一个银杏萜类化合物合成路径中的磷酸甲羟戊酸激酶基因及其编码蛋白与应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说是一个银杏萜类化合物合成路径中的磷酸甲羟戊酸激酶基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

银杏(ginkgobilobal.)的起源追溯到200万年前，是第四纪冰川运动后遗留下来的裸子植物中最古老的孑遗植物，是在我国保存的唯一1科1属1种的植物，所以银杏又有“活化石”的美称。银杏提取物(egb)含有160多种化学成分，包括类黄酮，萜类，酚类，生物碱和抗坏血酸等。egb可以促进血液循环和脑代谢，预防中老年人患冠心病和高血压等心脑血管疾病等。在egb中，萜类化合物是最重要的生物活性成分之一。

萜类化合物(terpenoids)是植物次生代谢产物中最大的一个家族。萜类化合物迄今在植物中发现了25000多种，是植物次生代谢物中种类最多的一类，其中倍半萜是萜类化合物中最大和最多样化的一组。研究发现，许多倍半萜的成分具有挥发性，可调节植物的生长和发育等功能。萜类化合物不仅在植物中扮演重要角色的，也对于人类而言有着很高的商业价值，萜类被广泛应用于香料、化妆品、食物、药物和杀虫剂等，最近研究发现法尼烯和双酚a被认为是潜在的先进生物燃料前体。

植物萜类物质的合成路径分为两种，分别为甲羟戊酸途径和2c-甲基4-磷酸-4d-赤藓糖醇途径。甲羟戊酸途径主要在细胞质中进行，主要合成产物为倍半萜、三萜等；2c-甲基4-磷酸-4d-赤藓糖醇途径主要在一些质体中进行，主要合成半萜、单萜、二萜及四萜等。有一些研究表明，通过增加此路径上一些基因的转录水平，来增加萜内酯的生物合成量。因此，如何增加萜内酯生物合成途径中关键基因的表达水平来增加萜类化合物的含量是目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述技术中存在的不足，提供一个银杏萜类化合物合成路径中的磷酸甲羟戊酸激酶基因及其编码蛋白与应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面保护：本发明提供的银杏萜类化合物合成途径中磷酸甲羟戊酸激酶基因，来源于银杏(ginkgobilobal.)品种‘家佛手’，其cdna序列中含有1557bp的最大开放阅读框，序列如seqidno.1所示，编码seqidno.2所示的519个氨基酸序列，分子量为55.96kda，等电点为5.74。

本发明提供的银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的氨基酸序列对比如图1所示。结果表明，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因编码的蛋白质和其他植物的蛋白质具有较高的同源性(82.01％左右)。银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白在氨基酸残基中具有含有ghmp激酶家族特异的n与c末端的保守结构域。

第二方面保护第一方面所述基因在调控银杏萜类化合物生物合成中的应用；

具体地，用茉莉酸甲酯，水杨酸，脱落酸，乙烯利对银杏幼苗进行激素诱导；

对银杏幼苗进行冷，暗，损伤处理；

通过使用不同的激素诱导和胁迫处理，提高第一方面所述基因的表达量。

本发明一种银杏萜类化合物合成路径中的磷酸甲羟戊酸激酶基因及其编码蛋白与应用，其优点是：

(1)本发明提供了在银杏萜类化合物的合成途径中发挥着重要的调节功能的银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因，是具有序列表seqidno.1中所述的基因序列，其开放阅读框是1557bp，编码519个蛋白质。与现有技术相比，本发明保护的银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在银杏萜类化合物的合成途径中发挥着重要的调节功能，且生物信息学分析银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白与其植物的磷酸甲羟戊酸激酶蛋白有80.01％的相似度；

(2)系统进化分析发现，磷酸甲羟戊酸激酶蛋白系统进化树分成三大分支，单子叶植物禾本科、双子叶植物和裸子植物，由构建的进化树可以看出，同一个科属的植物聚类在一起，表明同一科属植物的磷酸甲羟戊酸激酶基因在亲缘关系相对更近。系统发育分析表明，银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白由于具有保守的序列结构和序列特征，因此与其他磷酸甲羟戊酸激酶蛋白共享共同的进化祖先；

(3)银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在根、茎、叶、果实、大孢子叶球中和小孢子叶球中均有表达。在不同组织中，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在叶中表达最高，其次是根，而小孢子叶球中的银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因表达显著低于其他组织。银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达模式与已报道的萜类物质在银杏组织中的分布情况相符合，因此银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在银杏萜类化合物的合成途径中发挥着重要的调节功能。

(4)银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在银杏对于响应激素诱导和逆境胁迫的过程中发挥重要作用，说明本发明对于植物品种改良具有重要的现实意义。

附图说明

图1银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白与同源甲羟戊酸激酶蛋白质的氨基酸序列比对的结果；

图2银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白二级结构分析；

图3银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白质序列比对构建的系统发育进化树；

图4银杏不同组织中银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达模式；

图5～8为植物激素诱导后银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达模式；

图9～11为逆境胁迫处理后银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达模式。

具体实施方式

下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。这些实施案例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

本发明的实施例中所用的试验材料如下：

植物材料：银杏(ginkgobilobal.)品种‘家佛手’；

菌株：大肠杆菌dh5α；

表达载体：pmd19-t载体。

本发明实施例中涉及的引物如下所示：

扩增银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因cdna编码区的引物为：

扩增-f：5’-agctgattatctgcatttgctatcc-3’

扩增-r：5’-cgcatttgttaattgtttctgagtc-3’

银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的qrt-pcr引物为：

定量-f：5’-gcatagtagcacagagtcccatagc-3’

定量-r：5’-caggctcaaactctcaagggataa-3’

内参引物-f：5’-ctggcgtagagtatgtggttgaat-3’

内参引物-r：5’-cacgccaacaacgaacatg-3’

实施例一银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的获得

银杏叶总rna的提取：

取1g新鲜的银杏叶片，液氮冷冻研磨成粉末状，采用minibestplantrnaextractionkit(takara公司)提取试剂盒提取银杏rna，具体方法参考试剂盒说明书。

通过核酸测定仪检测样品rna质量；

银杏rna反转录获得cdna

制备的银杏rna反转录获得cdna；

第一链cdna的合成使用takara公司的primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒，方法参照说明书。

银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的克隆

根据银杏转录组数据设计银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因特异性引物扩增-f、扩增-r，以反转录获得的银杏cdna为模板，进行rt-pcr扩增反应；

目的条带胶回收参照takara的胶回收试剂盒说明书进行，将回收产物克隆到pmd19-t载体，然后转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆，进行测序。

经分析后，序列如seqidno.1所示，编码519个氨基酸，氨基酸序列如seqidno.2所示。

实施例二银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白质序列分析

通过常规方式分析可知，银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白与其他物种植物的磷酸甲羟戊酸激酶蛋白具有82.01％的相似度，如无油樟:atpmk,xp_011621878.1；可可树:tcpmk,xp_007040735.2；黄芪:ampmk,aid51440.1；胡杨:pepmk,xp_011028097.1；碧桃:pppmk,xp_020419647.1；罗汉果:sgpmk,aem42973.1；橡胶树:hbpmk,afj74327.1；雷公藤:twpmk,amb15002.1；木豆:ccpmk,xp_020212065.1；麻风树:jcpmk,xp_012092013.1；蓖麻:rcpmk,xp_002520206.1；桑树:mapmk,aov62771.1.

蛋白质序列多重比对结果如图1显示，银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白具有四种保守结构域，分别在氨基酸序列的2-508位是磷酸甲羟戊酸激酶2(ipr035102)、1-510和5-506位是磷酸甲羟戊酸激酶erg8(ipr016005)、185-263位是ghmp激酶n末端结构域(ipr006204)、412-485与315-491位是ghmp激酶c末端结构域(ipr013750)，含有ghmp激酶家族特异的n与c末端的保守结构域。

这些结果表明，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因属于atp依赖性酶的ghmp激酶基因超家族。

实施例三银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白的二级结构分析

使用sopma在线软件

(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)预测gbpmk蛋白质的二级结构。

结果表明(图2)该蛋白的二级结构主要包括螺旋a-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲四种结构类型。其中a-螺旋，延伸链，β-转角和无规则卷曲这四种类型分别占蛋白质的46.85％、15.80％、8.29％、29.09％，可以发现螺旋和无规则卷曲占二级结构中不同折叠子的绝大多数。

实施例四银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的系统进化分析

为了研究银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白和其他物种的磷酸甲羟戊酸激酶蛋白的进化关系，从genbank中选择了不同品种植物的磷酸甲羟戊酸激酶蛋白，利用软件clustalx2.0和mega6.0通过邻接法(neighbor-joining)构建了磷酸甲羟戊酸激酶的系统进化树。

如图3所示，磷酸甲羟戊酸激酶基因系统进化树分成三大分支，单子叶植物禾本科、双子叶植物和裸子植物，双子叶植物又被分为五加科和蔷薇科，裸子植物有两种：银杏和白云杉。由构建的进化树可以看出，同一个科属的植物聚类在一起，表明同一科属植物的磷酸甲羟戊酸激酶基因在亲缘关系相对更近。总之，这些结果表明，银杏磷酸甲羟戊酸激酶蛋白由于具有保守的序列结构和序列特征，因此与其他磷酸甲羟戊酸激酶蛋白共享共同的进化原始。

生物信息显示银杏甲羟戊酸激酶蛋白具有ghmp激酶活性，本研究证明银杏甲羟戊酸激酶基因属于高度保守的古老基因，且银杏甲羟戊酸激酶基因属于甲羟戊酸激酶基因家族的一员。

实施例五银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在不同组织中的表达分析

按照实施例1中的方法提取银杏根、茎、叶、大孢子叶球、小孢子叶球、果实的rna，cdna的合成用能消除rna中残留dna的试剂盒primescript^tmrtregentkitwithgdnaeraser，

内参基因-f：5’-ctggcgtagagtatgtggttgaat-3’,

内参基因-r:5’-cacgccaacaacgaacatg-3’，

根据银杏甲羟戊酸激酶基因序列设计表达检测引物

定量-f：5’-gcatagtagcacagagtcccatagc-3’

定量-r:5’-caggctcaaactctcaagggataa-3’。

以来自不同组织cdna为模板进行实时定量pcr分析。

结果分析表明(图4)，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在根、茎、叶、果实、大孢子叶球和小孢子叶球中均有表达。在不同组织中，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在叶中表达最高，其次是根，而小孢子叶球中的银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因表达显著低于其他组织。先前的研究报道了类似的结果，即基因表达在甲羟戊酸途径中的叶和根中最高。鉴于银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达与倍半萜的生物合成有关，因此本文推测叶和根可能是倍半萜生物合成的主要器官。还建立了银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因表达与倍半萜生物合成途径之间的关系，为进一步研究提供参考。

实施例六激素诱导和胁迫处理对银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因表达水平的影响

本发明选取长势均匀的银杏一年生盆栽苗，生长在光周期为16h/8h，环境温度为光照下25℃，黑暗下18℃的恒温培养箱中。培养基质为1:1:1的草炭、腐殖土和珍珠岩，定期用自来水浇灌保持70％的土壤含水量。

激素处理：取生长势相同的一年生银杏幼苗各10株，分别进行茉莉酸甲酯和水杨酸处理，以本课题组试验数据结果为参照设置激素浓度使用溶于0.01％tween-20中的10μm茉莉酸甲酯，100μm脱落酸，10mm水杨酸，10m乙烯利，对照组使用0.01％tween-20喷洒叶片正反面，处理的叶片分别在0,1,2,3,4,5天收集。将幼苗放置在4℃培养箱中进行冷处理，并将对照放置在25℃下。黑暗处理，为了保持完全黑暗，将幼苗覆盖遮阴盒，并用16/8光暗周期处理对照。通过切割6cm的叶边进行伤口处理，并使用正常叶作为对照。所有对照组均置于25℃，16/8光暗周期的培养室中。冷，黑暗，伤口和对照处理的叶片分别在0,8,12,24,48小时收集用。各处理重复三次，叶片收集后液氮速冻，带回实验室放入-80℃超低温冰箱中保存。按照实施例1和5中的方法提取叶片rna，进行反转录成cdna，进行qrt-pcr分析银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的转录水平。

结果如图5所示，在茉莉酸甲酯处理下，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达水平随处理时间的延长而不同程度下降。1天后，与对照相比，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达水平降低了0.45倍(图5)。茉莉酸甲酯降低了银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达水平。水杨酸增加了银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达水平，其表达量呈现先增加后减少的趋势，处理后第2天达到最高水平。处理后2天表达水平比对照高1.21倍(图6)。在脱落酸和乙烯利处理下，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达水平在1d后达到峰值。脱落酸和乙烯利处理的表达水平分别是对照的3.03和1.56倍。处理4天后，表达水平不同程度下降。同时，在脱落酸处理下银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达水平较高(图7)，但乙烯利处理的表达水平低于对照(图8)。黑暗条件下银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达水平首先增加然后降低(图10)。同时，在4℃处理48小时后观察到银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因表达有上升趋势(图9)。4℃和暗处理的银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因表达水平低于对照，并且随着处理时间的增长，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达水平逐渐降低。在损伤处理下，与对照相比，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因表达在整个时间内没有显着差异(图11)。

上述结果表明，水杨酸，脱落酸和乙烯利，低温，暗环境在适当时间中处理银杏幼苗，可以提高银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因的表达量。推测，银杏磷酸甲羟戊酸激酶基因在银杏对于响应激素诱导和逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>长江大学

<120>一个银杏萜类化合物合成路径中的磷酸甲羟戊酸激酶基因及其编码蛋白与应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1557

<212>dna

<213>银杏(ginkgobilobal.)

<400>1

atggctgtaattgcatcggcaccaggcaaggttctgataacaggagcttatcttgttctt60

gagaagccaaatccaggtgttgtacttacgactacagctcgcttctacgcaatcgtgaaa120

ccactgcatagtagcacagagtcccatagctgcaaccggctatggacagatgtgaaacta180

gcatctcctcaacttttcaaggaagccacttataaattatcccttgagagtttgagcctg240

caaaatgtttcttcttccagtgacaatggcaatccttttgtggagcaagcagtgcagttc300

gctgttgcagcagccaaagcagtctttgttgatgaccatgggaggcaggatatgctaaat360

acgattcttttacaaggctttgagattactattttgggtagcaatgacttctattcatat420

cgaaaacagattgatgcgcgtggcctccccttaacatcagagacactggcttcacttcct480

gcattctcagcaatcaccctcaatgaaaatgaattagacaaaccaaattcctcatccaaa540

gtcagatgtgcaccagaaattgctaagactggcctaggctcatctgctgctatgacaaca600

gcagctgttgcaggtcttcttcattatctgggagctgttaatcttactattgctacccat660

gcaacatatgctgacacagtggcgaatagcgacttggatttagtgcatgctgtatcacag720

acagcccattgtgcagcccaaggaaaagttggtagtggctttgacgtaagtgctgcggtc780

tatggaagtcagcgctatatccgattttctcctgaaattctgtctccagctcaggttagc840

aggaatagtaaatcattgttggaggctatgactgagattctgaagaatacatgggacaat900

cagaagattgagtatggtttacctccatttatggccctgctattgggcgaaccaggatat960

ggtggttcttgtactccatctatggtaggcgctgtccaatcatggaggaagagagatcca1020

cagaattctcaagaaatttggaaaagattagcagaagcaaatgcagatgtggaaagacaa1080

cttttgttattaaagcatatggcacaagagcaggaagagatttataaaaatgttttggag1140

agttgtagcacacaattatctgaaaagtggatggaaaatcacatacatgattctaaccag1200

caagctgttgtgaaagcgttgttggacgcaaggcaagctatacttggtgtcagaaatctt1260

ttaaggcagattggagaagcagcaggagttccgatcgaacctgaaccgcagacacaggtg1320

ttaaatgccacaatgaatatggaaggtgttctcttggcaggtgttcctggtgcaggaggt1380

tttgatgcaatatttgcaattacactggggaactctgccagggttcgtgttgcacatgaa1440

tggagttctaaaggggtgctaccacttttggtaacagaagatccaaagggtgttgctctg1500

gaggatagcgatccccgagagagggaaattacttctgggattccttccataaaaaaa1557

<210>2

<211>519

<212>prt

<213>银杏(ginkgobilobal.)

<400>2

metalavalilealaseralaproglylysvalleuilethrglyala

151015

tyrleuvalleuglulysproasnproglyvalvalleuthrthrthr

202530

alaargphetyralailevallysproleuhisserserthrgluser

354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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165170175

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195200205

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210215220

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

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355360365

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370375380

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405410415

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485490495

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515