本发明属于乌贼物种鉴定技术领域，尤其涉及一种可用于曼氏无针乌贼、虎斑乌贼及剑尖枪乌贼种间鉴定的分子标记及应用。
背景技术：
曼氏无针乌贼(sepiellamaindroni)属于头足纲，乌贼目，乌贼科，无针乌贼属，广泛分布于俄罗斯远东海、日本濑户内海、朝鲜西南海岸和我国邻近海域，为广温广布头足类品种在我国的四大海域均有一定分布；虎斑乌贼(sepiapharaonis)隶属软体动物门(mollusca)、乌贼目(sepioidea)、乌贼科(sepiidae)、乌贼属(sepia)，分布于印度太平洋的热带海域，自近岸至水深100m的水域中均有发现；剑尖枪乌贼(loligoedulis)俗称红鱿鱼，头足纲，枪形目，枪乌贼科，浅海性暖水种，分布于东海、南海、日本群岛南部近海，菲律宾群岛至澳大利亚北部海域。东海主要分布在大陆架外缘海域，是20世纪90年代初新开发的头足类资源之一，年产量约(2～3)×104t，是重要的水产品。三种乌贼同属于头足纲，栖息海域也倾轧交联，三种乌贼均有营养丰富、美味可口，广受消费者喜爱。目前，水产品市场上售卖的乌贼多以未冰冻的新鲜死乌贼产品方式和加工方式进行售卖，因为乌贼具有应激喷墨的习性而导致市场上售卖的乌贼因带墨而模糊不清，且死亡后的乌贼种间表型差异缩小，常见的形态学特点差异消失；且加工过后，肢体完整性较差，无法依据局部来进行整体判别。总体而言，种属水平的形态分类鉴定难度较大，并且易产生很多分歧，单靠形态学难以区分。因此，选用有效的方法来区分曼氏无针乌贼、虎斑乌贼和剑尖枪乌贼具有重要意义；近年来，随着分子生物学的发展，利用分子生物学手段来鉴定物种已经逐渐成为一种趋势，并为大多数的生物学家所接受。自美国学者lander于1996年提出继rflp、ssr的第三代新型分子标记技术——snp以来，snp的检测和分型已成为遗传学研究的关键技术，snp指的是某种生物不同个体dna序列中单个核苷酸点突变产生的多态性，包括置换、颠换、插入或缺失引起的多态现象。高分辨率熔解曲线法是基于不同核酸物理性质的差异，将荧光染料加入pcr反应体系，当含荧光染料的dna解旋后，便可收集荧光信息形成熔解曲线。当dna序列中某个碱基发生变化，熔解曲线便会发生相应的改变，便可通过软件对遗传信息进行分析，其具有高效、精确、高通量、低成本等优点。目前，hrm技术已被应用于已知基因型的鉴定，突变筛查，dna甲基化分析，微生物的分子分型与鉴定和rna编辑等领域，是分子诊断中的热门技术。
技术实现要素：
本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种可用于曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼种间鉴定的分子标记。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述分子标记来区分曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼种间鉴定的应用。
本发明所要解决的又一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种利用上述分子标记来区分曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼种间鉴定的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该可用于曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼种间鉴定的snp分子标记，其特征在于：所述snp分子标记的
正向引物f1为5'caggaacagtttccactacccctac3'；
反向引物f2为5'cgcgtacatatcgcccgtc3'。
本发明为解决第二个技术问题提供一种利用上述snp分子标记在基于高分辩率溶解曲线鉴定曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼中的应用。
进一步地，所述曼氏无针乌贼目标扩增片段中的snp为：cgcgtacatatcgcccgtcgctcttgttgataaaataagataagtcgtaacatagtaggggtagtggaaactgttcctg。
进一步地，所述虎斑乌贼目标扩增片段中的snp为：cgcgtacatatcgcccgtcgctcttgttggtaaaataagataagtcgtaacatagtaggggtagtggaaactgttcctg。
进一步地，所述剑尖枪乌贼目标扩增片段中的snp为：cgcgtacatatcgcccgtcgctcttgttggaagataagataagtcgtaacatagtaggggtagtggaaactgttcctg。
本发明为解决第三个技术问题提供一种基于高分辨率溶解曲线鉴定曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼的方法，其特征在于：以曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼基因组dna为模板，根据曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼的基因组的标签序列设计引物进行pcr扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的tm值差异进而区分；以待鉴定乌贼基因组dna为模板，根据乌贼的基因序列设计引物进行pcr扩增，利用扩增产物在高分辨率熔解曲线中的tm值差异进而区分乌贼相近物种。
进一步地，通过上述扩增获得的pcr产物，添加核酸饱和染料后变性处理，冷却至室温进行hrm测定。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、方法简单易行；不需要测序，直接通过扩增片段的tm值来反应dna水平上的区别而区分不同物种；
2、结果明确直观；不用进行序列比对等步骤，不同物种之间dna水平的差异以直观的峰图形式表现出来，极易区分辨别；
3、准确有效；本发明鉴定方法采用高分辨率熔解曲线(hrm)具有分辨单个核苷酸差异的能力，能够准确反映dna水平上的差异，使得鉴定结果准确可靠，与测序结果相比较准确率为100％；
4、应用性广泛；与测序不同，不需要将待鉴定的所有个体一一测序分析，本发明中一组引物可以在无限多同类个体上进行物种鉴定而不需要重新设计引物；本发明通过提供鉴别曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼的snp引物，通过hrm技术成功对三种乌贼进行了基因分型，从分子水平探索了曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼的基因片段序列差异，建立了曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼的分子鉴别方法，其次，本发明为一个开放体系，应用范围广泛；不仅可用于特定几种乌贼近缘物种的鉴定，只要是基于dna水平上的差异能够区分的乌贼物种均可以利用该方法来鉴定。
附图说明
图1为本发明实施例提供的乌贼属乌贼近缘物种鉴定高分辨率熔解曲线图(其中横坐标为温度℃)，纵坐标为荧光强度的对数值；每条曲线的最高点所对应的横坐标即为该曲线对应的pcr产物的tm值)；
图2为本发明实施例提供的乌贼属乌贼近缘物种鉴定高分辨率熔解的标准化曲线；
图3为本发明实施例提供的乌贼属乌贼近缘物种在标准化和不同温度情况下的熔解曲线峰。
具体实施方式
以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
本发明在依靠核酸序列区别而进行物种鉴定的过程中引入高分辨率熔解曲线方法，仅用一对pcr引物将不同物种在dna水平上的差异转化成更直观的熔解曲线。
其步骤为：
a、dna提取
采用传统的苯酚-氯仿-异戊醇法提取基因组dna，琼脂糖凝胶电泳检测dna样品的质量，nanodrop2000(thermoscientific，usa)测定dna原液质量和浓度，并稀释成50ng/ul的浓度待用。
b、物种鉴定依据序列的获得和序列比对分析
通过从ncbi数据库中获得虎斑乌贼与拟目乌贼的线粒体序列全长，使用alignx软件进行序列比对，寻找两种乌贼中存在的碱基差异；从含有snp位点序列中，选取符合引物设计的序列使用premier5.0进行snp引物设计；
c、引物设计与筛选
引物设计应满足以下条件：目标扩增序列在50bp-150bp之间，为使熔解温度不同，序列之间存在gc碱基含量的差异；退火温度(tm)应在50℃-60℃之间；正反引物之间应尽量避免错配，发夹结构和引物二聚体；引物由上海生工工程有限责任公司合成。随机选择5个所对应的乌贼dna样本为模板，使用使用琼脂糖凝胶电泳技术对引物进行初步筛选，选择能扩增出明亮，单一条带的引物进行hrm分析。
d、pcr扩增及高分辨率熔解曲线(hrm)分析
以待鉴定目标乌贼类的基因组dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增；pcr体系为以乌贼基因组dna为模板，调节dna浓度至50ng/μl，将筛选后的引物用于目标片段的hrm分析。在light
pcr体系：20μl1×light
pcr扩增程序为：95℃(预变性10min)，95℃(变性30sec)，tm(复性30sec)，72℃(延伸30sec)变性、复性、延伸三步共循环45次后，溶解曲线荧光采集：95℃变性30seconds，65℃退火30seconds，95℃升温30seconds。
pcr扩增结束后，产物直接在light
实施例1
曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与剑尖枪乌贼的鉴定：
a、物种鉴定依据序列的获得：通过从ncbi数据库中获得上述乌贼线粒体序列全长，使用alignx软件进行序列比对，寻找三种乌贼中存在的碱基差异片段，作为物种鉴定依据序列；
b、引物设计：在上述乌贼属线粒体全长序列中选择能够明显区分目标物种的序列区域，利用primerpremier5软件在该区域内设计pcr扩增引物，引物扩增产物在不同物种间应有明显tm值差异，主要体现为c、t含量不同。
正向引物f1为：5'caggaacagtttccactacccctac3'；
反向引物f2为：5'cgcgtacatatcgcccgtc3'。
c、pcr扩增：以待鉴定乌贼样本的基因组dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增。pcr扩增程序依照：94℃(预变性10min)，94℃(变性15sec)，53℃tm(复性15sec)，72℃(延伸30sec)变性、复性、延伸三步共循环35次后72℃后延伸5min，4℃(降温)结束。
d、高分辨率熔解曲线(hrm)分析：上述产物直接在light
实验结果如下：
由图1可见：熔解曲线分别聚成3束，分别呈现3种不同的tm值，对应样品中的野生曼式无针乌贼、虎斑乌贼及东海剑尖枪乌贼；类型a为曼氏无针乌贼，其tm值为80.67℃，类型b为虎斑乌贼，其tm值为81.48℃，类型c为东海剑尖枪乌贼，其tm值为82.45℃，不同类型的熔解曲线之间区分清晰、明显，明了的显示出虎斑乌贼与东海剑尖枪乌贼之间的tm值微小差异，与曼氏无针乌贼相隔较远，这与王万超在乌贼系统进化发育中关于三种乌贼亲缘关系的相关研究中的研究结果一致，也体现了hrm分析的灵敏性和准确性。
图2为经light
图3为标准化和不同温度情况下熔解曲线峰图两者以东海尖枪乌贼为参照基线，曼氏无针乌贼与虎斑乌贼均分布在东海剑尖枪乌贼两侧，图2图3均是为了更好的反映曼氏无针乌贼、虎斑乌贼及东海剑尖枪乌贼tm值差异引起的峰图变化。
e、测序验证
对于能明显分型的snp位点，随机选择每种基因型曲线对应的pcr产物进行测序，对各种基因型的测序结果进行比对分析，观察彼此之间的碱基组成差异，如下表1。
表1序列测序与比对结果：显示出存在于三种乌贼属中曼氏无针乌贼、虎斑乌贼与东海剑尖枪乌贼目标扩增片段中的snps，分别为seq1、seq2和seq3，如下表。
表1
同时，观察彼此之间的碱基组成差异，如下表2，显示出存在于曼氏无针乌贼与虎斑乌贼目标扩增片段中的snps，在这79bp的差异片段中，共检测出1个snp位点，为碱基转换位点。
表2
同时，观察彼此之间的碱基组成差异，如下表3，显示出存在于曼氏无针乌贼与虎斑乌贼目标扩增片段中的snps，在这79bp的差异片段中，共检测出3个snp位点，2个为碱基转换位点，1个snp位点缺失。
表3
序列表
<110>宁波大学
<120>用于曼氏无针、虎斑和剑尖枪乌贼间鉴定的分子标记及应用
<130>notpublishedyet
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>79
<212>dna
<213>sepiellamaindroni
<400>1
cgcgtacatatcgcccgtcgctcttgttgataaaataagataagtcgtaacatagtaggg60
gtagtggaaactgttcctg79
<210>2
<211>79
<212>dna
<213>sepiapharaonis
<400>2
cgcgtacatatcgcccgtcgctcttgttggtaaaataagataagtcgtaacatagtaggg60
gtagtggaaactgttcctg79
<210>3
<211>78
<212>dna
<213>loligoedulis
<400>3
cgcgtacatatcgcccgtcgctcttgttggaagataagataagtcgtaacatagtagggg60
tagtggaaactgttcctg80