的基础上，所述步骤s3中，使用以下通用引物扩增16srdna：
27f：5’-agagtttgatcctggctca-3’；
1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’。
在上述技术方案的基础上，所述磷酸缓冲盐溶液由氯化钠0.79g，氯化钾0.2g，磷酸氢钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g加1l去离子水溶解，用5mol/l氢氧化钠调节ph值至7.2-7.4后，在121℃下灭菌20分钟制成；所述ste缓冲液由0.1mol/l氯化钠溶液，10mmol/l、ph值为8.0的tris-hcl缓冲液和1mmol/l、ph值为8.0的edta在121℃下灭菌30分钟制成；所述溶液i由1mol/l、ph值为8.0的tris-hcl缓冲液，0.5mol/l、ph值为8.0的edta和50mmol/l葡萄糖经0.25μm滤膜过滤除菌后获得。
在上述技术方案的基础上，所述带有病原细菌的昆虫包括家蚕、蜂、棉铃虫和尺蠖。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的昆虫病原细菌分离及鉴定方法针对革兰氏阳性菌主要成分是肽聚糖，革兰氏阴性菌细胞壁较薄，除肽聚糖外还有还有脂多糖、磷脂双分子层与脂蛋白的实际特点，采用溶菌酶和sds相结合破碎细胞壁，优化现有dna抽提法关键步骤及试剂使用顺序、浓度和作用时间，适用于蜂、棉铃虫、尺蠖、家蚕等便于获取血淋巴的昆虫病原细菌分离和总dna抽提。
(2)本发明的昆虫病原细菌分离及鉴定方法获得的分离株中病原菌比例高，可以避免肠道共生菌的影响，同时适用于革兰氏阳性和阴性病原菌，提高相关步骤的工作效率，所用引物通用性强，扩增、测序效果稳定。
(3)本发明的昆虫病原细菌分离及鉴定方法可直接从自然感染昆虫中获取未知病原菌，利用昆虫组织无法在lb平板上生长特点，分离鉴定过程中无需去除昆虫组织、pcr或rt-pcr监控组织去除效果等步骤，分离鉴定步骤不受昆虫组织干扰，且所得分离株纯培养物可作为资源培养保藏，继续进行深入研究和开发利用。
附图说明
图1为本发明实施例中经油镜观察获得的革兰氏阳性菌yn29分离株菌体形态；
图2为本发明实施例中经油镜观察获得的革兰氏阴性菌ga12分离株菌体形态；
图3为本发明实施例中分离株16srdna的pcr产物琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明实施例中使用mega4.0软件邻接法构建的系统发育树；
图5为本发明实施例中lb平板培养得到分离株单菌落形态图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
参见图1所示，本发明实施例提供一种昆虫病原细菌分离及鉴定方法，包括以下步骤：
s1、对带有病原细菌的昆虫消毒后提取其血淋巴，在lb(luria-bertani培养基)平板上培养病原菌液；在一个实施例中，该步骤具体包括：选取刚死或将死的感染昆虫，经75％酒精体表消毒、无菌水冲洗后，吸取其体腔血淋巴，经10倍磷酸缓冲盐溶液系列稀释后，涂布至lb平板；在28℃下培养过夜后，挑取单菌落，接种至液体lb培养基至od600值0.8左右，取菌体涂玻片，简单染色后油镜观察分离株形态学特征。
s2、依次使用溶菌酶和sds(十二烷基硫酸钠)处理所述步骤s1中培养获得的菌体，抽酚纯化分离株总dna，具体步骤包括：
s201、取1ml菌液，在12000rpm转速下离心1min，去上清；
s202、加入400mlste缓冲液打散，12000rpm转速下离心2min，吸净上清液；
s203、加150μl溶液i打散，加入10μl溶菌酶(50-100mg/ml)，冰上静置3-4hr或者过夜；
s204、加300μl2％sds，混匀，55-60℃，震荡温育30-60min，直到溶液清亮；
s205、加入150μl5mol/l的nacl混匀，室温或冰上静置5-10min；
s206、加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液抽提两次，12000rpm转速下离心5min，取上清；
s207、加入两倍体积的无水乙醇沉淀，在-20℃下保存2-3小时或者过夜后，在12000rpm转速下离心15min弃上清；
s208、用70％乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm转速下离心10min，室温干燥；
s209、将沉淀溶于20-50μl重蒸水或10mg/ml核糖核酸酶或te缓冲液中，在-20℃环境中保存。
s3、扩增分离株16srdna全长，并进行测序聚类分析，结合分离株形态学特征，确定分离株种属，具体包括：分离菌株dna稀释50-100倍后作为模板，使用通用引物27f和1492r扩增16srdna，通用引物序列为：
27f：5’-agagtttgatcctggctca-3’；
1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’。
随后进行pcr产物送样测序，测序引物包括27f、1492r、515f、926r，具体使用27f、1492r测序，仅当27f或1492r一端测序出现双峰时，分别选择926r或者515f补充测序，若27f、1492r双端测序出现双峰，将所得分离物重新涂平板、划线分离挑取单菌落；将测序结果与已有16srdna数据比对确定分离株种属。
本发明昆虫病原细菌分离及鉴定方法中使用的各试剂配置组份和方法如下：
lb培养基，由蛋白胨10g，酵母粉10g，酵母粉5g，氯化钠10g；用重蒸馏水定容至1l，用5mol/l氢氧化钠调节ph值至7.0-7.2，在121℃下灭菌20分钟，用于菌株的活化和增殖。固体lb培养基，在以上的基础上另加入1.5％-2％的琼脂粉。
棉铃虫饲料，由酵母粉4.0g，黄豆粉7g，维生素c0.5g，琼脂条1.5g，36％醋酸1.25ml和水100ml组成。
磷酸缓冲盐溶液，由氯化钠0.79g，氯化钾0.2g，磷酸氢钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g加1l去离子水溶解，用5mol/l氢氧化钠调节ph值至7.2-7.4后，在121℃下灭菌20分钟制成；
ste缓冲液，由0.1mol/l氯化钠溶液，10mmol/l、ph值为8.0的tris-hcl缓冲液和1mmol/l、ph值为8.0的edta在121℃下灭菌30分钟制成；
溶液i，由1mol/l、ph值为8.0的tris-hcl缓冲液，0.5mol/l、ph值为8.0的edta和50mmol/l葡萄糖经0.25μm滤膜过滤除菌后获得。
本发明昆虫病原细菌分离及鉴定方法适用的带有病原细菌的昆虫包括家蚕、蜂、棉铃虫和尺蠖等体型较大、便于血淋巴提取的昆虫。
下面通过实验例具体说明本发明昆虫病原细菌分离及鉴定方法的过程和效果：
实验例1棉铃虫病原菌的分离验证
1、实验材料
棉铃虫，由湖北省农业科学院生物农药工程研究中心提供；
2、实验试剂
lb培养基、固体lb培养基、棉铃虫饲料、磷酸缓冲盐溶液、ste缓冲液、溶液i。
3、实验步骤
3.1棉铃虫病原菌分离验证
取自然感染的病棉铃虫，75％酒精体表消毒，无菌水冲洗后装入无菌离心管，无菌操作下挑取棉铃虫体腔血淋巴，pbs做10倍系列稀释，涂布lb平板，28℃培养过夜，挑取单菌落，接种至液体lb培养基至od600值0.8左右。菌体涂片简单染色后，油镜观察所得分离株菌体形态，及分离株是否为纯培养，观察结果如图1、图2所示，lb平板培养得到分离株单菌落形态如图5所示。
棉铃虫病原菌分离验证参照柯赫法则，即液体培养分离株穿刺感染5龄第3d健康棉铃虫，处理3组每组20只棉铃虫，无菌pbs溶液注射组作为对照，25℃常规饲养，记录72h死亡率及临床病状。再次分离感染病棉铃虫体内病原菌，与自然感染昆虫中得到的分离株比对，镜检及16srdna测序分析应一致。分离株16srdna的pcr产物琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。
3.2总dna抽提
s201、取1ml菌液，在12000rpm转速下离心1min，去上清；
s202、加入400mlste缓冲液打散，12000rpm转速下离心2min，吸净上清液；
s203、加150μl溶液i打散，加入10μl溶菌酶(50-100mg/ml)，冰上静置3-4hr或者过夜；
s204、加300μl2％sds，混匀，55-60℃，震荡温育30-60min，直到溶液清亮；
s205、加入150μl5mol/l的nacl混匀，室温或冰上静置5-10min；
s206、加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液抽提两次，12000rpm转速下离心5min，取上清，如离心后上清浑浊，需适当加大苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液体积；
s207、加入两倍体积的无水乙醇沉淀，在-20℃下保存2-3小时或者过夜后，在12000rpm转速下离心15min弃上清；
s208、用70％乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm转速下离心10min，室温干燥；
s209、将沉淀溶于20-50μl重蒸水或10mg/ml核糖核酸酶或te缓冲液中，在-20℃环境中保存。
3.316srdna基因序列分析
分离菌株dna稀释50-100倍后作为模板，通用引物27f和1492r扩增16srdna，pcr产物送样测序，测序引物为27f、1492r，当27f或1492r一端测序出现双峰时，选择515f或者926r补充测序。测序结果与已有16srdna数据比对确定分离株种属。
其中，
515f：5’-gtgccagctgccgcggtaa-3’；
926r：5’-ccgtcaattcttttcagttt-3’。
实验例2尺蠖病原菌的分离验证
本实施例与实施例1基本相同，区别在于使用材料为尺蠖。
本实施例中使用尺蠖，在湖北省农业科学院经济作物研究所桑园采集。
为验证本专利昆虫病原细菌分离及鉴定方法可同时适应革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的分离鉴定需求，分别就典型的革兰氏阳性菌yn29和革兰氏阴性菌ga12进行鉴定，以验证本发明昆虫病原细菌分离方法的效果。
实验例3分离病原菌(yn29)的鉴定验证
将实施例1中获取的测序结果使用seqman软件拼接矫正不一致碱基，所得16srdna序列与rdp(http://rdp.cme.msu.edu/)及greengenes(http://greengenes.secondgenome.com)数据库比对，结果显示该分离株与bacillusthuringiensisi和b.cereus亲缘关系最近，加入b.thuringiensisi和b.cereus标准菌株序列(www.dsmz.de/home.html)，clustalw软件比对所有分离株及标准菌株序列，mega4.0软件邻接法(neighbor-joining，nj，bootstrap1000)构建系统发育树，具体结果如图4所示。
实验例4分离病原菌(ga12)的鉴定验证
本实施例与实施例3基本相同，区别在于分离菌株不同。其结果显示，本实施例昆虫病原细菌分离方法同样可获取革兰氏阴性菌ga12进行鉴定。
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。