本发明涉及mir-210在胶质瘤中相关靶点验证的实验方法。
背景技术：
人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，约占成人颅内肿瘤的40％-50％。目前临床主要采用手术并辅以放疗、化疗等综合治疗。但胶质瘤病人(尤其是胶质母细胞瘤)的治疗效果仍不理想，病死率和复发率仍旧很高，是预后最差的肿瘤之一。近年来，尽管显微神经外科技术以及相关辅助治疗手段有了极大的提高，但治疗效果依然不佳，这主要与人脑胶质瘤快速的生长、浸润、侵袭及耐药有关，但其中的机制还不清楚。探讨胶质瘤的发病机理、明确其如何快速生长和侵袭的机制，一直是神经外科研究领域比较热门的话题。
目前的研究来看，肿瘤侵袭性主要涉及以下三个方面：(1)肿瘤细胞的黏附与迁移；(2)细胞外基质的降解(3)肿瘤新生血管的生成。胶质瘤的快速生长往往使肿瘤细胞处于缺氧的环境下，在缺氧环境下胶质瘤如何生长并且怎样继续向周围正常脑组织侵袭浸润的，目前的研究提示可能与肿瘤新生血管的生成有关，目前的研究提示hif-1通路在缺氧环境下调节肿瘤新生血管的生成中起重要作用。缺
氧诱导因子-l(hypoxiainducibiefactor-l，hif-l)是由semenzal993年在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的一种转录因子，缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体细胞中，由hif-lα和hif-lα构成异二聚体，其中hif-lα是主要的氧调节亚基[5]。hif-lα可和缺氧适应有关基因如血管内皮生长因子(vegf)等的启动子或增强子上的hif-l结合位点结合，促进这些基因的转录。人类实体肿瘤中常存在缺氧环境，已在多种恶性肿瘤及癌前病变中检测到hif-lα蛋白的过度表达，正常组织及良性病变中则无表达。在肿瘤发生早期即血管形成及侵袭发生之前即可发生hif-lα的过度表达，且与肿瘤生长、血管形成、侵袭转移有关。已证实hif-lα在缺氧介导的凋亡中及肿瘤细胞增殖起重要作用。在人脑胶质瘤中hif-1α通路同样发挥重要作用。micrornas(mirnas)是一类由17～27个核苷酸组成的内源性非编码小rna，通过结合目的基因mrna3`非编码区，使目的基因mrna降解或抑制mrna翻译。迄今为止，发现的人类mirnas超过2000个(http://www.mirbase.org/)。它们涉及许多相关的生物学进程，包括细胞增殖、分化、细胞周期调节等；同时在肿瘤分子病理学中也有许多应用，包括：肿瘤发生、分化、增值、细胞周期调节、血管生成、趋化、迁移、侵袭和凋亡。而其中研究与缺氧有关的mirna有mir-210、mir-20a、mir-20b、mir-214、mir-138、mir-145和mir-503等。我们前期研究中发现mir-210在人脑胶质瘤中受hif-lα，并且发挥调节细胞侵袭的作用。mir-210是染色体编号11p15.5区域的转录产物(http://www.microma.org/microma/)，与许多肿瘤缺氧下的生长、血管生成、侵袭和凋亡有密切关系。目前的研究结果提示，mir-210在多种肿瘤中都发挥着重要作用。rothe等人指出mir-210与乳腺癌的增殖、转移、侵袭和较差的临床预后相关，可以作为预测乳腺癌临床结果的潜在生物学指标[14]。camps等人报道了缺氧诱导的mir-210在乳腺癌中作为独立诊断因子，其表达水平与无病生存期和总体生存期呈现负相关，在单变量和多变量分析中尤为明显。此外,mir-210不仅仅与乳腺癌的预后有关，而且在乳腺癌转移侵袭方面也起重要作用。胰腺癌中，hif-lα诱导产生mir-210，并且mir-210与患者的预后具有密切关系。mir-210在肾透明细胞癌(ccrcc)中主要接受hif-1调节，但当hif-1缺失时，也接受hif-2的调节。iscu作为mir-210的靶点，其表达与mir-210呈现负相关。另外,mir-210在ccrcc中的表达与较好的临床预后以及肿瘤的低分期低分级相关联，这是意料之外的，因为很多研究报道都显示mir-210在肿瘤中的表达与较差的临床预后相关联。茶多酚(egcg)能够阻止hif-1α羟基化依赖的泛素化和随后的蛋白酶体介导的降解，从而诱导mir-210在肺癌中的表达，而mir-210的过表达能够影响肺癌细胞增殖和生长，并且mir-210的高表达预示较差的预后。在琥珀酸脱氢酶(sdh)突变型头颈部副神经节瘤(hnpgls)中,sdh的功能失调诱导hif不稳定表达。merlo等发现低氧可以诱导hif-lα的表达，然后hif-lα诱导肿瘤细胞过表达mir-210，进而调节下游靶点iscu的低表达，从而形成了一个hif-1α/mir-210/iscu信号轴，与sdh突变型hnpgls的发病机理密切相关。mir-210在卵巢癌中接受hif信号通路调控，低氧诱导mir-210的表达上调，进而抑制其下游靶点e2f3的表达，在肿瘤发生中作为低氧应答的重要调节因子而起重要作用。肝癌中，低氧/mir-210/血管膜蛋白1(vmp1)通路被证明在肝癌细胞低氧生存及侵袭中发挥重要作用，为消灭低氧环境下生存的肝癌细胞发挥重要价值。greither等人研究发现mir-210在软组织肉瘤(sts)中的表达与性别和肿瘤发病年龄有关。
目前临床上对于胶质瘤分级，一般根据2007世界卫生组织(who)标准将胶质瘤分为四个级别：毛细胞星形细胞瘤(whoⅰ级)，弥漫性星形细胞瘤(whoⅱ级)，间变性星形细胞瘤(whoⅲ级)，胶质母细胞瘤(gbm,whoⅳ级)。而其中胶质母细胞瘤占一半以上,并且平均生存期小于15个月。所以细胞实验往往选取具有代表性的胶质母细胞瘤细胞系进行验证。近年来高通量的蛋白芯片技术的普及，大大提高了相关下游靶点的检出和筛查的效率。而相关的技术也在成熟。同时相关数据库的应用也为我们寻找靶点提供方便。
本发明通过临床检测和相关生物学实验，研究低氧下mir-210通过调节下游靶点，找到胶质瘤可以在低氧下生长、迁移和侵袭的秘密。本发明已经发现mir-210在胶质瘤中的表达可以作为检测肿瘤进展，判断肿瘤预后和治疗肿瘤的手段，并且只有在星形胶质细胞起源的胶质瘤才适合。本发明同时研究了mir-210的一个典型靶点rod1在胶质瘤中的作用。但是，就目前研究水平来看，仍然遗留诸多问题亟待解决。首先，对于mir-210在胶质瘤中的研究还是比较少，其次，胶质瘤中mir-210靶点的还不清楚，不能为胶质瘤的治疗提供作用靶点。要对mir-210形成一个系统的认识，对其下游靶点确认必不可少，确认下游靶点，完整信号通路会更加清晰地显示mir-210的调控影响生理和病理过程的机制，从而更加方便的投入到临床应用。特别是近年来，随着小核酸制药技术的不断发展，尤其是核酸药物靶向递送技术的迅速发展大大降低了药物载体的毒性和提高了药物输送的稳定性和靶向性，使小核酸成药并应用于临床治疗成为可能。最后，mir-210作为一种特异性缺氧相关的mirna，有望为胶质瘤的治疗提供新的靶点，为小核酸药物的研发提供新的方向。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：通过蛋白芯片技术和数据库的对照，筛选胶质瘤中mir-210对应的靶点，证实胶质瘤中mir-210的可能作用机理。
为了解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
利用胶质瘤细胞系，分别构建mir-210过表达细胞组、mir-210低表达细胞组及空质粒细胞组，通过real-timeqpcr，westernblotting实验检测mir-210对下游基因的影响程度，检测靶点蛋白和其基因的表达水平。并通过mtt、侵袭、迁移等试验明确mir-210的相关生物学作用。并且通过报告基因明确靶点是否正确。
更具体的，可以采用如下实验步骤：
1.质粒构建、细胞模型的建立
mir-210mimics和inhibitors以及空白mirna-fitc购自广州锐博生物。u251和u87-mg胶质瘤细胞系分别培养至24孔板，转染前2小时换无血清培养基，用脂质体2000(lipofectamine2000transfectionreagent，invitrogen)包裹质粒后转染入细胞，6小时后换液，24小时后荧光显微镜下观察fitc表达，通过对比可见光视野和荧光视野计算转染效率，密切观察细胞生长状况及活力。第1天，将另一组细胞分别抽取约1×105细胞滴至35mm孔板，2-4天每天换液。通过上述处理，建立mir-210过表达细胞系、mir-210低表达细胞系、空白质粒细胞系以及空白对照细胞系。
2.荧光定量rt-pcr：
将待测各组细胞系抽提总rna(trizol，invitrogen)，抽取50μl总rna，nanodrop2000紫外分光光度计(nanodrop公司)计算浓度和纯度，当oda260/a280比值在1.8-2.0之间时，才被认为提取的rna纯度较高。琼脂糖电泳观察rna完整性。再进行荧光定量rt-pcr反应，确保提取的rna的纯度和浓度。采用primescriptrtreagentkit(takara)进行逆转录得到cdna，利用pcr试剂盒(quantifastsybrgreenkit,qiagen)及合成的靶点蛋白pcr引物(invitrogen)进行pcr观察靶点在细胞系中的表达水平，重复试验3次。
3.蛋白印迹法检测蛋白表达：
实验细胞系经裂解后提取总蛋白，离心后取上清液进行sds-page电泳，阳极碳板100v，1h转pvdf膜，封闭后加一抗孵育，抗体封闭、漂洗，再加二抗孵育，ecl底物显色，x-光片曝光显影，gapdh作为对照，观察转染后靶点蛋白表达量，重复试验3次。
4.流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡及增值情况：
将实验组细胞系分别用0.25％胰酶消化，经水平离心机2000rpm，离心15min，收集细胞，弃培养基，冷pbs洗涤细胞两次。根据细胞凋亡检测试剂盒说明书，用400μl1*bindingbuffer悬浮细胞，浓度大约5*10cells/ml。在细胞悬浮液中加入5μlannexinv-fitc,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下15min，加入10μlpi后混匀于2-8℃避光条件下孵育5min。冷pbs稀释至2ml。流式细胞仪设置激发波长488nm，首次实验需分析经annexinv、pi分别单染的细胞来调节荧光补偿去除光谱重叠。根据未处理细胞空白对照和经annexinv、pi分别细胞染色后的单染对照的分析设定标准。上机重复试验3次。
5.侵袭实验：
把mir-210过表达组、mir-210低表达组、空白质粒细胞系以及空白对照组分别放入6-孔培养皿进行培养，培养皿两侧分别接种细胞，进行划痕，继续培养直到培养皿中两边细胞有80％-90％的融合，分别取0和24h各组融合情况的图片，应用公式[融合率＝(宽度0h-宽度24h)/宽度0h×100％]计算融合率。
6.细胞迁移实验：
在transwell上室的聚碳酸酯膜上先加入1：2(matrigel：dmem)稀释后的matrigel60μl，置37℃30min使matrigel聚合成凝胶。在transwell下室中加入趋化因子(细胞培养液)600μl；待检细胞无血清培养液制成单细胞悬液，在室孔中加人l×105个细胞，细胞悬液体积100～200μl，每组细胞平行做三孔；置于5％co2培养箱于37℃培养12h。取出上室，弃去上室液体，用湿棉签擦去膜上面未穿过膜的细胞。苏木精染色，冲洗干净后clearmont双侧封片，80℃烤干。倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞，每张膜中央和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过8μm微孔的细胞数。
7.报告基因
构建靶点蛋白的报告基因质粒。将报告基因质粒与目的质粒一起转染入试验细胞。将报告基因细胞裂解液充分混匀，加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。融解萤火虫荧光素酶检测试剂和renilla荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。renilla荧光素酶检测底物置于冰浴或冰盒上备用。按照每个样品需100微升的量，取适量renilla荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入renilla荧光素酶检测底物(100x)配制成renilla荧光素酶检测工作液。按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。在完成上述测定萤火虫荧光素酶步骤后，加入100微升renilla荧光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定rlu(relativelightunit)。在以renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的rlu值除以renilla荧光素酶测定得到的rlu值。查看目的蛋白的转录活性。
本发明的技术效果在于：
利用蛋白芯片、现有数据库和靶点预测工具，探索胶质瘤中mir-210作用的明确靶点，明确mir-210调节胶质瘤低氧环境下生长和侵袭的机制。
许多研究表明mirnas参与了肿瘤的调控，自发现mir-210以来，对其研究越来越火热。mir-210在调节细胞低氧应答方面起关键作用。而近年来高通量的蛋白芯片技术的普及，大大提高了相关下游靶点的检出和筛查的效率，相关的技术也逐渐成熟。同时数据库的应用也为我们寻找靶点提供方便。本发明利用新型蛋白芯片技术结合数据库，通过临床检测和相关生物学实验，探索低氧环境下mir-210通过调节下游靶点，影响胶质瘤生长、迁移和侵袭的机理。westernblotting，pcr等分子生物实验检测相关rna和蛋白表达水平，细胞培养和细胞功能实验分析其作用并验证。同时研究了mir-210的一个新型靶点rod1在胶质瘤中的作用。探索mir-210及其作用相关靶点在胶质瘤发生发展中起到的影响和作用在国内外未见报道。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的技术路线图；
图2为pcr检测mir-210在正常脑组织和不同级别胶质瘤中的表达。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1-2所示，1.临床标本收集和细胞系培养
过去收集的南京医科大学附属无锡市第二人民医院手术切除的初次诊断为胶质母细胞瘤患者肿瘤组织标本，洗去血凝块及电凝的坏死的组织，迅速放入液氮，保存于我院标本库(-80℃)中。取30例胶质母细胞瘤标本和10例正常脑组织标本进行蛋白芯片实验。胶质瘤细胞系(u87和u251)来源于南京医科大学生物医学实验室。选取u251及u87-mg等胶质瘤细胞系，应用加入10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的d-mem高糖培养基进行培养，分别分成正常组和低氧组，正常组置于5％co2和37℃进行正常培养，低氧组置于2％o2、5％co2、93％n2和37℃进行培养。取每个细胞系中低氧组细胞和正常组细胞各三组进行蛋白芯片实验。
2.蛋白芯片分析：
将组织及细胞分别裂解提取蛋白，用标本稀释液将待测标本稀释20倍，将蛋白芯片(tumorsuppressorsarray，fullmoonbiosystems)取出置于保湿盒中，按照说明书在相应格中加入待检标本个20μl，37℃水浴30min，洗涤后每格加20μl荧光标记抗体，再次37℃水浴30min。室温晾干后放入微阵列扫描仪(4000b，genepix)设置激发波长532nm，每张芯片重复扫描5次，每组重复3次。将细胞中获得的靶点数据和david数据库比较，然后和组织标本中的数据进行比对，选出表达趋势一致的靶点蛋白，并且通过targetscan等靶点预测软件筛选可能相关的多种蛋白。然后进行后续的细胞学验证。
3.质粒构建、细胞模型的建立
mir-210mimics和inhibitors以及空白mirna-fitc购自广州锐博生物。u251和u87-mg胶质瘤细胞系分别培养至24孔板，转染前2小时换无血清培养基，用脂质体2000(lipofectamine2000transfectionreagent，invitrogen)包裹质粒后转染入细胞，6小时后换液，24小时后荧光显微镜下观察fitc表达，通过对比可见光视野和荧光视野计算转染效率，密切观察细胞生长状况及活力。第1天，将另一组细胞分别抽取约1×105细胞滴至35mm孔板，2-4天每天换液。通过上述处理，建立mir-210过表达细胞系、mir-210低表达细胞系、空白质粒细胞系以及空白对照细胞系。
4.荧光定量rt-pcr：
将待测各组细胞系抽提总rna(trizol，invitrogen)，抽取50μl总rna，nanodrop2000紫外分光光度计(nanodrop公司)计算浓度和纯度，当oda260/a280比值在1.8-2.0之间时，才被认为提取的rna纯度较高。琼脂糖电泳观察rna完整性。再进行荧光定量rt-pcr反应，确保提取的rna的纯度和浓度。采用primescriptrtreagentkit(takara)进行逆转录得到cdna，利用pcr试剂盒(quantifastsybrgreenkit,qiagen)及合成的靶点蛋白pcr引物(invitrogen)进行pcr观察靶点在细胞系中的表达水平，重复试验3次。
5.蛋白印迹法检测蛋白表达：
实验细胞系经裂解后提取总蛋白，离心后取上清液进行sds-page电泳，阳极碳板100v，1h转pvdf膜，封闭后加一抗孵育，抗体封闭、漂洗，再加二抗孵育，ecl底物显色，x-光片曝光显影，gapdh作为对照，观察转染后靶点蛋白表达量，重复试验3次。
6.流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡及增值情况：
将实验组细胞系分别用0.25％胰酶消化，经水平离心机2000rpm，离心15min，收集细胞，弃培养基，冷pbs洗涤细胞两次。根据细胞凋亡检测试剂盒说明书，用400μl1*bindingbuffer悬浮细胞，浓度大约5*10cells/ml。在细胞悬浮液中加入5μlannexinv-fitc,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下15min，加入10μlpi后混匀于2-8℃避光条件下孵育5min。冷pbs稀释至2ml。流式细胞仪设置激发波长488nm，首次实验需分析经annexinv、pi分别单染的细胞来调节荧光补偿去除光谱重叠。根据未处理细胞空白对照和经annexinv、pi分别细胞染色后的单染对照的分析设定标准。上机重复试验3次。
7.侵袭实验：
把mir-210过表达组、mir-210低表达组、空白质粒细胞系以及空白对照组分别放入6-孔培养皿进行培养，培养皿两侧分别接种细胞，进行划痕，继续培养直到培养皿中两边细胞有80％-90％的融合，分别取0和24h各组融合情况的图片，应用公式[融合率＝(宽度0h-宽度24h)/宽度0h×100％]计算融合率。
8.细胞迁移实验：
在transwell上室的聚碳酸酯膜上先加入1：2(matrigel：dmem)稀释后的matrigel60μl，置37℃30min使matrigel聚合成凝胶。在transwell下室中加入趋化因子(细胞培养液)600μl；待检细胞无血清培养液制成单细胞悬液，在室孔中加人l×105个细胞，细胞悬液体积100～200μl，每组细胞平行做三孔；置于5％co2培养箱于37℃培养12h。取出上室，弃去上室液体，用湿棉签擦去膜上面未穿过膜的细胞。苏木精染色，冲洗干净后clearmont双侧封片，80℃烤干。倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞，每张膜中央和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过8μm微孔的细胞数。
9.报告基因
构建靶点蛋白的报告基因质粒。将报告基因质粒与目的质粒一起转染入试验细胞。将报告基因细胞裂解液充分混匀，加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。融解萤火虫荧光素酶检测试剂和renilla荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。renilla荧光素酶检测底物置于冰浴或冰盒上备用。按照每个样品需100微升的量，取适量renilla荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入renilla荧光素酶检测底物(100x)配制成renilla荧光素酶检测工作液。按仪器操作说明书开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。在完成上述测定萤火虫荧光素酶步骤后，加入100微升renilla荧光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定rlu(relativelightunit)。在以renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的rlu值除以renilla荧光素酶测定得到的rlu值。查看目的蛋白的转录活性。