本发明涉及猪分子标记制备技术领域，具体涉及trim63基因片段作为母猪肢蹄骨密度snp分子标记。本发明的分子标记克隆自trim63基因，所述的分子标记可用于猪肢蹄骨密度性状的检测。
背景技术：
在现代化规模化养猪行业中，猪的肢蹄病俨然已经成为猪群中常见的、复杂的问题之一，且见于所有日龄的猪。heinonen等研究结果表明因肢蹄病淘汰的母猪占所有淘汰的母猪的20-50％，且后备母猪和青年母猪蹄甲更易磨损而引发蹄壳破裂(heinonenm,oravainenj,orrot,etal.lamenessandfertilityofsowsandgiltsinrandomlyselectedloose-housedherdsinfinland.veterinaryrecord,2006,159(12):383-387)；王超等对广西某公猪站中淘汰的647头公猪进行了统计分析，结果表明由于肢蹄病造成的淘汰率最高为32.15％，且发病率因品种而异(王超等，广西公猪站公猪淘汰原因及在群猪肢蹄病发病规律调查研究，中国饲料营养学术研讨会.2014)。同时由于生产成本的限制，猪的肢蹄一旦出现问题，只有极少数能够被治愈(郭春艳，浅谈母猪肢蹄病的发病原因及防治措施[j]，农家致富顾问,2017(16):20-20)，绝大多数则采取淘汰措施，给猪养殖业造成了巨大的经济损失。
肢蹄结实度，是指肢蹄健康程度和四肢运动协调程度的综合反应，一般用其对立面即肢蹄软弱(legweakness)来表示(林亦孝，谈谈种猪肢蹄结实度[j]，江西畜牧兽医杂志,2003(4):14-14)。猪的肢蹄结实度是一个数量性状，且遗传因素是最重要的影响因素之一(候利娟等，猪肢蹄结实度的遗传解析进展，猪业科学2013:94-7)。trim63基因又被称为肌肉特异性无名指蛋白1(murf1),是主要在肌肉组织中表达的e3泛素连接酶,能够介导糖皮质激素诱导促进成骨细胞分化(azumak,uranot,ouchiy,etal.glucocorticoid-inducedgenetripartitemotif-containing63(trim63)promotesdifferentiationofosteoblasticcells[j].endocrinejournal,2010,57(5):455-462.)。
根据2000年美国国立卫生研究院(nih)共识声明，骨质疏松症(osteoporosis，op)定义为以骨强度受损为特征的骨骼疾病，并伴有骨折增加的风险。骨矿物质密度(bonemineraldensity，bmd)是目前被认为评价骨生长的重要参数，并且与骨折风险和结构健全相关(程晓光，骨密度测量和骨质疏松诊断[j]，国际内分泌代谢杂志,2005,25(5):308-310)。骨折的发生率随着骨矿物质密度的降低而增加，因此以骨矿物质密度作为评估骨脆性风险具有很强的特异性。目前骨密度临床测定方法主要有单光子吸收仪、超声波仪、双能x射线(dexa)和电子计算机横断层扫描(ct)(曹健，骨密度(bmd)测定的应用评价[j]，医药前沿,2013(2))。由于动物活动的不确定性和体型区别，通常双能x射线和电子计算机横断层扫描应用最广泛、准确，但其设备价格昂贵(刘珺，双能x线骨密度仪与定量ct测量骨密度的比较研究[d]，中南大学学报,2005)，且操作十分麻烦，大大限制了其在动物骨密度研究中的应用。而超声波骨轴传播技术不仅能够测定动物骨密度，在一定程度上还可以反映动物骨强度及骨结构的情况，具有简便、无辐射损伤、重复精度高、且价格便宜，易于携带的优点(孙涛等，骨密度无损测定方法简介及其最新进展[j]，中国医疗设备,2009,24(1):49-51)。
本发明中发现的snp与猪肢蹄骨密度性状的相关性达到了显著水平，为家猪肢蹄结实度性状的研究提供了新的遗传资源。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供trim63基因片段作为母猪肢蹄骨密度snp分子标记，以完善家猪抗病育种分子标记。本发明利用50k的基因芯片对snp进行分型，并使用全基因组关联分析(gwas)筛选与母猪肢蹄相关的snp，为猪的抗病育种提供新的标记资源。
本发明的技术方案如下所述：
申请人通过基因分型技术并参阅ensembl数据库，得到登陆号为alga0103829基因的单核苷酸位点突变的上下游片段2300bp的核苷酸序列，进而发展成为如seqidno:1所示的核苷酸序列的分子标记。具体序列为：
gatgttgattttctcgtcttcgtgctccttgcacatggggtggctgcccttctgcaggggccgactgcagaggagaagagtcatgagtcacgaggtgaggatctcaagttcccgtctgccccccgcgccagccccaggaggccaccacagacctgtgactccagttctcagggcttgcctgtccccatccttttcttttcatcctctgaggacccaagaccatgagagccaatgacaccaaggctaggattcaaactccagtgatggagttgaacttgggccctgatagcacaggatgtgggaagggctgtaggatcccaaagtcaatttgagacattttcaagaagaggaaactgggttccagaaaggtgaattgacttgcccaaggtcacccagcaagtcagggcaagggaggctagagttcatttgctctaattatagtctccatagctcttggttacagcaggccgggcgctgagcaaagtaatttatactcatggcctcactgaattctatatttaatccactagactgtaatctccatcaaagcagggaaacttgcctgtccctgaatctgcagtgtacagtgcctggcgcagagaaggtggtcattaaatacaggcagaaaaataaatggggaagcatgccatgagggtgccctgaggctccgagaaggaggtggtatgtgtgccccaagtcacacagctagaacatgggccatcagggcgtccaacagcccagcacaagccttgacttctagtccagaaattttttccagggtccagaatcacttctttgccttttttcccaaatacacacgttttttggtgtgtgtctgctgcatatggaagttcccaggccagggatcaaacttgagccatagcagtaacctgagccacagcagtgacaatgccgagtccttaaatgctagggcagggaactccccaaatacacactcttagaatgactttctccctctgtctctctctttgcttcaggcttctggcatgttcttctgtgcttctctcagggtcacttcctacctgagattcagtttttggagtctaggtcttaccgctccagctatacattatactctcatttagagccaatagcatgtctacaccatctctgagttcccaatctcataaagggtgaatcgtccccatctgtgtcagtgcctcacctccaaacagccttgcatgactgatctcaccctgatcacagacctcaaggtcttaaataagcccctttccagacttgtctttttgcatctttcagcccaccccacccccaccccatgccggcagggctgtgcctttgccacctgtctctacccccgggaagggatctcgaggagggcagtaggtacagaggtgaggcaagatcctgggggtctggtgcctctgtcctccaccatcccagatgccatcctcccaatcccaggtgccagcatctgggatcaagtccagattgatctgccacttatttactgggaacttggacaagtgattttacctctctgagccttgcttttatcccagagctagtgggatcctggcaggagttgtctgtaatgattgcatagtgcctggcacagagcagatcctctgcaactatcatcatccttcaactgtgtagaaagacctcgaagggttcaaacactaggttcttcctaggtcaacactgggtgggctaatattttggtacaatattggttttattatgattattattatcacgatcgacaatataattgaatttttgcagtgttgaactctagcaacctgacaggcagtagaagtgacaaatgtccactatggagtcaatcagacaggcttcttctcggcttcgccactggctagctgagtggcctcggccaaacgtctgcctgcagaaaggcacttggtgatggtttgggaccacaaggggcatgaggttagagtctggaggtcctgattgtaaagctatctccctggtagctctgtctctccccctggatctgaggcccaacactgcacagcctccaccactcacaaattctgcctgagaatgagctgctgtttcacaagcaaggagacttggaaccggatggatggggccgagcaattctgcttctcggctgggaaagcttgggtaattgacttcacctctttgagcctcagcttgctcatccgtaaagtagggatgatggtccacaggactgctctgaagcagcagcgagaagcagccccagtgtctggcgctgtagttatcacctcggggaaactggctctgttctgtgtgctttcttgcttatcr(a/g)gggccactgagctggccccagtgcctctgtctccctctcgcatctcatccttcccctggtttctgtctcaggagggcagcttaatgtctgggtcccctcccattcaccgagtgacaccgagagccagggttcagggataagatgagctgctgttcctgcctgagcaagagggctggctccgggctggatgaaggggaacagagcctcggggagccaggctcagaggacaggctggggaggaaggacggcctcccagccgctggaaaaccgacctggagcactcctgcttgtagatgtcaatgatgttctccaccagcagattcctctgcaggccgtacactccgtgacggtccatgatcacctcatggcggcaggagggacagcggaaacggcctccggacatggacaccgagccactccggctggtccagtagggatttgcagcctgctggtgacaagggcaggggtgaggcctgggctccctcctcagtcccttcccctttctgatctcccaccagccttctcctgcttaccgccaagaattctcatcaagtcacaggacttaaagctccccgtcctgggaggatatgtgaaaaagaatgtatgtatatgtatatatgtagtatgactgggtcactttgctgtacagcagaaactggcacaacattataaattaactatactttaatttaaaaaaagtgaggtggttccggttgtggtgcagctgtaatgaacccgactagtattgattagtatccatgaggacagggttcgatccctggcctcactcagtggattaaggagcttgcattgccatgagctgtggtgtaggtcgcagatgaggcttggatcccgtgttgctgtggctgtagtgtaggccagaagctgcagctccaattcagcccctagcctgggaacttccatatgccatgggagtggccctaaaaagcaaagaaaaaaaaaaggtaaatctccccatcctgagatgagagaacagtcacttacacagggagcatctgaggagtgactaagcaatcaacaggtttggaggtcaacagacctaggttcaagtcccagtaattctctcaatgactttgagcgagcaaccttctctctctaagcctcagtttgcccattcattaaatgggcctataattagagccagctcatagggctgctactttattatttatctatttctttattttagccatggccactgcctgtggaagttcctgggccagagatcaaacccacaccatagcagtgacaacgctgaatccttaaccacctggccaccagggaactccctagggctgcagctttaaaaacaaagtagtgagaggacatgttgtgaagtgcttctgggggaatcaggagcactttcttagggagaggaagcctctcctgccccatagtataggaaacagcttcaaaaaggaagatgcctctactgcccagggcctctcggccaccgggccacccctctcctaaagctctgggccccctgccacctcccagctggctccagcccctggggtctggtttctctctcctctctgcttgcctctcccacttatcgcttgaggcatttgactcctgattggagagtcaacggctgctcagggcaggggtggggtagctgcaggcagggtcgggaggggacatgtgcgtcatggagaaggaatggggcagccagagctgcctccctagccccctcagccccttccagaagcctccggagcagccattcacttcagcagggaaacaaccccaggctggaaggggcccgggctaagcaagaagtgctctttgcatttccatcacgggtaaactgagtagccacttgggacccccggactaggccatgcccagcactgacctggaagatgtcgttggcacactttcggcagaggttgtgctgacacggcaagatgaccaccggcttggtaaacatctccaggcagatggggcagatcagctgcttctccaggttctccatggggttcccatcctggatcaggcttgacttataatccatattgttgggagacgtggggacccgcctggctgcctccttcacctgctctaagcaaacctggggtcttgcctttgtcacaaaatacccacccggagcctctttgccctcttctcctggcgcctgaattctgtcttggtctgaggcccctctgatatttatagctgaaccccggtcacatgagccccaggaggggaccagctgagcattccggtgccaagtggctggcgaggcttgagtttcctccaagcctgaaagactg，
上述序列的第2301位碱基处的r是a或g的等基因突变,该突变使seqidno：1序列产生了核苷酸多态性。
申请人将该上述序列作为检测与猪肢蹄骨密度性状相关的分子标记,而且当seqidno：1上的第2301位核苷酸为g时，可判定母猪的肢蹄具有更高的骨密度。
上述序列可以作为检测与猪骨密度性状相关的分子标记。
申请人提供了一种筛选猪骨密度性状相关snp分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：
①按照常规方法提取猪耳朵基因组dna，并对dna进行质量检测。
②利用基因芯片技术进行分型(该技术的详情参见说明书末尾的附录)。
③采用基于单标记关联回归模型的方法，以个体性别作为固定效应，在利用r统计环境下的enabel软件包进行gwas分析。具体的回归模型如下：y＝xb+sa+zu+e，其中y代表“表型值向量”(thevectorofphenotypes)；b代表“固定效应(包括性别)的估计值及表型值均值μ”；α代表“snp的替换效应”；u代表“随机加性遗传效应”；服从多维正态分布，u～n(0,gσα2)，g表示基因组相似度矩阵(基于snp标记)，g表示多基因加性方差(通过此进行遗传力的估计)；x、s、z分别为b、α、u的关联矩阵(incidencematrix)；e代表“残差向量”(avectorofresidualerrors)，服从正态分布，e～n(0,iσe2)，表示残差方差。
本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的的对猪肢蹄骨密度相关基因的基因型或与猪肢蹄性状中的骨密度之间的关联分析中，为猪骨密度性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记资源。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的肢蹄结实度，与目前的pcr-rflp等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。
更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。
附图说明
序列表seqidno：1是本发明克隆的包含登陆号为alga0103829基因上下游2300bp核苷酸序列的片段，该片段即是本发明筛选的分子标记(序列长度为为4601bp，在该序列的2301位碱基处的r存在一个a/g等位基因突变)。
图1：本发明的总体技术流程示意图。
图2：是本发明克隆的alga0103829基因上下游2300bp核苷酸序列(本发明分子标记的核苷酸序列)。附图标记说明：在图2显示核苷酸序列的第2301位碱基处存在一个a/g等位基因突变(2301bp处的英文字母“r”为突变位点)。
图3：是本发明的曼哈顿图。附图标记说明：黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于猪第6号染色体上的trim63基因的第一个内含子上。
具体实施方式
实施例1：基因分型检测
(1)利用试剂盒法提取骨密度相关群体的耳朵组织dna
本实施例采用tianampgenomicdnakit血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒，离心柱型，由天根生化技术(北京)有限公司生产。
1)将待检的猪骨密度相关群体(品种为大白猪、长白猪，由广西扬翔股份有限公司提供；但实施本发明不限定上述品种)的耳样组织，用眼科剪剪碎至糊状，加入200ulga(本实施例的试剂盒自带的试剂)，并震荡混匀；然后放入56℃水浴锅中消化过夜。
2)将消化后的组织样加入200ul缓冲液gb(本实施例的试剂盒自带的试剂)，充分颠倒混匀，并70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管壁上的水珠。
3)加入200ul无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管壁上的水珠。
4)将上一步所得溶液及絮状沉淀一并加入吸附柱cb3中，并将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放回收集管中。
5)向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(本实施例的试剂盒自带的试剂)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中。
6)向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(本实施例的试剂盒自带的试剂)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中，并重复该步骤。
7)将吸附柱cb3置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中剩余的漂洗液。
8)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，并向吸附柱膜中间部位悬空滴加50-200ul的洗脱液te(本实施例的试剂盒自带的试剂)，室温下放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)snp基因型的判定及质量控制
使用50k基因芯片(具体步骤见说明书文末)进行分型，并对基因型数据进行质检，最终有879个个体和48909个snp用于gwas研究。
实施例2：alga0103829分子标记分型方法在猪肢蹄骨密度性状关联分析中的应用(1)alga0103829分子标记分型结果与肢蹄骨密度性状关联分析
用于基因型与肢蹄骨密度性状关联检测分析所用的试验猪群来自广西扬翔股份有限公司培育的纯种母猪群体，包括大白猪、长白猪。基因分型所用的dna由纯种大白猪、长白猪(说明书正文和表中所称的“纯种大白猪、长白猪”简称“猪”)耳样提取。采用基于单标记关联回归模型的方法，采用个体的性别作为固定效应，在利用r统计环境下的genabel软件包进行gwas分析。
具体的回归分析模型如下：y＝xb+sa+zu+e
其中：y代表“表型值向量”(thevectorofphenotypes)；b代表“固定效应(包括性别)的估计值及表型值均值μ”；α代表“snp的替换效应”；u代表“随机加性遗传效应”；服从多维正态分布，u～n(0,gσα2)，g表示基因组相似度矩阵(基于snp标记)，g表示多基因加性方差(通过此方差进行遗传力的估计)；x、s、z分别为b、σ、u的关联矩阵(incidencematrix)；e代表“残差向量”(avectorofresidualerrors)，服从正态分布，e～n(0,iσe2)，表示残差方差。
关联分析结果见表1。
表1alga0103829基因片段的多态性对不同基因型母猪骨密度的影响
表1说明：p<0.05为差异显著；p<0.01为差异极显著。
由表1可知，基因型为ag的个体肢蹄骨密度极显著高于aa个体，所以g是有利于骨密度增加的等位基因。
附录：关于基因芯片技术的说明：
本发明使用illumina公司研制geneseekporcine50ksnp芯片扫描，该芯片包含超过50000个snp位点，覆盖猪的基因组。此芯片整合了大白猪和长白猪的基因差异，能提供足够的snp密度，可应用于全基因组关联分析中。
主要参考文献
[1]郭春艳，浅谈母猪肢蹄病的发病原因及防治措施[j]，农家致富顾问,2017(16):20-20；
[2]候利娟等，猪肢蹄结实度的遗传解析进展，猪业科学2013:94-7；
[3]程晓光，骨密度测量和骨质疏松诊断[j]，国际内分泌代谢杂志,2005,25(5):308-310；
[4]曹健，骨密度(bmd)测定的应用评价[j].医药前沿,2013(2)；
[5]林亦孝，谈谈种猪肢蹄结实度[j]，江西畜牧兽医杂志，2003(4):14-14；
[6]刘珺，双能x线骨密度仪与定量ct测量骨密度的比较研究[d]，中南大学学报,2005；
[7]孙涛等，骨密度无损测定方法简介及其最新进展[j]，中国医疗设备，2009；
[8]王超等，广西公猪站公猪淘汰原因及在群猪肢蹄病发病规律调查研究，中国饲料营养学术研讨会，2014；
[9]azumak,uranot,ouchiy,etal.glucocorticoid-inducedgenetripartitemotif-containing63(trim63)promotesdifferentiationofosteoblasticcells[j].endocrinejournal,2010,57(5):455-462.
[10]heinonenm,oravainenj,orrot,etal.lamenessandfertilityofsowsandgiltsinrandomlyselectedloose-housedherdsinfinland.veterinaryrecord,2006,159(12):383-387。
序列表
<110>华中农业大学
<120>trim63基因片段作为母猪肢蹄骨密度snp分子标记
<141>2018-05-02
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>4601
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(4601)
<220>
<221>mutation
<222>(2301)..(2301)
<400>1
gatgttgattttctcgtcttcgtgctccttgcacatggggtggctgcccttctgcagggg60
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