检测SDC2基因甲基化的方法和试剂盒与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测sdc2基因甲基化的方法和试剂盒。
背景技术：
：临床上结直肠癌筛查主要通过便隐血实验和肠镜检查两种技术进行检测。便隐血实验是检测大便中的血红蛋白，若多次、持续地阳性反应表示消化道出血，应做进一步检查以警惕肠道肿瘤的发生。该技术方便快捷，但是容易受饮食等影响，进而影响检测结果的准确性。此外，肠镜检查是目前最有效可靠的诊断方法，绝大多数早期肠癌患者可由内镜检查发现并确诊。但该诊断方法比较费力费时，病人有一定痛苦，且检查费用高，较难大规模推广。针对结直肠癌的早期诊断和治疗还需要进一步改进。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种检测sdc2基因甲基化的方法和试剂盒，用来实现结直肠癌的早期诊断和治疗。利用本发明的方法以及试剂盒，对于结直肠癌检测的灵敏度高达90％以上，特异性高达93％以上。具体而言，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种检测待测样本中sdc2基因甲基化的方法，包括：从所述待测样本中提取dna；将所述dna样本进行甲基化处理，得到甲基化处理后的dna；以内参基因作为标准，对所述甲基化处理后的dna进行荧光定量pcr检测，确定检测结果；其中，在进行所述荧光定量pcr检测时，所述荧光定量pcr检测体系中加入α-酪蛋白。本发明提供的检测sdc2基因甲基化的方法，其可以对结直肠癌进行分子诊断，对于结直肠癌检测的灵敏度达到90％以上，特异性达到93％以上。而且应用本发明的方法对sdc2基因进行甲基化检测，可以以粪便作为检测样本，由于在粪便中会有一些脱落的癌细胞，故通过对粪便样本中的分子标记物进行检测，可以获得肠癌的相关信息。考虑到粪便成本比较复杂，里面含有很多分子检测的抑制物，导致粪便样本中的检测敏感性和特异性较差，影响了结果的准确性。于是本发明的发明人创造性的发现在荧光定量pcr检测体系中加入α-酪蛋白，能够有效抵制粪便dna中残留抑制物的干扰，提高扩增的稳定性和灵敏度。从而使得粪便中的sdc2基因的检出量与结直肠癌存在极高的对应关系，获得很好的灵敏度和特异性。根据本发明的实施例，以上检测待测样本中sdc2基因甲基化的方法可以进一步附加如下技术特征：根据本发明的实施例，所述内参基因为actb基因或者gadph基因。actb又称为β-actin，是一个管家基因，在绝大多数细胞中表达水平相对稳定。gadph基因也是一个管家基因，几乎在所有组织中都高表达。将β-actin基因或者gadph基因作为内参基因，来评估dna提取、亚硫酸盐转化后dna的质量，能够确保检测的可靠性。根据本发明的实施例，所述α-酪蛋白在所述荧光定量pcr检测体系中的浓度为0.1～1mg/ml，优选为0.4mg/ml。在该浓度下，所述的α-酪蛋白能够有效抵制粪便dna中残留抑制物的干扰，提高扩增的稳定性和灵敏度。根据本发明的实施例，所述α-酪蛋白为牛血清α-酪蛋白。根据本发明的实施例，利用亚硫酸氢盐对所述dna进行甲基化处理。亚硫酸氢盐能够将所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，对待测样本中的dna进行甲基化处理。样本基因组dna经亚硫酸氢盐甲基化处理后，若样本基因组中的sdc2基因序列中的胞嘧啶(c)已经被甲基化，则经甲基化处理试剂盒处理之后的sdc2基因序列不变，特异性引物和特异性探针能够与其结合，荧光pcr反应过程中，在dna聚合酶的作用下探针上的5’末端的荧光报告基团和3’末端的荧光淬灭基团分离，发出荧光。根据本发明的实施例，所述待测样本为粪便样本。在粪便中会有一些脱落的癌细胞，故通过对粪便样本中的分子标记物进行检测，对肠癌筛查有着重要作用。根据本发明的实施例，分别利用第一特异性引物和第一特异性探针扩增和检测sdc2基因，所述第一特异性引物选自seqidno:1～seqidno:10中的至少一组，优选为seqidno:3和seqidno:4，所述第一特异性探针的核酸序列选自seqidno:11～seqidno:16，优选为seqidno:15。sdc2基因的甲基化位点多发生在启动子区的cpg岛，针对sdc2基因启动子区cpg岛所设计的引物序列，设计不同的引物和探针，得到的扩增片段中所包含的甲基化位点不同，最终对结直肠癌检测的灵敏度不同。序列seqidno:1～seqidno:10中奇数序列代表正向引物，编号为偶数的序列代表反向引物，相连编号的序列作为一对引物，例如seqidno:1和seqidno:2作为一对引物，seqidno:3和seqidno:4作为另一对引物，依次类推。根据本发明的实施例，分别利用第二特异性引物和第二特异性探针扩增和检测actb基因，所述第二特异性引物选自seqidno:17～seqidno:26中的至少一组，优选为seqidno:21和seqidno:22，所述第二特异性探针选自seqidno:28～seqidno:32，优选为seqidno:29。根据本发明的实施例，所述第一特异性探针和所述第二特异性探针上分别连接有荧光报告基团和淬灭基团，所述荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、texasred、cys3、cy5或vic中的一种；所述淬灭基团选自bhq、4-(4-恶氨基苯偶氮)苯甲酸)或羧基四甲基罗丹明。根据本发明的第二方面，本发明提供了一种检测sdc2基因甲基化的试剂盒，包括第一特异性引物和第一特异性探针，所述第一特异性引物选自seqidno:1～seqidno:10中的至少一组，优选为seqidno:3和seqidno:4，所述第一特异性探针的核酸序列选自seqidno:11～seqidno:16，优选为seqidno:15。根据本发明的实施例，所述试剂盒可以进一步附加如下技术特征：根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括扩增和检测内参基因actb的第二特异性引物和第二特异性探针，所述第二特异性引物选自seqidno:17～seqidno:26，优选为seqidno:21和seqidno:22中的至少一组，所述第二特异性探针选自seqidno:27～seqidno:32，优选为seqidno:29。根据本发明的实施例，所述试剂盒还包括α-酪蛋白。所述的α-酪蛋白用于抵制粪便dna中残留抑制物的干扰，提高扩增的稳定性和灵敏度。根据本发明的实施例，所述α-酪蛋白为牛血清α-酪蛋白。本发明所取得的有益效果如下：1.本发明提供了一种以管家基因作为内参基因，检测sdc2基因甲基化的分子诊断试剂盒。其对结直肠癌进行可靠的诊断，检测的灵敏度达到90％以上，特异性达到93％以上。2.本发明提供的检测方法和试剂盒是通过甲基化水平来检测和诊断癌症，而甲基化是肿瘤发生过程中的早期事件，检测甲基化能够进行癌症的早期筛查。3.本发明以粪便作为检测样本，样本获得比较容易，且不会对病人造成任何痛苦和不便。附图说明图1为根据本发明的一个实施例提供的利用引物seqidno.1-10对sdc2基因扩增的曲线图。图2为根据本发明的一个实施例提供的用于sdc2基因扩增的引物seqidno.1-10的熔解曲线图。图3为根据本发明的一个实施例提供的利用引物seqidno.17-27对β-actin基因扩增的曲线图。图4为根据本发明的一个实施例提供的用于β-actin基因扩增的引物seqidno.17-27的熔解曲线。图5为根据本发明的一个实施例提供的利用引物seqidno.3-4，以及探针seqidno.11-16获得的sdc2荧光pcr扩增曲线图。图6为根据本发明的一个实施例提供的利用引物seqidno.21-22，以及探针seqidno.28-32获得的β-actin荧光pcr扩增曲线图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。近年来分子诊断在癌症诊断方面发展迅速。目前已有大量的结直肠癌分子标记物在组织和血液样本中被研究和报道。如：基因甲基化，kras突变等。sdc2基因表达一种参与细胞分裂、迁移和在结肠间充质细胞中表达的蛋白质。与成对相邻非肿瘤组织中的sdc2目标区域相比，肿瘤组织中sdc2目标区域的甲基化水平显著更高。本发明提供了一种检测sdc2甲基化的方法和试剂盒，可以实现结直肠癌的筛查和诊断。采用本发明所述方法和试剂盒检测sdc2基因甲基化状态的方法简单，灵敏度高，特异性强；通过检测sdc2基因甲基化能有效判断待测样本是否为结直肠癌患者。本发明中所述sdc2基因在ncbi中的genbank上的登录号为6383。本发明提供的检测粪便中sdc2基因甲基化的方法，包括：从粪便中提取dna；将所述dna样本进行甲基化处理，得到甲基化处理后的dna；以内参基因作为标准，对所述甲基化处理后的dna进行荧光定量pcr检测，确定检测结果；其中，在进行所述荧光定量pcr检测时，所述荧光定量pcr检测体系中加入α-酪蛋白。本发明检测sdc2甲基化的方法，通过荧光定量pcr(qpcr)技术，对pcr扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。根据本发明的实施例，分别利用第一特异性引物和第一特异性探针扩增和检测sdc2基因，所述第一特异性引物选自seqidno:1～seqidno:10，优选为seqidno:3和seqidno:4；所述第一特异性探针的核酸序列选自seqidno:11～seqidno:16，优选为seqidno:15。根据本发明的实施例，利用actb基因作为内参基因。根据本发明的实施例，分别利用第二特异性引物和第二特异性探针扩增和检测actb基因，所述第二特异性引物选自seqidno:17～seqidno:27，优选为seqidno:21和seqidno:22，所述第二特异性探针选自seqidno:28～seqidno:32，优选为seqidno:29。根据本发明的实施例，所述第一特异性探针和所述第二特异性探针上分别连接有荧光报告基团和淬灭基团，所述荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、异硫氰酸荧光素、texasred、cys3、cy5或vic中的一种；所述淬灭基团选自bhq、4-(4-恶氨基苯偶氮)苯甲酸)或羧基四甲基罗丹明。本发明中特异性探针的5’末端和3’末端分别连接有荧光基团和荧光淬灭基团。所述荧光报告基团和荧光淬灭基团为本领域技术人员常用的基团。当探针上同时含有荧光报告基团和荧光淬灭基团时，不发出荧光；当特异性探针被dna聚合酶降解时，荧光报告基团和荧光淬灭基团分开，发出荧光。在荧光定量pcr检测前，首先从粪便中提取dna。可以利用本领域技术人员常用的方法对粪便中的dna进行提取。例如，可以利用商业化的试剂盒提取粪便中的dna。由此，可确保从粪便样本中获得高产量的dna，且能够高效去除粪便样本中的pcr抑制剂，适用于下游的检测。然后在对提取的dna进行甲基化处理，获得经过甲基化处理的dna。例如可以利用商业化的dna甲基化试剂盒进行处理。由此，可以进一步降低甲基化转化过程中宿主dna的损失率，提高低拷贝宿主dna甲基化的检测灵敏度。试剂盒本发明提供了一种对检测sdc2基因甲基化的试剂盒。所述的试剂盒中除了包含用于sdc基因以及内参基因的特异性引物、特异性探针之外，还可以包括：hotstarttaq酶、dntps、pcr扩增缓冲液等。根据本发明的实施例，所述引物浓度为500nm；所述taqman探针浓度为250nm；所述taq酶浓度为1u/μl的；所述dntps浓度为0.2mm；所述经过甲基化的粪便宿主dna量为1～20μl；发明人经过大量实验得到上述较优浓度配比，由此，以进一步提高扩增特异性、稳定性或灵敏度。本发明所述的试剂盒与荧光定量pcr检测相结合后，可以用于检测sdc2基因的甲基化状态。sdc2基因高度甲基化是结直肠癌的重要分子标志，故本发明所述的试剂盒在结直肠癌诊断中具有重要意义。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1粪便样本的提取利用试剂盒提取粪便中人源的dna，所用到的人源dna的提取是用商业化试剂盒qiaampfastdnastoolminikit，货号51604。所述粪便样本为经临床肠镜检测以及病理筛查确定为结直肠癌的患者的粪便样本。其具体的提取流程可参照商业试剂盒的说明书进行。按照qiaampfastdnastoolminikit试剂盒标准操作流程：向样本中加入1mlinhibitexbuffer，涡旋1min至样本充分均质，16000g离心1min；取25μl蛋白酶k至新的离心管，并吸取600μl前一步上清至蛋白酶k管，加入600μlbufferal并涡旋15s，置于70℃孵育10min；加入600μl乙醇，并涡旋混匀，分三次qiaampspincolumn，每次在16000g离心1min；小心向柱上加入500μlbufferaw1，在16000g离心1min，除去收集管内液体；向柱上加入500μlbufferaw2，在16000g离心3min，除去收集管内液体；继续在16000g离心3min，将qiaampspincolumn移至新的1.5ml离心管，加入200μlbufferate，室温放置1min，并在16000g离心1min，得到从粪便样本中提取到的dna，用于后续操作。实施例2亚硫酸盐转化对实施例1中获得的由粪便中提取的宿主dna进行甲基化处理。所述的dna甲基化处理采用商业化试剂盒为zymoresearch公司生产的ezdnamethylationkit，货号d5005。在进行甲基化处理的过程中，亚硫酸氢盐能够将所有未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不发生该反应。具体来说，若样本基因组中的sdc2基因序列中的胞嘧啶(c)没有被甲基化，则经甲基化处理试剂盒处理后，sdc2基因序列中的c突变为u，则经过甲基化处理后，后续在进行荧光定量pcr的过程中，特异性探针与特异性引物无法与处理后的样本dna结合，荧光pcr反应过程中，探针保持完整，由于同时连接有5’荧光报告基团和3’荧光淬灭基团，荧光pcr反应过程中不发出荧光。即经甲基化处理试剂盒处理后，甲基化的sdc2基因在荧光定量pcr检测过程中会发出荧光，而没有甲基化的sdc2基因不发出荧光。其中利用甲基化试剂盒处理过程如下：zymoresearch试剂盒转化流程：上述提取好的20μldna样本中加入130μlctconversionreagent(现配现用)，涡旋混匀后按照(98℃，10min；64℃，2.5h)的条件进行转化反应；吸附柱中加入600μlm-bindingbuffer，然后再将转化的样本加入体系中，颠倒数次混匀，10000rpm离心30s，吸除下层溶液；向吸附柱中加入100μlm-washbuffer，10000rpm离心1min，吸除下层溶液；向吸附柱中200μlm-desulphonationbuffer，室温放置20min，然后10000rpm离心1min，吸除下层溶液；向吸附柱内加入200μlm-washbuffer，10000rpm离心1min，吸除下层溶液；重复上述步骤；将吸附柱转移到新的收集管，加15μlm-elutionbuffer，室温放置5min后，在10000rpm离心1min。获得转化后dna样本用于后续检测。实施例3qpcr检测过程将实施例2获得的经过亚硫酸氢盐转化后的dna进行荧光定量pcr反应(qpcr)，其中qpcr的体系和程序分别如表1、表2所示。同时为了筛选最优的特异性引物，分别利用不同的特异性引物分别对sdc2基因以及β-actin基因进行扩增，得到相应的扩增曲线以及熔解曲线，分别如图1～图4所示。其中所用到的特异性引物序列如表3所示。表1qpcr检测体系成分加入量(ul)sdc2正向引物(10μm)2sdc2反向引物(10μm)2β-actin正向引物(10μm)2β-actin反向引物(10μm)25u/μlhotstartaqplusdnapolymerase2.55×pcr扩增缓冲液10转化后dna模板1010×sybrgreen5灭菌去离子水14.5合计50其中，5×pcr扩增缓冲液的成分为：50mmtris-hcl(ph8.3)、250mmkcl、12.5mmmgcl2、2mg/mlα-酪蛋白、1mmdntps、100mm四甲基氯化铵、2.5％tween-20。表2qpcr程序表3sdc2&β-actin引物序列表3中，奇数代表正向引物，偶数代表反向引物。其中每一对引物包括相邻的奇数和偶数，即seqidno:1和seqidno:2为一对引物；seqidno:3和seqidno:4为另一对引物，依次类推。其中图1和2是sdc2基因引物seqidno.1～10的扩增曲线和熔解曲线；从图中可以看出seqidno.3、seqidno.4扩增效率好且无非特异性扩增。图3和4是actb基因引物seqidno.17～26的扩增曲线和熔解曲线；从图中可以看出，扩增效率最好且无非特异性扩增的引物序列为seqidno.21、22。实施例4探针的优化为了进一步验证sdc2和内参基因的探针，根据荧光定量pcr结果分别对表5的探针序列进行筛选。其中qpcr的体系和程序分别如表4、表2所示。用于sdc2检测的探针序列分别为seqidno:11～seqidno:16，且该特异性探针上分别连接有荧光报告基团fam和荧光淬灭基团bhq1，fam和bhq分别连接在特异性探针序列的5’端和3’端。特异性探针上的荧光报告基团fam发出绿色荧光，当探针中的序列无法与待测溶液中的dna模板配对时，探针保持保证，即同时含有荧光报告基团fam和荧光淬灭基团bhq1，pcr扩增后无法检测到荧光；而当探针能够与待测溶液中的dna发生碱基互补配对时，探针被taqdna聚合酶降解，探针5’端的报告基团与3’端的淬灭基团分离，pcr扩增过程中能够检测到荧光。探针序列是以sdc2基因高甲基化后的dna序列为模板设计的，同样地，用于基因actb探针分别为seqidno.28～seqidno:32，且该特异性探针上分别连接有荧光报告基团vic和荧光淬灭基团mgb，vic和mgb分别连接在特异性探针序列的5端’和3’端。表4qpcr检测体系成分加入量(ul)sdc2正向引物(10μm)2sdc2反向引物(10μm)2sdc2探针(10μm)1β-actin正向引物(10μm)2β-actin反向引物(10μm)2β-actin探针(10μm)15u/μlhotstartaqplusdnapolymerase2.55×pcr扩增缓冲液10转化后dna模板10灭菌去离子水17.5合计50其中，5×pcr扩增缓冲液的成分为：50mmtris-hcl(ph8.3)、250mmkcl、12.5mmmgcl2、2mg/mlα-酪蛋白、1mmdntps、100mm四甲基氯化铵、2.5％tween-20。表5探针序列图5给出了利用特异性引物seqidno:3和seqidno:4进行扩增，然后分别利用特异性探针seqidno:11～seqidno:16进行定量检测的结果。由图5可以看出，探针seqidno.11～16均可以保证pcr过程正常进行，相较来说，探针seqidno.15扩增效率高一些。图6给出了利用特异性引物seqidno.21和seqidno:22进行扩增，然后分别利用特异性探针seqidno.28～seqidno:32进行定量检测的结果。由结果可知，探针seqidno.28～32均可以保证pcr过程正常进行，相较来说，探针seqidno.29的荧光信号更高一些，有助于提高样本的检出率。综上，针对sdc2基因启动子区cpg岛所设计的引物序列以及探针序列，当引物序列不同时，所得到的扩增片段中包含的甲基化位点不同以及甲基化的个数等均不相同，最终对结直肠癌检测的灵敏度不同。实施例5样本检测临床收集30例肠镜及病理检查确诊为肠癌的患者的粪便样本，30例肠镜检查确诊为正常的受试者的粪便样本。按照实施例1中的方法对上述粪便样本进行dna提取，按照实施例2中的方法对提取后的dna进行亚硫酸盐转化，然后分别利用特异性引物seqidno:3和seqidno:4以及特异性探针seqidno:15对sdc2基因进行荧光定量pcr检测，利用特异性引物seqidno:21和seqidno:22以及特异性探针seqidno:29对β-actin基因进行荧光定量pcr检测。其中，样本编号1-30来自于肠癌患者，样本编号31-60来自于正常的受试者，检测结果如下表所示：表6sdc2检测结果与临床结果比对然后按照如下计算特异性以及灵敏度，特异性＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数))*100％＝28/30*100％＝93.3％灵敏度＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数))*100％＝27/30*100＝90％根据计算结果可知，对于结直肠癌，sdc2基因的检测灵敏度为90％，特异性为93.3％。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>上海锐翌生物科技有限公司<120>检测sdc2基因甲基化的方法和试剂盒<130>pidc4180063<160>32<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1gcgggagtaggcgtagga18<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2tacttacaaccaaaacaaaacga23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3agtattaatttcgtgtcgggagt23<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4aaccgactactcccaaccg19<210>5<211>17<212>dna<213>人工序列<400>5gaggaggaagcgagcgt17<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6actactcccaaccgctacttaca23<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7agtaggcgtaggaggaggaa20<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<400>8ccgactactcccaaccgc18<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9gtcgggagtgtagaaattaataagt25<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10ttccccaaaaaccgactact20<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<400>11cgagtttgagtcgtaatcgttgcgg25<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列<400>12aatcgttgcggtattttgtttcgga25<210>13<211>31<212>dna<213>人工序列<400>13ccgcgcacacgaatccgaaacaaaataccgc31<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14tgtttcggattcgtgtgcgcgggtt25<210>15<211>19<212>dna<213>人工序列<400>15tgcgcgggttgcgtcgagc19<210>16<211>24<212>dna<213>人工序列<400>16cgcacacgaatccgaaacaaaata24<210>17<211>25<212>dna<213>人工序列<400>17aaggttagggataggatagttttat25<210>18<211>25<212>dna<213>人工序列<400>18acctaataaaaaaaataaccaccac25<210>19<211>28<212>dna<213>人工序列<400>19ataggatagttttatttttaggaggtag28<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<400>20aattacaaaaaccacaacctaata24<210>21<211>25<212>dna<213>人工序列<400>21gaaagatataaggttagggatagga25<210>22<211>25<212>dna<213>人工序列<400>22atactcaaccaataaaacctactcc25<210>23<211>23<212>dna<213>人工序列<400>23atagttttatttttaggaggtag23<210>24<211>25<212>dna<213>人工序列<400>24cacacaataacaaacacaaattcac25<210>25<211>25<212>dna<213>人工序列<400>25tgaaagatataaggttagggatagg25<210>26<211>25<212>dna<213>人工序列<400>26cacgatacaaaactatactcaacca25<210>27<211>25<212>dna<213>人工序列<400>27ccacgcaaaaacaaacttccccaac25<210>28<211>23<212>dna<213>人工序列<400>28tcctccatcaccaccccacgcaa23<210>29<211>29<212>dna<213>人工序列<400>29acaatccaaaaaacttactaaacctcctc29<210>30<211>24<212>dna<213>人工序列<400>30cttactaaacctcctccatcacca24<210>31<211>25<212>dna<213>人工序列<400>31taaacctcctccatcaccaccccac25<210>32<211>25<212>dna<213>人工序列<400>32acacaaattcacaatccaaaaaact25当前第1页12