本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定技术，具体涉及一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法，利用多重pcr对翘嘴鲌进行ssr分析的方法，适合在翘嘴鲌选育和养殖过程中进行种质鉴定和系谱管理。
背景技术：
翘嘴鲌(culteralburnusbasilewsky)是鲌亚科中体型最大的一种鱼类，隶属于鲤科(cyprinida)、鲌亚科(culterinae)、鲌属(culter)，广泛分布于中国各大水系。太湖中出产的翘嘴鲌被誉为“太湖三白”之一，其肉白而细嫩，味美而不腥。此外，翘嘴鲌在淡水水域生态系统中处于食物链的顶端，对维持生态系统的稳定具有重要作用。
分子标记是种质资源鉴定、家系选育和放流效果评估等研究和应用中一个重要技术手段。在家系选育中，了解整个家系遗传多样性，子代与亲代的对应关系以及子代与子代的关系，可以指导亲本选留，从而避免近亲繁殖，对于预防种质衰退具有重要作用。
微卫星dna是真核生物基因组中短的串联重复序列。由于微卫星位点数量多，在基因组中均匀分布，共显性遗传且易于检测，微卫星dna得到了广泛的应用。翘嘴鲌的微卫星已用来解决遗传多样性、遗传结构等问题。但是，上述遗传学实验均需要采用多个微卫星位点，研究者需要花费大量的时间和实验成本。更重要的是，要消耗较多的dna样本。故发明一种对样本量要求少、成本低、高效的微卫星实验体系对于翘嘴鲌的育种研究来说具有重要的意义。
目前，其它物种的微卫星遗传学研究中采用多重pcr以解决上述问题。微卫星多重pcr指在一个pcr体系中加入多对微卫星特异性引物，对同一个模板的不同区域进行同时扩增的pcr技术。微卫星多重pcr可以同时扩增多个目的片段，能够达到节约实验样品、实验成本、提高实验效率的目的。微卫星多重pcr的核心内容在于如何设计和优化引物组合，使得引物之间不存在相互作用、不产生非特异扩增、不使扩增产物重叠。尽管微卫星多重pcr技术已在其他物种中广泛得到应用，但是迄今为止，翘嘴鲌微卫星多重pcr体系仍末建立起来。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一套高效的翘嘴鲌微卫星位点的四重pcr体系的检测方法，该方法选用有效的微卫星引物，可靠、高效，能对翘嘴鲌进行亲子鉴定，还能用于家系管理和增殖放流效果评估。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种翘嘴鲌亲子鉴定微卫星荧光多重pcr的方法，首先筛选出16对ssr引物，通过优化组合选出12对组成3个多重pcr组；然后在一个pcr反应体系中加入同属一组但浓度不同的4对ssr特异性引物对，采用不同的反应体系同时对同一个dna模板的不同区域扩增出多个目的片段；通过电泳抽样检测后送生物公司在测序仪上进行分型，并获取样本相应位点的基因型；最终用于分析亲本和子代的亲子关系。
具体地，本发明技术方案包括以下步骤：
（1)翘嘴鲌样本dna提取
取翘嘴鲌个体的鳍条，采取酚—氯仿法提取基因组dna，将获得的dna测定浓度后稀释至约50ng/μl。
（2)翘嘴鲌多态性微卫星序列的筛选
根据ncbi上收录翘嘴鲌序列利用primerpremier6.0软件设计及现有文献记载的翘嘴鲌引物序列，并确保目的片段长度存在较大差异（100-500bp），引物序列送生物公司合成。用步骤(1)获得的基因组dna为模板，对合成的引物用翘嘴鲌个体进行pcr扩增，利用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出16对扩增效果较好的引物，所述引物包括正向引物、反向引物。
（3)多重pcr体系的摸索和确定
进行多重pcr扩增：对步骤（2)中筛选得到的引物按照扩增后的pcr产物按照120-180bp、200-260bp、280-340bp、360-420bp四个不同区间进行初步分组；首先两两组合，选出扩增清晰的组合，再依次进行3个和4个位点的多重pcr体系的摸索和构建。依据2.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果，然后不断优化各组内引物的浓度配比，确保扩增条带清楚并不重叠。最终，确定了基于12个微卫星位点的3，重新将每对引物的上游引物的5’端进行荧光修饰（hex或6-fam）。
4)获取翘嘴鲌样本的基因型数据
基于步骤（3）构建的多重pcr体系，对所有步骤（1）获得的dna样进行扩增，并抽取适量扩增产物（4μl）在2.5%琼脂糖凝胶上电泳检测，检测合格后，送至生物公司采用abi3720xl进行毛细管电泳检测，并利用genemapper4.0对结果进行分析，从而获得亲本和子代各位点的基因型数据。
步骤（2)和步骤（3)中的扩增体系为：2×multiplexpcrmix12.5μl，上下游引物的工作浓度为l0mmol/l，具体的使用量见表（1），50ng基因组dna，补加灭菌超纯水至体系为25μl。
步骤（2)和步骤（3)中的扩增的条件为：95℃总变性10分钟，95℃变性30秒，退火温度（表1）退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃总延伸5分钟。
表1翘嘴鲌3个4重pcr体系的引物信息
通过实施上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明翘嘴鲌微卫星位点的4重pcr体系检测方法简单，与翘嘴鲌常规的单位点的微卫星pcr体系相比，可以有效节约dna样本、pcr扩增试剂和毛细管分型费等，并减少了实验所需要的时间，有效提高实验效率。
如果采用单对引物逐一进行扩增,单个体系为25μl,1个样本进行这12对引物的检测需要进行12次pcr,需要600ng的dna,150μl的multiplexpcrmix.但要是采用本发明的方法，1个样本只需进行4次pcr，需要200ng的dna,50μl的multiplexpcrmix。
本发明涉及的微卫星标记的扩增体系，节约dna样本，实验效率高，可在翘嘴鲌的亲子鉴定、种群遗传多样性和遗传结构的评估方面进行推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：
(1)选取性腺成熟好的3龄翘嘴鲌进行人工催产，建立12个全同胞单对交配家系；收集各个家系的全部亲本个体（共24个）和部分子代个体（每个家系20个水花,合计480个）；
(2)取翘嘴鲌个体的鳍条，采取酚—氯仿法提取基因组dna，将获得的dna测定浓度后稀释至约50ng/μl；
(3）翘嘴鲌多态性微卫星序列的筛选
根据ncbi上收录翘嘴鲌序列利用primerpremier6.0软件设计及现有文献记载的翘嘴鲌引物序列，并确保目的片段长度存在较大差异（100-500bp），引物序列送生物公司合成。用步骤(1)获得的基因组dna为模板，对合成的引物用翘嘴鲌个体进行pcr扩增，利用2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出16对扩增效果较好的引物，所述引物包括正向引物、反向引物。
（4)多重pcr体系的摸索和确定
进行多重pcr扩增：对步骤（3)中筛选得到的引物按照扩增后的pcr产物按照120-180bp、200-260bp、280-340bp、360-420bp四个不同区间进行初步分组；首先两两组合，选出扩增清晰的组合，再依次进行3个和4个位点的多重pcr体系的摸索和构建。依据2.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果，然后不断优化各组内引物的浓度配比，确保扩增条带清楚并不重叠。最终，确定了基于12个微卫星位点的3个4重pcr体系，重新将每对引物的上游引物的5’端进行荧光修饰（hex或6-fam）。
（5)获取翘嘴鲌样本的基因型数据
基于步骤（4）构建的多重pcr体系，对所有步骤（2）获得的dna样进行扩增，并抽取适量扩增产物（4μl）在2.5%琼脂糖凝胶上电泳检测，检测合格后，送至生物公司采用abi3720xl进行毛细管电泳检测，并利用genemapper4.0对结果进行分析，从而获得亲本和子代各位点的基因型数据。
步骤（3)和步骤（4)中的扩增体系为：2×multiplexpcrmix12.5μl，上下游引物的工作浓度为l0mmol/l，具体的使用量见表（1），50ng基因组dna，补加灭菌超纯水至体系为25μl。
步骤（3)和步骤（4)中的扩增的条件为：95℃总变性10分钟，95℃变性30秒，退火温度（表1）退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃总延伸5分钟。
(6）使用前述的3种引物组合方式进行多重pcr扩增，多重pcr的扩增体系为：2×multiplexpcrmix12.5μl，上下游引物的工作浓度为l0mmol/l，具体的使用量见表（1），20ng基因组dna，补加灭菌超纯水至体系为25μl；扩增的条件为：95℃总变性10分钟，95℃变性30秒，退火温度（表1）退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃总延伸5分钟。
(7)pcr扩增产物经适当稀释后，与分子量内标混合，在abi3130测序仪上进行毛细管电泳分析；
(8)使用genemapperv4.0软件分析电泳结果，得到每个个体微卫星标记的基因型数据；混合12个全同胞家系的480个子代个体的基因烈数据，以检验微卫星多重pcr在亲子鉴定中的效率；使用cervus3.0软件对亲本和子代个体进行亲缘关系分析，计算每个子代最可能的父母本个体；根据分析结果，将置信度最高的雄性和雌性个体确认为子代个体亲本。
结果显示，在全部的24个亲本和480个子代中，在95％置信水平下，运用该发明所述的3组4重pcr(12个位点）即可达到100％的亲子鉴定成功率。
实施例2：
(1)在湖州养殖场采集32个养殖个体；
(2)使用苯酚氯仿法提取每个样本的dna，将获得的dna测定浓度后稀释至约50ng/μl；
(3）根据前述筛选的12种引物序列以及修饰方法合成引物，方法同实施例1；
(4）使用前述的3种引物组合方式进行多重pcr扩增，多重pcr的扩增体系和扩增条件同实施例1；
(5)pcr扩增产物经适当稀释后，与分子量内标混合，在abi3130测序仪上进行毛细管电泳分析；
(6)使用genemapperv4.0软件分析电泳结果，得到32个个体微卫星标记的基因型数据。进行分析如表2：
表212个微卫星位点在湖州养殖群体32个样本中的遗传参数检测
注：na为等位基因数目；ho为观测杂合度；he为期望杂合度；pic为多态信息含量；hwe为哈迪-温伯格平衡。