本发明涉及分子标记领域，特别涉及一种菊芋est-ssr分子标记开发及应用。
背景技术：
近年来菊芋的生理功能引起了医学、食品、生态技术等领域的广泛关注。菊芋生物量大，其块茎富含果聚糖，通过工业提取可进一步生产低聚果糖和超高果糖浆等产品，是是待开发的能源植物之一。在生态方面，菊芋用于治理沙漠和利用滩涂方面的研究较多。简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)标记自从1989年被建立以来，由于其多态性高，检测容易，数量丰富，特异性和共显性等特点，已被广泛用于遗传图谱绘制、重要农艺性状的基因定位、生物遗传多样性、遗传进化、品种鉴定等诸多方面。构建dna指纹图谱是ssr分子标记技术利用的一个重要方面，目前在小麦、油菜、马铃薯、番茄等多个作物中。根据ssr标记的序列性质不同，ssr标记可以分为基因组ssr(genomicssr，gssr)和表达序列标签ssr(expressedsequencetagssr，est-ssr)。gssr分子标记开发需要构建基因组文库、制备探针和分子杂交等过程，制约了其发展和应用。随着genbank中许多重要物种的est急剧增加，使其成为一种新的和有效的ssr标记来源。
对菊芋ssr的研究已经取得了一定的进展，在菊芋的遗传研究中显现出了广泛的应用前景。在菊芋基因组测序尚未完成之际，目前对菊芋ssr标记的开发主要是通过同源转移开发，虽然同源转移开发在很多物种上已经有成功报道，但是受到物种间共线性和微线性不强的局限性，开发效果并不理想，可供菊芋利用的ssr标记数目太少，无法满足进一步研究的需求。而利用est数据开发的est-ssr标记简单有效，还具有良好的种属间通用性等，且由于est是基因组的一部分，其变化可能直接影响基因的功能的表达。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种菊芋est-ssr分子标记开发及应用，为开发与利用菊芋est资源、丰富菊芋分子标记类型，为遗传多样性分析、功能基因的发现与定位、种质资源鉴定等方面的应用与研究提供技术支持和理论依据。
为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种菊芋est-ssr分子标记开发及应用，其特征在于：所述菊芋est-ssr分子标记开发及应用采用est-trimmer程序去除带有polya或者polyt结构的序列，并截去片段太低的低质量序列，使用cap3软件对est序列进行拼接和聚类，然后通过misa脚本对拼接后的结果进行ssr位点搜索，查找的标准设定为：最低片段18bp，即单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最少重复次数分别在18、9、6、5、4、3次以上，与此同时，将间隔小于或等于10bp的被打断的不完全重复ssr位点也列为搜索对象，将生成的文本格式文件导入excel表中，对est-ssrs的基本信息进行统计分析。引物设计选择ssr位点的重复单元为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为8次、6次、4次、3次、3次，且ssr位点距离序列两端大于50bp的序列；利用primer5设计引物，引物设计的主要参数：引物长度控制在17～24bp，预期产物长度控制在150～400bp，设计出来的引物利用oligo软件进行引物评估，避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生，将96对通过评估的est-ssr引物合成，引物最佳复性温度的筛选于mastercyclerpro梯度pcr仪上进行，pcr反应体系为20μl，其中包括：1×buffer，1.5mmol·l-1mgcl2，0.2mmol·l-1dntps，0.25mmol·l-1的上下游引物，1.0u的dnapolymerase，以及4.5ng的dna模板，反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性45s，复性(55～60℃)30s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min，pcr反应产物利用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶于dyy-ii型垂直板电泳仪及dyc-30型电泳槽中电泳分离，上样完毕后在200v与100ma条件下电泳180min，电泳结束后银染法染色，在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，用ssr出现频率和ssr平均分布距离来描述est-ssr，计算公式为：(1)ssr出现频率，fc＝c/n×100％，c为搜索到的ssr数量，n为无冗余est数量；(2)ssr平均分布距离，fn＝n/c，n为无冗余est数量的总碱基数。
采用以上技术方案的有益效果是：该菊芋est-ssr分子标记开发及应用的est-ssr来自基因的转录区，与功能基因有紧密的连锁，除了具有基因组ssr所具有的利用价值外可能实现对决定某些重要性状的等位基因进行直接鉴定，est-ssr在物种间有较高的通用性，其开发与应用已在小麦、棉花、大豆、花生、番茄、油菜和大白菜等作物中报道。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
图1是利用11对引物在45份菊芋资源中的遗传多样性分析图。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明一种菊芋est-ssr分子标记开发及应用的优选实施方式。
图1出示本发明菊芋est-ssr分子标记开发及应用的具体实施方式。
该菊芋est-ssr分子标记开发及应用的dna提取供试材料基因组dna主要参照ctab法提取。截止2016年3月22日，genebank已公布了40370条菊芋est序列，从ncbi下载所有的菊芋est序列。从数据库直接获取的est中包含一些低质量的片段(＜100bp)，同时存在着带有载体片段的序列及末端存在polya或者polyt的序列，所以需要提前处理，对est片段进行优化和筛选。
图1为利用11对引物在45份菊芋资源中的遗传多样性分析图，该菊芋est-ssr分子标记开发及应用采用est-trimmer程序去除带有polya或者polyt结构的序列，并截去片段太低的低质量序列。由于数据库中的est来自不同的研究机构，其中不可避免的包含重复或重叠的est序列，即冗余est，需要通过拼接处理以获得更长、质量更高的序列。使用cap3软件对est序列进行拼接和聚类，然后通过misa脚本对拼接后的结果进行ssr位点搜索，查找的标准设定为：最低片段18bp，即单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最少重复次数分别在18、9、6、5、4、3次以上，与此同时，将间隔小于或等于10bp的被打断的不完全重复ssr位点也列为搜索对象。将生成的文本格式文件导入excel表中，对est-ssrs的基本信息进行统计分析。引物设计选择ssr位点的重复单元为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为8次、6次、4次、3次、3次，且ssr位点距离序列两端大于50bp的序列。
11对est-ssr引物数据表
利用primer5设计引物，引物设计的主要参数：引物长度控制在17～24bp，预期产物长度控制在150～400bp。设计出来的引物利用oligo软件进行引物评估，避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生。将96对通过评估的est-ssr引物交由北京华大基因公司合成。引物最佳复性温度的筛选于eppendorf公司生产的mastercyclerpro梯度pcr仪上进行。pcr反应体系为20μl，其中包括：1×buffer，1.5mmol·l-1mgcl2，0.2mmol·l-1dntps，0.25mmol·l-1的上下游引物，1.0u的dnapolymerase，以及4.5ng的dna模板。反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性45s，复性(55～60℃)30s，72℃延伸2min，最后72℃延伸10min。pcr反应产物利用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶于北京六一仪器厂生产的dyy-ii型垂直板电泳仪及dyc-30型电泳槽中电泳分离。上样完毕后在200v与100ma条件下电泳180min。电泳结束后银染法染色。在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0。
用ssr出现频率和ssr平均分布距离来描述est-ssr。计算公式为：(1)ssr出现频率，fc＝c/n×100％，c为搜索到的ssr数量，n为无冗余est数量；(2)ssr平均分布距离，fn＝n/c，n为无冗余est数量的总碱基数。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。