本发明属于生物检测领域，特别涉及一种检测粪便lad1基因甲基化的方法、试剂盒及应用。
背景技术：
尽管spg20、fbn1、vim等甲基化检测用于结直肠癌的早期诊断，但往往会出现特异性或灵敏性不强的特点。目前常用来进行检测基因甲基化的方法有甲基化特异性pcr(ms-pcr)、亚硫酸氢盐处理和测序等方法。
ms-pcr方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展ms-pcr。在传统的msp方法中，通常设计两对引物，一对msp引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的dna模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，需要预先知道待测片段的dna序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。
亚硫酸氢盐处理和测序一度被认为是dna甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用pcr扩增目的片段，并对pcr产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断cpg位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个cpg位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，改善甲基化检测特异性或灵敏性不强等问题，提供一种检测粪便lad1基因甲基化的方法。
本发明的另一目的在于提供一种检测粪便lad1基因甲基化的试剂盒。
本发明的再一目的在于提供所述的检测粪便lad1基因甲基化的方法或试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种检测粪便lad1基因甲基化的方法，从粪便样品中提取dna，利用特异性引物对lad1-mf和lad1-mr进行实时定量pcr，检测待测粪便样本中的lad1基因启动子区(seqidno.7)第26位和第27位甲基化程度(图1)。
其中，lad1-mf的序列为：gattatcgggtgtcgtagttc，(如seqidno.1所示)；
lad1-mr的序列为：ccctaacgcaacgtacgcg。(如seqidno.2所示)。
所述的实时定量pcr可为探针法或染料法。
当所述的实时定量pcr为探针法时，与所述的特异性引物对配合使用的荧光探针，包括以下任意序列：
(1)tgagtagaataaggagagattat，(如seqidno.3所示)
(2)acaactaacacttaacattataac。(如seqidno.4所示)
当采用荧光染料进行实时荧光pcr时，最佳反应条件为：预变性95℃，10min；95℃，15s，60℃，60s，40个循环；以每20s升温1℃速率从75℃升温至95℃，得到溶解曲线。
当采用荧光探针进行实时荧光pcr时，最佳反应条件为：95℃，20min；50个pcr循环，每个循环中，先升温至62℃，5s，再降温至56℃，反应35s，最后升温至94℃，反应20s；50个循环反应后降温至40℃，反应30s。
所述的检测粪便lad1基因甲基化的方法，还可以进一步利用如seqidno.5～6所示的引物对进行实时定量pcr对lad1基因非甲基化的结果进行进一步确认，以进一步提高结果准确性。如果只有甲基化引物发生扩增，说明第26和27位均发生了甲基化；如果甲基化的引物和非甲基化的引物都发生了扩增，说明该位点中只有第26或27位发生了甲基化；如果只有非甲基化引物发生扩增，则说明这两个位点是完全非甲基化。
一种检测粪便lad1基因甲基化的试剂盒，包含所述的特异性引物对。
所述的检测粪便lad1基因甲基化的试剂盒，还可以包括如下用于进一步确认非甲基化结果的引物对：
lad1-uf：agattattgggtgttgtagttt，(如seqidno.5所示)
lad1-ur：aaccctaacacaacatacaca。(如seqidno.6所示)
所述的检测粪便lad1基因甲基化的试剂盒，还包含所述的探针或荧光染料。
所述的检测粪便lad1基因甲基化的试剂盒，还可以包括阳性标准品、阴性质控品、pcr反应液、pcr酶中的至少一种。
所述的阳性标准品为插入如seqidno.7所示的核苷酸序列的载体质粒。
所述的检测粪便lad1基因甲基化的方法或所述的检测粪便lad1基因甲基化的试剂盒在结直肠癌检测中的应用。
本发明拟采用甲基化荧光法对待测样品dna的中lad1基因甲基化的检测。采用探针法和染色法对特定甲基化位点进行realtimepcr检测。信号强度与pcr产物的量成正比，据此可计算出样品的甲基化程度。
本发明利用甲基化荧光法对粪便dna的中lad1基因甲基化的检测，作为结直肠癌早期诊断的辅助手段。lad1为申请人新发现的结直肠癌抑癌基因，免疫组化结果提示它与结直肠癌的tnm分期及淋巴结转移负相关，理论研究提示该基因与结直肠癌细胞的失巢凋亡有关。然而目前就lad1单独及其联合其他基因作为结直肠癌早期诊断的检测方法尚无研究报道。鉴于lad1的生物学功能及申请人已有的研究结果成功利用粪便lad1基因甲基化辅助结直肠癌早期诊断。本发明采用甲基化荧光法对粪便dna的中lad1基因甲基化的检测，利用pcr引物结合
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明所使用的检测方法具有高通量特性高敏感性，将为结直肠癌无创快速筛查提供一定的参考。
2.本发明无需在pcr后进行电泳和分子杂交等操作，不仅能减少实验过程中污染和操作误差，还能节约时间和节省试剂消耗，因此本发明不经能减少检测成本，提高检测效率。
3.本发明所使用的检测方法具有高敏感性等特点，且甲基化的lad1是结肠癌发生早期就已经出现，该检测方法为结直肠癌早期诊断提供参考。
4.本发明通过对用实时定量pcr对lad1基因特定位点的非甲基化和非甲基化的结果双重检测，为确认本检测方法的可靠性和检测结果的准确性提供依据。
5.本发明通过对用两种实时定量pcr方法进行研究，证明lad1基因特定位点甲基化检测具有实验可行性，并为临床应用提供重要依据。
附图说明
图1为lad1基因启动子区序列示意图。
图2为实施例1中引物lad1-mf、lad1-mr的荧光定量pcr溶解曲线图和扩增曲线图(结直肠癌患者)。
图3为实施例1中内参基因atcb的荧光定量pcr溶解曲线图和扩增曲线图。
图4为实施例1中引物lad1-uf、lad1-ur的荧光定量pcr溶解曲线图和扩增曲线图(正常人)。
图5是实施例2中lad1的特异性曲线图，其中，横轴是1-特异度，纵轴是灵敏度。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1荧光染料法
1.dna提取
利用粪便dna提取试剂盒(qiagen粪便dna提取试剂盒)提取正常人和结直肠癌患者的粪便dna，具体操作步骤如下：
(1)收集约200～220mg粪便到一个2ml离心管，置冰上。(如果是冰冻的标本，加入缓冲液asl前不能解冻，否则dna容易降解。)
(2)加1.4ml缓冲液asl，连续涡旋振荡1分钟或者直到完全混匀均一，注意完全涡旋混匀，否则会严重降低产量。
(3)将重悬物70℃温育5分钟。该加热步骤可以提高3～5倍dna产量，并且帮助裂解细菌和寄生虫。对于某些难裂解的细胞(如革兰氏阳性菌)可以提高到95℃。
(4)涡旋振荡15秒，室温放置1分钟。最高速离心1分钟沉淀粪便颗粒。
(5)转移900μl上清到一个1.5ml离心管，加入100μl杂质清除剂ab，立刻涡旋振荡1分钟或者直到完全混匀均一，室温放置1分钟。最高速离心3分钟去除杂质。
(6)转移所有上清到一个1.5ml离心管，最高速离心3分钟。
(7)转移210μl上清到一个1.5ml离心管，加入20μl蛋白酶k(20mg/ml)溶液，充分混匀，加入200μl结合液cb，涡旋振荡15秒，充分混匀。70℃温育10分钟。(如果产量偏低，可以转移更多的上清，并且相应的按比例提高蛋白酶k和结合液的和后面的异丙醇使用量。)
(8)冷却后加入100μl异丙醇，涡旋混匀。
(9)将上一步所得溶液和可能出现的沉淀都加入一个吸附柱ac中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
(10)加入500μl抑制物去除液ir，12,000rpm离心30秒，弃废液。
(11)加入600μl漂洗液wb(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
(12)加入600μl漂洗液wb，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。
(13)将吸附柱ac放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(14)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100～150μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液可事先在65～70℃水浴中预热)，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要dna浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低dna洗脱效率，减少dna产量。
(15)dna可以存放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。
2.重亚硫酸盐处理dna
上述基因组dna，用德国qiagen公司的甲基化试剂盒epitectbisulfitekit(48)进行重亚硫酸盐处理，操作按照说明书进行。
用无rna酶水将重亚硫酸盐混合物溶解，按表1所示的反应体系将相应物质加入200μl的pcr管(130μl体系)：
表1pcr反应体系
充分混匀，室温放置15～25分钟，然后在pcr仪上进行下述pcr程序反应：95℃5分钟，60℃25分钟，95℃5分钟，60℃85分钟，95℃5分钟，60℃175分钟，最后进入20℃维持。
将pcr管取出，稍离心后，将内容物转到1.5mleppendorf管，加入560μl新鲜bl缓冲液，bl按10μg/ml的浓度加入载体rna，充分混匀，稍离心后将以上内容物转入离心柱室温，以最大速度离心1分钟，弃去离下的液体，将离心柱重新放回收集管，用500μlbw液洗涤一次，加入500μlbd液，室温放置15分钟，室温，最大速度离心1分钟，然后用bw液洗涤两次(每次500μl)，然后空离1分钟以尽量去除残留液体，将离心柱盖子打开，放入新的1.5mleppendorf管，56℃放置5分钟，向离心柱的膜上滴加20μleb液，室温15000g离心1分钟，即得处理后的待测dna。
3.以步骤2得到的待测dna作为模板，用相应的引物对分别来进行定量pcr。
(1)取0.2mlpcr管，配制如表2所示的反应体系，每个反转录产物配制3管。
表2m-lad1引物pcr反应体系
表3u-lad1引物pcr反应体系
(2)取0.2mlpcr管，配制如表4所示的反应体系，每个反应体系配制3管。
表4内参基因atcbpcr反应体系
其中，actb基因及探针引物如下：
actb-fgtgatggaggtttagtaagtt
actb-rccaataaaacctactcctcccttaa
探针引物accaccacccaacacacaataacaaacaca
(3)pcr扩增
预变性95℃，10min；
循环(40次)95℃，15s→60℃，60s；
溶解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃。
(4)融解曲线分析
运行sds软件，并设定融解曲线程序：95℃15s；60℃15s；95℃15s。
4.结果分析
实时荧光定量pcr结果分析：扩增完毕后，进入结果分析界面，看ct值、起始拷贝数、标准偏差和溶解曲线等。以atcb为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(rq值)，将rq值用于统计分析。如果检测位点出现甲基化，那么q-pcr会出现相应的荧光强度；反之在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点未有甲基化。
ct值的设定及相对表达量的计算：阈值是指扩增过程中荧光超过本底或基线时的一个临界数值，它可以间接反映起始cdna模板含量。阈值选择的基本要求为由测量的偶然误差导致测得的背景荧光信号大于阈值的概率小于10-5。当荧光信号大于阈值时，则可以肯定检测到的荧光信号是由pcr扩增所致。阈值循环数(thresholdcycle，ct)是指阈值横线与pcr扩增曲线的交点所对应的循环数。阈值及阈值循环数(ct)一般由软件自动生成。有时也可以循环次数值为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标而获得扩增曲线。本研究主要采用sds软件的自动分析结果，并采用相对定量法分析数据。
图2为从结肠癌患者粪便样本中提取的dna的扩增曲线和溶解曲线，溶解曲线为单一峰，溶解温度约为85.8℃。图3为内参基因actb的扩增曲线和溶解曲线。
进一步的，采用u-lad1的引物(lad1-uf、lad1-ur)对正常人的粪便样品进行反向验证，如果q-pcr在40个循环内出现相应的荧光强度，说明该位点为非甲基化状态；在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点为甲基化化状态。结果如图4所示，说明本发明所建立的lad1基因甲基化检测方法准确、可靠。
实施例2探针法
1.dna提取
操作同实施例1。
2.重亚硫酸盐处理dna
操作同实施例1。
3.实时定量pcr
以步骤2得到的待测dna作为模板，用相应引物对和探针分别来进行定量pcr。
(1)待测样品pcr反应体系
pcr反应体系的总体积为30μl。
pcr反应的程序为95℃，20min；50个pcr循环，每个循环中，先升温至62℃，5s，再降温至56℃，反应35s，最后升温至94℃，反应20s；50个循环反应后降温至40℃，反应30s，pcr反应结束。
每个pcr反应体系30μl，最终反应体系浓度达到：氯化镁(mgcl2)2.5mm，dntp0.25mm，lad1引物(lad1-mf、lad1-mr)350nm，阻断剂引物(如seqidno.11所示)100nm，lad1探针70nm(如seqidno.3所示的探针，序列的5’端标记fam，在其3’端标记tamra)，actb基因引物(上下游)170nm，actb基因探针70nm，dna聚合酶1.5u，dna模板2～20ng/μl，补充10×pcr缓存液buffer到总体积30μl。
其中actb基因的上下游引物、探针同实施例1。
(2)结果分析
实时荧光定量pcr结果分析：扩增完毕后，进入结果分析界面，看ct值、起始拷贝数、标准偏差等。以atcb为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(rq值)，将rq值用于统计分析。如果检测位点出现甲基化，那么q-pcr会出现相应的荧光强度；反之在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点未有甲基化。
实施例3探针法
1.dna提取
操作同实施例1。
2.重亚硫酸盐处理dna
操作同实施例1。
3.实时定量pcr
以步骤2得到的待测dna作为模板，用相应引物对和探针分别来进行定量pcr。
(1)待测样品pcr反应体系
pcr反应体系的总体积为30μl。
pcr反应的程序为95℃，20min；50个pcr循环，每个循环中，先升温至62℃，5s，再降温至56℃，反应35s，最后升温至94℃，反应20s；50个循环反应后降温至40℃，反应30s，pcr反应结束。
每个pcr反应体系30μl，最终反应体系浓度达到：氯化镁(mgcl2)2.5mm，dntp0.25mm，lad1引物(lad1-mf、lad1-mr)350nm，阻断剂引物(如seqidno.11所示)100nm，lad1探针70nm(如seqidno.4所示的探针，序列的5’端标记fam，在其3’端标记tamra)，actb基因引物(上下游)170nm，actb基因探针70nm，dna聚合酶1.5u，dna模板2～20ng/μl，补充10×pcr缓存液buffer到总体积30μl。
其中actb基因的上下游引物、探针同实施例1。
(2)结果分析
实时荧光定量pcr结果分析：扩增完毕后，进入结果分析界面，看ct值、起始拷贝数、标准偏差等。以atcb为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值(rq值)，将rq值用于统计分析。如果检测位点出现甲基化，那么q-pcr会出现相应的荧光强度；反之在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点未有甲基化。
进一步采用u-lad1的引物(lad1-uf、lad1-ur)对正常人的粪便样品进行反向验证，如果q-pcr在40个循环内出现相应的荧光强度，说明该位点为非甲基化状态；在40个循环内未有荧光出现的，那么说明改位点为甲基化化状态。
实施例4临床效果实施例
从50例结直肠癌手术切除癌组织、癌旁组织及其术前粪便中提取dna，应用实施例1的荧光定量法检测结直肠癌粪便lad1基因甲基化水平；以手术后病理诊断为标准，比较结直肠癌组织和粪便中lad1甲基化检测在结直肠癌诊断中的敏感性和特异性。
结果如图1所示，在126例结直肠癌中，癌组织lad1检出率为83.9％，癌旁组织检出率为8.1％，二者比较有统计学差异(p<0.01)，特异性为93.1％；结直肠癌粪便lad1基因甲基化检测结果与癌组织检测结果一致。结论结直肠癌组织lad1基因甲基化异常发生率高；粪便lad1甲基化异常可作为结直肠癌早期诊断的肿瘤标志物。
联合检测不仅能够发现晚期的结直肠癌患者，同时也不会漏诊早期患者，这对肿瘤疾病的早期发现、早期诊断、早期治疗具有重要的意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南理工大学
<120>一种检测粪便lad1基因甲基化的方法、试剂盒及应用
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>特异性引物lad1-mf
<400>1
gattatcgggtgtcgtagttc21
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>特异性引物lad1-mr
<400>2
ccctaacgcaacgtacgcg19
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>探针1
<400>3
tgagtagaataaggagagattat23
<210>4
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>探针2
<400>4
acaactaacacttaacattataac24
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>特异性引物lad1-uf
<400>5
agattattgggtgttgtagttt22
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>特异性引物lad1-ur
<400>6
aaccctaacacaacatacaca21
<210>7
<211>267
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>生物标志物核苷酸序列
<400>7
ggttgggtttattttagtgtattggcgaatggagtgggggcgcgcggggctggcgcgagg60
aaatggctgggtttttattggagattttatatttgcagggtttgttttggcgtaattaat120
gttgggtttggttgggctggcgctttggcgtttgtgatttatttggcagcttgcttagcg180
ctttggcttgctgcttgcgggctttggctgtattttgattagctgatgggctttgctttt240
gttttttgaaggatgagttttggttag267
<210>8
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>引物actb-f
<400>8
gtgatggaggtttagtaagtt21
<210>9
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>引物actb-r
<400>9
ccaataaaacctactcctcccttaa25
<210>10
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>actb探针
<400>10
accaccacccaacacacaataacaaacaca30
<210>11
<211>37
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>阻断剂引物
<400>11
attagttattatgttggattttgtggttaatgtgtag37