本发明属于生物检测领域，特别涉及用于结直肠癌相关基因甲基化的检测方法、试剂盒及应用。
背景技术：
由于现有的结直肠癌筛查方法，如结肠镜检查、粪便sdna检查、血清癌胚抗原(cea)水平检查，存在效率低、准确性低或侵入性的特点，导致结直肠癌患者不能及时得到诊断，多数结直肠癌患者被发现时已经处于发展晚期，治疗和预后效果不佳。因此，寻找一种简单、安全、特异性高、灵敏性高的早期筛查方法是当前结直肠癌预防和治疗的关键。
dna甲基化(dnamethylation)作为重要的表观遗传修饰之一，它与肿瘤的发生发展关系密切。狭义的dna甲基化指由dna甲基转移酶(dnamethyhransferase，dnmt)介导，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将一个甲基基团共价结合到胞嘧啶(cytoine，cyt)环5位碳上，成为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mc)的化学修饰过程。dna甲基化通常发生于cpg二核苷酸中，对基因的表达和调控有重要作用。目前，dna甲基化已应用于肿瘤机制和诊治研究。结直肠癌的dna甲基化研究中主要采用的是肿瘤组织，但是由于获取难度大，肿瘤组织样品并不适用于广泛筛查和早期诊断。研究者们尝试从非侵入性生物样品(如血液)中寻找生物标志物。此类样品具有适合大量样本收集、操作及处理简便等优点，其dna甲基化有望成为非侵袭性肿瘤标志物来源，以更好地运用于临床。
由于一些抑癌基因异常甲基化常发生在肿瘤形成的开始，可运用于早期检测。而混杂因素可能导致检测的假阳性，早期检测最关键的问题是区分非肿瘤如年龄、饮食等相关的甲基化与肿瘤特异甲基化，设计研究方案时应考虑各种混杂因素或选用独立个体。尽管目前已有一些抑癌基因如spg20、fbn1、vim等甲基化检测用于结直肠癌的早期诊断，但往往会出现特异性或灵敏性不强的特点。
目前常用来进行检测基因甲基化的方法有甲基化特异性pcr(ms-pcr)、亚硫酸氢盐处理和测序等方法。ms-pcr方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展ms-pcr。在传统的msp方法中，通常设计两对引物，一对msp引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的dna模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，需要预先知道待测片段的dna序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。亚硫酸氢盐处理和测序一度被认为是dna甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用pcr扩增目的片段，并对pcr产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断cpg位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个cpg位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
因此，甲基化检测特异性或灵敏性不强等技术问题还有待解决。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，为改善甲基化检测特异性或灵敏性不强等问题，提供用于检测lad1基因甲基化的特异性引物对和探针。
本发明的第二目的在于提供所述的特异性引物对和探针的应用。
本发明的第三目的在于提供用于检测lad1基因甲基化的试剂盒。
本发明的第四目的在于提供基于所述的特异性引物对和/或探针的lad1基因甲基化检测方法，利用本发明的特异性引物和/或探针来区分甲基化和未甲基化的dna。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
用于检测lad1基因甲基化的特异性引物对：
lad1-mf：gattatcgggtgtcgtagttc，(如seqidno.1所示)
lad1-mr：ccctaacgcaacgtacgcg。(如seqidno.2所示)
与所述的特异性引物对配合使用的荧光探针，包括以下任一序列：
(1)tgagtagaataaggagagattat，(如seqidno.3所示)
(2)acaactaacacttaacattataac。(如seqidno.4所示)
所述的荧光探针在所述的序列的5’端标记荧光报告基团，在其3’端标记荧光淬灭基团。
所述的特异性引物对和/或荧光探针在制备检测lad1基因甲基化的试剂盒中的应用。
一种用于检测lad1基因甲基化的生物标志物，其核苷酸序列如seqidno.7所示。
一种检测lad1基因甲基化的试剂盒，包含所述的特异性引物对。
所述的检测lad1基因甲基化的试剂盒，还可以包括如下用于进一步确认非甲基化结果的引物对：
lad1-uf：agattattgggtgttgtagttt，(如seqidno.5所示)
lad1-ur：aaccctaacacaacatacaca。(如seqidno.6所示)
所述的检测lad1基因甲基化的试剂盒，还包含所述的荧光探针或dna荧光染料。
所述的检测lad1基因甲基化的试剂盒，还可以包括阳性标准品、阴性质控品、pcr反应液、pcr酶中的至少一种。
所述的阳性标准品为插入所述的用于检测lad1基因甲基化的生物标志物的载体质粒。
一种lad1基因甲基化检测方法，利用如seqidno.1～2所示的特异性引物和如seqidno.5～6所示的荧光探针或荧光染料进行实时定量pcr，检测待测样本中的lad1基因启动子区第26位和第27位甲基化程度(图1)。
当采用荧光染料进行实时荧光pcr时，最佳反应条件为：预变性95℃，10min；95℃，15s，60℃，60s，40个循环；以每20s升温1℃速率从75℃升温至95℃，得到溶解曲线。
当采用荧光探针进行实时荧光pcr时，最佳反应条件为：95℃，20min；50个pcr循环，每个循环中，先升温至62℃，5s，再降温至56℃，反应35s，最后升温至94℃，反应20s；50个循环反应后降温至40℃，反应30s。
当所述的实时定量pcr为探针法时，与所述的特异性引物对配合使用的荧光探针优选为如seqidno.3～4所示。
所述的lad1基因甲基化检测方法，还可以进一步利用如seqidno.5～6所示的引物对进行实时定量pcr对lad1基因非甲基化的结果进行进一步确认，以进一步提高结果准确性。如果只有甲基化引物发生扩增，说明第26和27位均发生了甲基化；如果甲基化的引物和非甲基化的引物都发生了扩增，说明该位点中只有第26或27位发生了甲基化；如果只有非甲基化引物发生扩增，则说明这两个位点是完全非甲基化。
所述的待测样本优选为血液样本。
所述的特异性引物对和/或探针、所述的检测lad1基因甲基化的试剂盒或所述的lad1基因甲基化检测方法在结直肠癌检测中的应用。
本发明拟采用甲基化荧光法对待测样品dna的中lad1基因甲基化的检测。采用探针法和染色法对特定甲基化位点进行realtimepcr检测。信号强度与pcr产物的量成正比，据此可计算出样品的甲基化程度。
lad1为申请人新发现的结直肠癌抑癌基因，免疫组化结果提示它与结直肠癌的tnm分期及淋巴结转移负相关，理论研究提示该基因与结直肠癌细胞的失巢凋亡有关。然而目前就lad1单独及其联合其他基因作为结直肠癌早期诊断的检测方法尚无研究报道。本发明将利用甲基化荧光法对待测样品dna的中lad1基因甲基化的检测，作为结直肠癌早期诊断的新辅助手段。此种方法利用
申请人发现，正常人的待测样品(如血液样品)dna的lad1无甲基化化，而结直肠癌患者待测样品(如血液样品)的lad1甲基化程度显著增加。因此对于今后病人建议对其待测样品(如血液样品)dna先进行检测，如果发现lad1甲基化程度显著增加，将建议患者进行内镜等常规检测以便于病情得到确诊。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明所使用的检测方法具有高通量特性，将为结直肠癌无创快速筛查提供一定的参考。
2.本发明无需在pcr后进行电泳和分子杂交等操作，不仅能减少实验过程中污染和操作误差，还能节约时间和节省试剂消耗，因此本发明不仅能减少检测成本，提高检测效率。
3.本发明所使用的检测方法具有高敏感性等特点，且甲基化的lad1是结肠癌发生早期就已经出现，该检测方法为结直肠癌早期诊断提供参考。
4.本发明通过对用实时定量pcr对lad1基因特定位点的非甲基化和非甲基化的结果双重检测，为确认本检测方法的可靠性和检测结果的准确性提供依据。
5.本发明通过对用两种实时定量pcr方法进行研究，证明lad1基因特定位点甲基化检测具有实验可行性，并为临床应用提供重要依据。
附图说明
图1为lad1基因启动子区序列示意图。
图2为实施例1中引物lad1-mf、lad1-mr的荧光定量pcr扩增曲线图(结直肠癌患者)。
图3为实施例1中引物lad1-mf、lad1-mr的荧光定量pcr溶解曲线图(结直肠癌患者)。
图4为实施例1中内参基因atcb的荧光定量pcr扩增曲线图。
图5为实施例1中内参基因atcb的荧光定量pcr溶解曲线图。
图6为实施例1中引物lad1-uf、lad1-ur的荧光定量pcr扩增曲线图(正常人)。
图7为实施例1中引物lad1-uf、lad1-ur的荧光定量pcr溶解曲线图(正常人)。
图8是实施例3中lad1的特异性曲线图，其中，横轴是1-特异度，纵轴是灵敏度。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1荧光染料法
1.dna提取
利用qiagen51183的血液提取dna试剂盒提取正常人和结直肠癌患者的血液dna，具体操作步骤如下：
(1)加20μlproteasek到1.5ml离心管中。
(2)加200μl的样品液(50～100μl抗凝血，补充pbs到220μl)。
(3)加200μl的bufferal，涡旋15s。
(4)56℃温育10min，直到裂解完全。
(5)快速离心。
(6)加200μl乙醇(100％)，涡旋15s，快速离心。
(7)转移混合液到spincolumn(2ml收集管)，6000g或8000rpm，离1min，换新管，弃掉旧的收集管。
(8)加500μlbufferaw1，涡旋15s，6000g或8000rpm，离1min，弃旧管换新管。
(9)加500μlbufferaw2，涡旋15s，全速(20，000g或14，000rpm)离1min。
(10)换新管，全速(20，000g或14，000rpm)空管离心3min。
(11)新离心管，100μlbufferae温室温育5min，6000g或8000rpm，离1min，重复洗脱3次。
2.重亚硫酸盐处理dna
上述基因组dna，用德国qiagen59104甲基化试剂盒进行重亚硫酸盐处理，操作按照说明书进行。
用无rna酶水将重亚硫酸盐混合物溶解，按以下体系将相应物质加入200μl的pcr管(130μl体系)：
表1pcr反应体系
充分混匀，室温放置15～25分钟，然后在pcr仪上进行下述程序：95℃5分钟，60℃25分钟，95℃5分钟，60℃85分钟，95℃5分钟，60℃175分钟，最后进入20℃维持。
将pcr管取出，稍离心后，将内容物转到1.5mleppendorf管，加入560μl新鲜bl缓冲液，bl按10μg/ml的浓度加入载体rna，充分混匀，稍离心后将以上内容物转入离心柱室温，以最大速度离心1分钟，弃去离下的液体，将离心柱重新放回收集管，用500μlbw液洗涤一次，加入500μlbd液，室温放置15分钟，室温，最大速度离心1分钟，然后用bw液洗涤两次(每次500μl)，然后空离1分钟以尽量去除残留液体，将离心柱盖子打开，放入新的1.5mleppendorf管，56℃放置5分钟，向离心柱的膜上滴加20μleb液，室温15000g离心1分钟，即得处理后的待测dna。
3.实时定量pcr
以步骤2得到的待测dna作为模板，用相应引物对分别来进行定量pcr。
(1)取0.2mlpcr管，配制如表2所示的反应体系，每个反转录产物配制3管。
表2m-lad1引物pcr反应体系
表3u-lad1引物pcr反应体系
(2)取0.2mlpcr管，配制如表4所示的反应体系，每个反应体系配制3管。
表4内参基因atcbpcr反应体系
其中，actb基因及探针引物如下：
actb-fgtgatggaggtttagtaagtt
actb-rccaataaaacctactcctcccttaa
探针引物accaccacccaacacacaataacaaacaca
(3)pcr扩增
预变性95℃，10min；
循环(40次)95℃，15s→60℃，60s；
溶解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃。
(4)融解曲线分析
运行sds软件，并设定融解曲线程序：95℃15s；60℃15s；95℃15s。
4.结果分析
实时荧光定量pcr结果分析：扩增完毕后，进入结果分析界面，看ct值、起始拷贝数、标准偏差和溶解曲线等。以atcb为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(rq值)，将rq值用于统计分析。如果检测位点出现甲基化，那么q-pcr会出现相应的荧光强度；反之在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点未有甲基化。图2为从结肠癌患者血液样本中提取的dna的扩增曲线；溶解曲线如图3所示，溶解曲线为单一峰，溶解温度约为85.8℃。图4、图5为内参基因actb的扩增曲线和溶解曲线。
另外我们采用u-lad1的引物(lad1-uf、lad1-ur)对正常人的血液样品进行反向验证，如果q-pcr在40个循环内出现相应的荧光强度，说明该位点为非甲基化状态；在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点为甲基化化状态。结果如图5和图6所示，说明本发明所建立的lad1基因甲基化检测方法准确、可靠。
实施例2探针法
1.dna提取
操作同实施例1。
2.重亚硫酸盐处理dna
操作同实施例1。
3.实时定量pcr
以步骤2得到的待测dna作为模板，用相应引物对和探针分别来进行定量pcr。
(1)待测样品pcr反应体系
pcr反应体系的总体积为30μl。
pcr反应的程序为95℃，20min；50个pcr循环，每个循环中，先升温至62℃，5s，再降温至56℃，反应35s，最后升温至94℃，反应20s；50个循环反应后降温至40℃，反应30s，pcr反应结束。
每个pcr反应体系30μl，最终反应体系浓度达到：氯化镁(mgcl2)2.5mm，dntp0.25mm，lad1引物(lad1-mf、lad1-mr)350nm，阻断剂引物(如seqidno.11所示)100nm，lad1探针70nm(如seqidno.3所示的探针，序列的5’端标记fam，在其3’端标记tamra)，actb基因引物(上下游)170nm，actb基因探针70nm，dna聚合酶1.5u，dna模板2～20ng/μl，补充10×pcr缓存液buffer到总体积30μl。
其中actb基因的上下游引物、探针同实施例1。
(2)结果分析
实时荧光定量pcr结果分析：扩增完毕后，进入结果分析界面，看ct值、起始拷贝数、标准偏差等。以atcb为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(rq值)，将rq值用于统计分析。如果检测位点出现甲基化，那么q-pcr会出现相应的荧光强度；反之在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点未有甲基化。
实施例3探针法
1.dna提取
操作同实施例1。
2.重亚硫酸盐处理dna
操作同实施例1。
3.实时定量pcr
以步骤2得到的待测dna作为模板，用相应引物对和探针分别来进行定量pcr。
(1)待测样品pcr反应体系
pcr反应体系的总体积为30μl。
pcr反应的程序为95℃，20min；50个pcr循环，每个循环中，先升温至62℃，5s，再降温至56℃，反应35s，最后升温至94℃，反应20s；50个循环反应后降温至40℃，反应30s，pcr反应结束。
每个pcr反应体系30μl，最终反应体系浓度达到：氯化镁(mgcl2)2.5mm，dntp0.25mm，lad1引物(lad1-mf、lad1-mr)350nm，阻断剂引物(如seqidno.11所示)100nm，lad1探针70nm(如seqidno.4所示的探针，序列的5’端标记fam，在其3’端标记tamra)，actb基因引物(上下游)170nm，actb基因探针70nm，dna聚合酶1.5u，dna模板2～20ng/μl，补充10×pcr缓存液buffer到总体积30μl。
其中actb基因的上下游引物、探针同实施例1。
(2)结果分析
实时荧光定量pcr结果分析：扩增完毕后，进入结果分析界面，看ct值、起始拷贝数、标准偏差等。以atcb为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(rq值)，将rq值用于统计分析。如果检测位点出现甲基化，那么q-pcr会出现相应的荧光强度；反之在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点未有甲基化。
进一步采用u-lad1的引物(lad1-uf、lad1-ur)对正常人的血液样品进行反向验证，如果q-pcr在40个循环内出现相应的荧光强度，说明该位点为非甲基化状态；在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点为甲基化化状态。
实施例4临床效果实施例
将试验对象分为3组，即结直肠癌组79例、结直肠息肉组73例和健康对照组146名。采集外周血血样后，应用实施例1的pcr荧光探针法检测外周血浆中mlad1，分析该基因阳性率与结直肠临床病理特征的关系，并与cea和(或)cal9-9阳性率作比较(cea和cal9-9检测方法参见文献林世永.西地那非在小鼠结肠炎相关性癌变中的作用及机制研究[d]；南方医科大学,2017.)。统计学分析采用卡方检验或连续性校正的卡方检验。
分析结果发现，结直肠癌组血浆mlad1阳性率为71.05％(54/76)，结直肠息肉组为5.80％(4/69)，健康对照组为3.68％(5/136)，结直肠癌组mlad1阳性率明显高于其他两组(p<0.01)。血浆mlad1在结直肠癌患者中的敏感度为71.05％，特异度为82.5％。与血清其他肿瘤标志物相比，结直肠癌患者血浆mlad1阳性率明显高于cea、ca19-9及联合检测cea、cal9-9的阳性率，分别为71.05％(54/76)、34.21％(26/76)、18.42％(14/76)、40.79％(31/76)，两两比较差异均有统计学意义(χ2＝20.689、42.577、14.119，p均<0.01)。结论结直肠癌患者血清mlad1阳性率明显增高，检测该基因在结直肠癌的诊断中具有重要的临床意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南理工大学
<120>用于结直肠癌相关基因甲基化的检测方法、试剂盒及应用
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>特异性引物lad1-mf
<400>1
gattatcgggtgtcgtagttc21
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>特异性引物lad1-mr
<400>2
ccctaacgcaacgtacgcg19
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>探针1
<400>3
tgagtagaataaggagagattat23
<210>4
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>探针2
<400>4
acaactaacacttaacattataac24
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>特异性引物lad1-uf
<400>5
agattattgggtgttgtagttt22
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>特异性引物lad1-ur
<400>6
aaccctaacacaacatacaca21
<210>7
<211>267
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>生物标志物核苷酸序列
<400>7
ggttgggtttattttagtgtattggcgaatggagtgggggcgcgcggggctggcgcgagg60
aaatggctgggtttttattggagattttatatttgcagggtttgttttggcgtaattaat120
gttgggtttggttgggctggcgctttggcgtttgtgatttatttggcagcttgcttagcg180
ctttggcttgctgcttgcgggctttggctgtattttgattagctgatgggctttgctttt240
gttttttgaaggatgagttttggttag267
<210>8
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>引物actb-f
<400>8
gtgatggaggtttagtaagtt21
<210>9
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>引物actb-r
<400>9
ccaataaaacctactcctcccttaa25
<210>10
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>actb探针
<400>10
accaccacccaacacacaataacaaacaca30
<210>11
<211>37
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>阻断剂引物
<400>11
attagttattatgttggattttgtggttaatgtgtag37