本发明属于法医学
技术领域：
，具体涉及基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒。
背景技术：
：推断人类生物学检材的来源在法医学实际检案中具有十分重要的意义。通过检测在不同群体间等位基因频率差异显著的snp位点，可推断人类生物学检材的地理来源。准确推断检材的地理来源能缩小排查范围，减少人力物力的付出，提高工作效率，辅助案件侦查。高原人群是指长期居住区域海拔在2500米以上的人群。中国的高原人群数量接近500万，集中分布在青藏高原及周边地区。高海拔环境具有寒冷和低氧分压的特点，海拔4000米的高原地区氧分压是低海拔地区的60％。低氧分压容易导致各种高原性疾病，如肺水肿，脑水肿以及红细胞增多症等。世代居住在高海拔地区的人群在选择压力下会产生相应的遗传学改变，从而适应高原缺氧环境。中国的高原人群与低海拔人群(长期居住区域海拔在2500米以下)相比，他们具备更好的有氧运动能力、更高的氧运输效率、更高的静息通气量、更高的血氧饱和度和不随海拔高度增加而显著升高的血红蛋白水平。这一系列的改变都有着相应的遗传学基础。研究发现，缺氧诱导因子在高原人群适应高原缺氧环境过程中发挥关键作用。全基因组关联研究在epas1和egln1等缺氧诱导因子的编码基因上发现大量高原人群和低海拔人群间等位基因频率存在显著差异的snp位点，其中以epas1基因的snp位点等位基因频率差异最为显著，有学者认为这是人类适应自然环境最极端的例子。epas1基因上高原人群和低海拔人群间等位基因频率存在显著差异的snp位点可用于推断人类生物学检材来自高原人群还是低海拔人群。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)是指基因组中特定核苷酸位置上的单个碱基突变引起的dna序列多态性，包括单个碱基的插入、缺失、转换和颠换等。snp标记被认为是继ssr和issr等标记之后的第三代新型分子标记，具有低突变率、高遗传稳定性、分布广泛和位点信息丰富等特点。将snp标记应用于法医学个人识别、亲子鉴定及检材来源推断的研究已经成为近年来研究热点。目前关于snp检测技术有单碱基延伸反应、大规模平行测序、sanger测序和snp芯片技术。大规模平行测序虽然可以发现更多的snp，但其成本较高，存在抽样误差，并且其准确率受测序深度及宽度的影响。而sanger测序步骤繁琐、成本高、耗时长、对待测样本dna的质量和含量依赖性很强，因此也难以广泛应用。在法医学领域，单碱基延伸反应技术已被广泛应用于snp遗传标记的分型。与一代测序法相比，该技术能够一次性复合检测多个snp，具有所需模板dna量少、扩增片段小(小于200bp)等优点，特别适用于骨骼、毛发样本、降解检材和微量检材的检测。与大规模平行测序相比，其具有成本低、操作简单、假阳性率低的优点。该技术可借助于法医学遗传实验室广泛使用平台-毛细管电泳平台进行检测，易于推广。因此，法医研究人员多采用单碱基延伸反应技术建立可同时分型多个snp位点的法医学检测体系。目前，已有研究开发了基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒和基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒，这些试剂盒可将中国男性个体样本正确归属至高分辨率的y染色体系统发育树上，从而推断未知男性检材的族源。由于这些试剂盒使用的是y染色体snp遗传标记，不能应用于女性检材的案件中，同时，这些试剂盒侧重于推测检材的族源，而不能判断出检材的地理来源，因此，目前仍需要开发能够快速检测女性检材族源或地理来源的检测试剂盒。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是：现有市场缺乏一种适用于女性检材的法医学检测试剂盒的问题。本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒。该试剂盒组成包括：分离包装的复合扩增引物混合物，多重单碱基延伸反应引物混合物和标准dna；所述的复合扩增引物混合物共28条；所述的多重单碱基延伸反应引物混合物共14条。其中，上述基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒中，所述的14个常染色体snp位点如表1所示。表114个常染色体snp位点表其中，上述基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒中，所述复合扩增引物混合物中各扩增引物的核苷酸序列如表2中的seqidno.1-seqidno.28所示。表2复合扩增引物混合物序列其中，上述基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒中，所述的多重单碱基延伸反应引物混合物中各引物的核苷酸序列分别如表3中的seqidno.29至seqidno.42所示：表3单碱基延伸引物混合物序列上表中，“-”符号前为加尾序列。其中，上述基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒中，还包括标准dna，所述标准dna为2800m标准dna。本发明还提供了一种上述基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒在区分高原人群和低海拔人群中的用途。所述的高原人群是指长期生活在海拔高于2500米的人群；所述的低海拔人群是指长期生活在海拔≤2500米的人群。本发明还提供了一种上述基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：a、提取待检测样本的dna，作为扩增模板；b、采用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤a提取的dna进行两个体系复合扩增；c、纯化步骤b的复合扩增产物，并以它为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行两个体系的多重单碱基延伸反应；d、用虾碱性磷酸酶(shrimpalkalinephosphatasesap)纯化步骤c的产物，再进行毛细管电泳分析，根据电泳结果获得样本的基因分型结果。其中，上述使用方法中，步骤b所述的复合扩增pcr的反应的循环参数为：95℃，15分钟；94℃，30秒，66℃-60℃，90秒，72℃，30秒，12个循环的降落扩增(touchdown-pcr)；94℃，30秒，60℃，90秒，72℃，30秒，17个循环；然后72℃，10分钟；4℃保存。其中，上述使用方法中，步骤c所述单碱基延伸反应的循环参数为：94℃，10秒，50℃，5秒，60℃，30秒，26个循环后4℃保存。本发明的有益效果为：本发明试剂盒包含14个常染色体epas1基因上高原人群适应高原缺氧环境相关的功能性snp遗传标记，这些snp标记的等位基因频率在高原人群和低海拔人群中存在显著差异，可用于法医实际检案中推断未知来源人类生物检材是属于高原人群还是低海拔人群；本试剂盒应用了单管内复合扩增和多重单碱基延伸技术，可以一次性获得生物检材14个常染色体snp遗传标记的基因分型，简单快速进行法医学生物检材来源推断；该试剂盒包括标准dna2800m，确保分型结果的准确可靠。该试剂盒复合扩增产物长度最短仅80bp，最长不超过220bp，对法医实际检案中常见的降解检材检测具有优势；本试剂盒以法医遗传实验室通用的毛细管电泳为检测平台，具有广泛应用和推广价值。附图说明图1为基于14个常染色体高原适应snp遗传标记试剂盒的电泳分型结果。b为标准dna2800m的分型结果；a和c是高原样本的分型结果。图中的横坐标数值提示dna链长度，纵坐标数值表示荧光强度，各等位基因峰的上方标示了该峰代表的snp遗传标记。具体实施方式本发明提供了一种基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒，组成包括：分离包装的复合扩增引物混合物，多重单碱基延伸反应引物混合物和标准dna；所述的复合扩增引物混合物共28条；所述的多重单碱基延伸反应引物混合物共14条。本发明的试剂盒是基于筛选得到的14个常染色体epas1基因上高原人群适应高原缺氧环境相关的功能性snp遗传标记，通过毛细管电泳检测平台，利用复合pcr扩增、单碱基延伸技术，构建高原适应snp遗传标记复合检测体系。本发明试剂盒的工作原理为：首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，对待测样本进行pcr扩增，获得含有14个常染色体高原适应snp标记的dna片段。然后以扩增产物，即14个dna片段为模板，利用单碱基延伸反应混合液和相应单碱基延伸反应引物混合液进行多重单碱基延伸反应，获得待测样本的14个常染色体高原适应snp标记的单碱基延伸反应产物。将单碱基延伸产物和含有内标的甲酰胺按一定比例混合后，进行毛细管电泳，利用各snp位点单碱基延伸反应产物的片段长度和snp位点的突变类型，确定分型图谱上各等位基因峰所代表的等位基因，从而得到待测样本14个常染色体高原适应snp标记的分型结果。此外，2800m标准dna作为阳性对照与样本同时进行扩增及延伸反应。可根据标准dna的分型结果是否准确，判断检测结果是否可靠。特别的，本发明的关键在于选择了14个常染色体高原适应snp标记位点。高海拔环境具有寒冷和低氧分压的特点，世代居住在高海拔地区的人群在选择压力下会产生相应的遗传学改变，从而适应高原缺氧环境。全基因组关联研究公布了大量藏族高原适应相关snp位点，这些位点分布在epas1、egln1、ppara、hmox2、hbg、hbg2、pklr等缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor，hif)编码基因上，其中以epas1和egln1两个基因上的snp等位基因在在高原人群和低海拔人群中频率差异最为显著。但并不是这些基因上的所有位点都可以有效的区分高海拔人群和低海拔人群。本发明将epas1和egln1基因高原适应snp位点在藏族群体中的等位基因频率与千人基因组计划数据库的26个群体进行比较，发现不同高原适应snp位点在高原人群和低海拔人群中频率差异并不相同。例如，有文献报道与藏族高原适应相关的egln1基因rs12097901位点，其衍生型等位基因频率在高原藏族群体中为68％，而在千人基因组计划数据库的东亚群体中有42％-49％，因此这个位点在区分高原人群和低海拔人群研究中的意义不大；相反，epas1基因上的rs150877473位点在高原藏族群体中频率接近70％，而在千人基因组计划数据库的群体中频率均低于5％，这个位点可用于区分高原人群和低海拔人群的研究中。本发明试剂盒中选择的snp位点必须在高原人群中具有很高的衍生型等位基频率，同时在低海拔人群中衍生型等位基频率极低。因此，通过大量分析和研究，制定了纳入本发明试剂盒中的常染色体高原适应snp标记的筛选标准：①位于缺氧诱导因子编码基因的内含子区域；②高原人群与低海拔人群中衍生型等位基频率差大于50％；③snp位点侧翼序列可设计合适的复合扩增引物和多重单碱基延伸引物；④可用单碱基延伸技术获得稳定的分型结果。根据上述标准，本发明最后筛选出14个常染色体高原适应snp位点。基于14个常染色体高原适应snp遗传标记检测试剂盒中所涉及的14个常染色体高原适应snp位点信息如表4。表414个常染色体高原适应snp位点序号snp基因座核苷酸定位多态性1rs115321619chr2:46567916g->a2rs13419896chr2:46556345g->a3rs73926265chr2:46569770g->a4rs55981512chr2:46570342g->a5rs116611511chr2:46600030a->g6rs189807021chr2:46583581g->a7rs372272284chr2:46584859a->g8rs374487821chr2:46571435g->c9rs73926264chr2:46569017a->g10rs150877473chr2:46588019c->g11rs73926263chr2:46568680a->g12rs149306391chr2:46571017c->g13rs369097672chr2:46600358a->g14rs142826801chr2:46588331g->c上表中，核苷酸定位为snp位点在hg19版本中的位置。本发明试剂盒在y染色体snp的检测中运用了复合pcr扩增技术。复合pcr扩增技术可以在一个反应体系中扩增多个目的dna片段，具有方便、快捷、节约样本和低成本的优点，适应法医学实际检案的需要。其中，复合pcr扩增引物的设计是该技术的关键和难点，在设计引物时，本发明充分考虑了以下因素：①引物gc比在30％-70％范围内；②所有引物的退火温度接近；③引物长度范围为18-30个碱基；④扩增产物长度范围在80bp到220bp之间，以适用于降解检材的检测；⑤引物自身、引物与模板之间、引物之间无明显的错配、发卡结构和二聚体结构的形成。本发明通过千人基因组计划数据库网站(1000genomesproject,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)查找常染色体高原适应snp位点侧翼序列，利用primerpremier6.0设计复合扩增引物，结合预实验结果，经过反复筛选和优化，得到了表2中所列的14对复合pcr扩增引物。所有pcr扩增引物自身、引物与模板之间、引物之间没有形成明显的错配、发卡结构和二聚体结构。本发明试剂盒利用上述复合pcr扩增引物，获得14个常染色体高原适应snp遗传标记的pcr扩增产物，然后以扩增产物为模板，进行单碱基延伸反应。单碱基延伸反应技术，也称微测序技术，是一种基于四种荧光素标记的双脱氧核糖核苷酸，特异性引物延伸反应。多重单碱基延伸反应可以在一个反应体系中通过多条测序引物同时获得多个snp位点的单碱基延伸产物，实现对多个snp位点的一次性同时检测。其特点：①通过设计不同长度的单碱基延伸引物，同时分析多个snp位点，即根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的snp位点；②根据不同的双脱氧核糖核苷酸标记的荧光素不同区分snp的不同等位基因。为了实现对多个snp位点同时进行单碱基延伸反应，多重单碱基延伸引物的设计是技术关键，应注意以下因素：①退火温度需大致相同；②如果单碱基延伸的碱基不同可以根据颜色判别snp位点，如果颜色相同需通过5’加尾，调节引物长度，并根据不同长度dna片段的电泳迁移率将不同snp位点的单碱基延伸产物区别开来；③引物自身、引物之间、引物与模板之间无明显的错配、发卡结构和二聚体结构。在本发明试剂盒中，所设计的单碱基延伸引物包括两个部分，第一部分为3’端的特异性序列，可与snp上游序列互补结合；第二部分为5’端的加尾序列，按照gcctcc(tcccc)n的原则进行加尾。加尾序列可使不同snp位点的单碱基延伸引物长度不同，最终使不同位点的单碱基延伸产物之间存在长度差异。考虑到不同长度的dna片段在毛细管电泳中的迁移率不同，我们根据以下原则设计snp基因座的单碱基延伸引物：具有相同等位基因的snp位点40bp以下至少间隔5bp；41-60bp至少间隔4bp；61-80bp至少间隔3bp；80-87bp至少间隔2bp。需要注意的是，为了保证延伸引物的质量，试剂盒中部分位点设计了反向测序引物(r，reverse)，比如rs115321619位点。此时，rs115321619位点突变类型为g/a，而实际检测到的等位基因会是突变类型的互补碱基，即c/t。当检测到等位基因c，表示rs115321619位点等位基因为g；当检测到等位基因t，表示rs115321619位点等位基因为a。14个常染色体高原适应snp位点中设计了反向测序引物的位点有rs115321619、rs73926265、rs149306391、rs374487821、rs372272284、rs150877473以及rs116611511。在分析检测结果时需要注意单碱基延伸引物的方向。最后设计出的所有14个常染色体高原适应snp位点复合pcr扩增引物和多重单碱基延伸引物的序列参见表5(各pcr扩增引物和多重单碱基延伸引物序列的序列号分别在表2和表3中)。表514个常染色体高原适应snp位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物参照表上表中，“-”之前的ggcctcc(tcccc)n序列代表加尾序列。本发明试剂盒引入阳性对照作为质量控制，用于准确地分析样本基因型。本发明中提供的阳性对照包括了2800m标准dna的所有14个常染色体高原适应snp遗传标记的标准分型结果。对未知样本进行毛细管电泳分析时，通过对2800m标准dna分型结果的比对，评估当次检测结果的准确性和可靠性。本发明试剂盒的结果检测只需在毛细管电泳平台上进行。毛细管电泳法已在法医遗传学实验室广泛应用。本发明选择复合扩增和多重单碱基延伸技术进行y染色体snp遗传标记的检测，根据单碱基延伸产物长度差异区分具有相同碱基的snp位点，根据荧光染料的颜色不同区分snp的不同等位基因。因此本发明试剂盒可以直接应用于任何一个具有毛细管电泳平台的法医遗传学实验室，具有普适性，并易于推广。更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：a)复合扩增反应混合液：含有pcr缓冲溶液、mgcl2、dntps、dna聚合酶等常用成分。b)复合扩增引物混合物：如表2所示的基于14个常染色体高原适应snp遗传标记的pcr扩增引物对组成的复合扩增引物混合物；复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物用于获得其相应的14个常染色体高原适应snp遗传标记的dna片段。c)扩增产物纯化试剂：含有核酸外切酶1(exoi)、虾碱性磷酸酶(sap)；用于将复合扩增的产物进行纯化，以便于进行下一步操作。d)多重单碱基延伸反应引物混合物：表3所述的14条常染色体高原适应snp遗传标记多重单碱基延伸反应引物组成的混合物。e)单碱基延伸反应混合液：包括dna聚合酶、mgcl2、缓冲液、荧光标记双脱氧核糖核酸等成分。复合扩增反应混合液、扩增产物纯化试剂、单碱基延伸反应混合液可使用商业化的产品。至于提取待检测样本中的模板dna，可使用目前本领域的各种常规试剂，提取dna模板可以参照现有的生物化学或遗传学常规方法即可进行。利用本发明所述试剂盒，可以对法医dna样本进行分析。分析方法包括以下步骤；1)提取待检测样本的dna，作为扩增模板。2)利用上述复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤1提取的dna进行两个体系复合扩增。所述复合扩增pcr的反应的循环参数为：95℃，15分钟；94℃，30秒，66℃-60℃，90秒，72℃，30秒，12个循环的降落扩增(touchdown-pcr)；94℃，30秒，60℃，90秒，72℃，30秒，17个循环；然后72℃，10分钟；4℃保存。3)纯化步骤2的复合扩增产物，并以它为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行两个体系的多重单碱基延伸反应。所述单碱基延伸反应的循环参数为：94℃，10秒，50℃，5秒，60℃，30秒，26个循环后4℃保存。4)用虾碱性磷酸酶纯化步骤3的产物后进行毛细管电泳分析，根据电泳结果获得样本的基因分型结果。进一步的，上述方法步骤4中所述的多重单碱基延伸产物分析包括以下步骤：首先对2800m标准dna分型结果进行分析，标准dna分型结果准确，则继续对待测样本进行分析，获得待测样本基因分型。下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。实施例中，除特别说明外，均使用以下试剂和仪器；1)基因分析仪3130，abi公司；2)proflexpcr扩增仪，abi公司；3)台式高速离心机，eppendorf公司；4)纯水装置，millipore公司；5)移液器，eppendorf公司；6)hi-di甲酰胺，abi公司；7)核酸外切酶1，takarabiotechnology公司；8)虾碱性磷酸酶，takarabiotechnology公司；9)内标(genescantmsizestandardgs-120liz)，abi公司。实施例1本发明试剂盒的制备用于检测的14个常染色体高原适应snp遗传标记复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：a)复合扩增引物混合物。由表2所示的扩增引物混合得到，扩增引物由invitrogen公司合成，将合成好的扩增引物用超纯水配置为100pm/μl，然后按照表6中的比例混合，制成复合扩增引物混合物。b)复合扩增反应混合液。本实施例中使用qiagen公司的pcr反应混合液multiplexpcrmix。c)多重单碱基延伸反应引物混合物。由表3所示的单碱基延伸反应引物混合得到，单碱基延伸反应引物均由invitrogen公司合成。将合成好的14条延伸引物(用超纯水配置为50pm/μl)以表7中给出参数配成多重单碱基延伸引物混合物。d)单碱基延伸反应混合液。本实施例中使用abi公司的产品snapshotreadyreactionmix。e)标准dna2800m，本实施例中使用abi公司的产品标准dna2800m。将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于14个常染色体高原适应snp遗传标记的复合检测试剂盒，用于后续的实验。表6复合pcr扩增引物的浓度表7多重单碱基延伸引物的浓度序号snp基因座延伸引物方向延伸引物长度(bp)引物浓度(μm)1rs115321619r300.2212rs13419896f350.1113rs73926265r400.1114rs55981512f440.1115rs116611511r480.1116rs189807021f520.1117rs372272284r550.1118rs374487821r590.1119rs73926264f630.11110rs150877473r670.16611rs73926263f710.04412rs149306391r750.06613rs369097672f790.33114rs142826801f820.089实施例2使用本发明试剂盒检测200份高原人群样本。使用上述基于14个常染色体高原适应snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒，对200份高原人群样本进行检测，这里的高原人群样本来自平均海拔超过2500米的阿里、日喀则、那曲和山南地区。具体的检测过程按如下步骤进行：a、用chelex-100法提取200份高原人群样本的dna，作为复合扩增模板；b、以步骤a中的dna为模板，利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液将样本在下述扩增体系中进行复合pcr扩增；复合扩增引物混合物0.35μl，复合扩增反应混合液2.5μl，模板dna0.8μl，加ddh2o至5μl；95℃，15分钟；94℃，30秒，66℃-60℃，90秒，72℃，30秒，12个循环的降落扩增(touchdown-pcr)；94℃，30秒，60℃，90秒，72℃，30秒，17个循环；然后72℃，10分钟；4℃保存。c、多重pcr产物的纯化；每一个样品扩增产物的纯化体系：exoi(5u/μl)0.8μl，sap(1u/μl)2.5μl，多重pcr产物5μl；扩增产物纯化反应条件：37℃60分钟，80℃10分钟；4℃保存。d、以上一步纯化得到的产物为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物进行单碱基延伸反应；体系：单碱基延伸反应混合液1.5μl，多重单碱基延伸引物混合物0.18μl，纯化后扩增产物1.5μl，加ddh2o至5μl；单碱基延伸反应的热循环参数：96℃10秒，50℃5秒，60℃30秒，循环25次；4℃保存。e、纯化上一步单碱基延伸反应产物；纯化体系：sap(1u/μl)1μl，单碱基延伸反应产物5μl；纯化反应条件：37℃60分钟，80℃10分钟，4℃保存；f、毛细管电泳：分别取1μl步骤e中得到的纯化后的延伸产物，加入10μl的hi-di甲醇胺和0.1μl内标混匀；然后95℃下变性3分钟，4℃下迅速冷却后，用美国abi公司基因分析仪3130进行电泳检测。电泳条件：1500v电压，36cm毛细管，pop7凝胶，电泳18分钟；应用datacollection3.0软件收集数据，genemapperidv3.2软件进行结果分析。200个高原人群样本的结果见表8和图1。表8检测结果图1b为标准dna2800分型结果，a和c为高原人群样本分型结果。图中可以看到高原人群和标准dna均可以清晰地分辨所有14个高原适应snp位点的等位基因。海拔超过3500米的阿里、日喀则、那曲和山南地区收集的200个高原样本分型结果显示，高原群体中14个高原适应snp位点6个及以上snp位点发生突变的频率为97％(194/200)，而千人基因组计划数据库中以上14个位点在汉族群体中6个及以上snp位点发生突变的频率仅为0.96％(2/208)。将14个高原适应snp位点6个及以上snp位点发生突变设为检验标准，未知样本出现14个高原适应snp位点6个及以上snp位点发生突变时，此样本属于高原人群的概率与此样本属于低海拔人群的概率之比为101.04。因此，基于14个常染色体高原适应snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒区分高原人群和低海拔人群具有很强的灵敏度和特异性，可应用于法医学实际检案当中。序列表<110>四川大学<120>基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒<130>a180398k（序）<141>2018-06-21<160>42<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tttctcttgtcaaagtctgtctgatc26<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cggtggtcccagctactcaa20<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aacttgatagagtgttagagcttcct26<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgaaccagagtcagtaaccaatcc24<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5acaggcattaggcatgtgagtc22<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gaatctaaggatgatctgctcttggt26<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cacctgcggcatagatagatactg24<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gtaggactaagaaccagcatcagag25<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gagtaagagccctgaatttggtttg25<210>10<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tctccctttatctgtgccactga23<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ggtagaaatgagtggaaggtgcta24<210>12<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cttggtctgttaatgagtcagtagaga27<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gcatggcttgttggagctactt22<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tcctctcatctactggcacctg22<210>15<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ttgtcagagcattgactccagatt24<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gcacaggctatggcattaacg21<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17aaattgagacccacggctctg21<210>18<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18atgcaaacagctatgtcacctttc24<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19cactctcggctccatgtctga21<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20gatgatgaggcaggacagcag21<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21accttctgtgtggcatctatttca24<210>22<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22actgtgtccatattcactgtgtcc24<210>23<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23aagccactatctcctacagttaagc25<210>24<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24ccaagtgaggtaggcaagacag22<210>25<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25ctgtgaagcaaatcataaccctctg25<210>26<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26gctggcttacctgtaaagtatatgttt27<210>27<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27aaggtgtggaactgaacatagacg24<210>28<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28accctgaggctctgtcaatgg21<210>29<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29gcctcctcccctgccatgcaccactgcact30<210>30<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30gcctcctcccctcggccagtgtctgaaagtgaagc35<210>31<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31gcctcctcccctcccctcccccacagcctggagtgaggcc40<210>32<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32gcctcctcccctcccctcccctcccctccccttcttcccccgcc44<210>33<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33gcctcctcccctcccctcccctcccctccgccactgaggctcctctgc48<210>34<211>52<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34gcctcctcccctcccctcccctcccctcccctccgctgacctcaggccacac52<210>35<211>55<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gcctcctcccctcccctcccctccctttttaaacctcttctccatcaaaacctac55<210>36<211>59<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36gcctcctcccctcccctcccctcccctcccctcccctccccttccctctgccattggcc59<210>37<211>63<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37gcctcctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctttattaaatgcatctggc60ccc63<210>38<211>67<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38gcctcctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctccgtgcagtgcaa60gacctga67<210>39<211>71<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39gcctcctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcctctcattattttcatc60tccctcttcct71<210>40<211>75<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40gcctcctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcctttcacagatc60tggaaacagacactt75<210>41<211>79<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41gcctcctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccttagacaaga60tgatacaaccattttggaa79<210>42<211>82<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gcctcctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctcccctccttaaag60gtgtggaactgaacatagacgt82当前第1页12