一类基于双核铱(Ⅲ)配合物的G-四链体选择性探针的制作方法

本发明涉及荧光生物传感器制备的分析化学、生物化学的技术领域，具体包括一种基于g-四链体为选择性探针合成双核铱(ⅲ)配合物荧光生物传感器的制备方法及其在农药检测方面的应用。

背景技术：

环金属铱(iii)配合物因其荧光寿命长，斯托克斯位移大，细胞毒性低，合成步骤简单，以及在可见光区域内可调的激发和发射波长等优点而被广泛关注。

近年来，香港浸会大学的马迪龙等人在《label-freeluminescenceswitch-ondetectionoft4polynucleotidekinaseactivityusingag-quadruplex-selectiveprobe》，《conjugatingagroove-bindingmotiftoanir(ⅲ)complexfortheenhancementofg-quadruplexprobebehavior》，《interactionofaniridium(iii)complexwithg-quadruplexdnaanditsapplicationinluminescentswitch-ondetectionofsiglec-5》等文章中提出单核ir(ⅲ)配合物可作为g-四链体选择性探针，用于构建无标记的基于g-四链体的发光检测平台(chem.commun.,2014,50(40),5313-5；chem.sci.,2016,7(4),2516-2523；anal.chem.,2016,88,10290-10295)。

据研究，单核ir(ⅲ)配合物可能与g-四链体的环状部分相互作用，我们推测将单链ir(ⅲ)配合物通过柔性链连接，可以增强配合物与g-四链体dna之间的非共价和静电相互作用从而加强双核ir(ⅲ)配合物的结合能力和立体结构识别能力。

最近，马迪龙研究组还在《anoveldinucleariridiumcomplexasag-quadruplexselectiveprobefortheluminescentswitch-ondetectionoftranscriptionfactorhif-1α》中将单核ir(iii)配合物通过5碳桥的简单连接获得了双核ir(iii)配合物[ir2(tpptda)(phq)4]⁺，该配合物已被成功用于免标记检测转录因子(sci.rep.,6:22458)。

考虑到双核ir(iii)配合物的发展仍处于起步阶段并且在基于g-四链体的检测中表现出优异的性能，我们有兴趣开发新的双核ir(iii)配合物，拓宽g-四链体探针库，为有机磷或有机氨基甲酸酯类农药构建一种免标记的基于g-四链体的发光检测。

综上所述，开发双核铱(iii)配合作为g-四链体的选择性探针具有显著的新颖性。

利用其g-四链体选择性可建立免标记的荧光生物传感器，利用该传感器的高选择性和超灵敏性以实现农药的分析检测，具有明显的科学意义和应用价值。

迄今为止，这类双核铱(iii)配合作的结构和其作为g-四链体的选择性探针的研究还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是开发一类基于双核铱(ⅲ)配合物的g-四链体选择性探针，并利用其对g-四链体的高度选择性来建立免标记的荧光生物传感器用于农药的检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案

一种基于双核铱(ⅲ)配合物的g-四链体选择性探针的结构特征如下式所示：

优选是，所述的制备及纯化方法由四步构成，合成简单，原料易得；

优选是，该类双核铱(ⅲ)的发射波长在570nm左右，激发波长在350nm左右；

优选是，所述的双核铱(ⅲ)配合物i-1和i-2能特异性的识别g-四链体dna；

进一步的优选是，所述的双核铱(ⅲ)配合物可被用于免标记的荧光生物传感器的建立；

其特征在于：检测涕灭威(aldicarb)时，涕灭威能结合到乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，ache)的活性中心从而抑制其活性；这会导致由ache产生的含有巯基的硫代胆碱(thiocholine，tch)太少而不能释放出杂交在发夹状dna(dp)中的hg²⁺，从而，使得大多数的dp/hg²⁺保持其发夹结构。在这种情况下，末端转脱氧核苷酰酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase，tdt)将不能在发夹状dp/hg²⁺的3￠-oh端生长出富含鸟嘌呤碱基的dna序列(需要在含60％dgtp+40％datp的反应池中)，从而不能进行信号的传导和扩大。

即使在双核铱(ⅲ)配合物的存在下，系统的荧光也很微弱；而在没有涕灭威存在时，发夹状dna中的hg²⁺被ache所产生的tch夺走，导致dp的3’-oh变得自由，因而tdt可以在其3’-oh端长出富含鸟嘌呤碱基的dna序列；在k⁺的存在下，这些含鸟嘌呤碱基的dna序列形成的g-四链体结构可以被双核铱(ⅲ)配合物i-1所识别，发生了有效的信号传递与扩大。利用这个“关信号”的荧光检测平台可以有效地检测农药。

本发明的效果是：

1.本发明开发了一系列具有新颖结构的双核ir(ⅲ)配合物，该类金属配合物制备方法简单，发光性能良好；

2.本发明中所开发的这类双核ir(ⅲ)配合物具有特异性识别g-四链体dna结构的能力；

3.本发明中所开发的双核ir(ⅲ)配合物能用于建立免标记的生物传感平台，该平台可用于检测能抑制乙酰胆碱酯酶活性的有机磷酸酯或氨基甲酸酯农药，因此，在食品安全领域有实际应用。

附图说明：

图1为本发明实施例中所涉及的双核ir(ⅲ)配合物的吸收、激发和发射光谱；

图2为本发明实施例提供的双核ir(ⅲ)配合物的g-四链体选择性研究(以i-1为例)a：i-1对不同dna结构的发光响应；b：i-1对g-四链体dna相对于双链dna或单链dna的发光增强比值；

图3为双核ir(ⅲ)配合物i-1的荧光竞争法(g4-fid)滴定曲线；

图4为本发明实施例提供的基于新型g-四链体选择性探针双核ir(ⅲ)配合物i-1的无标记农药检测示意图；

图5为本发明实施例提供的a：双核ir(ⅲ)配合物在不同检测条件下的响应，a：i-1，b：i-1+dp/hg²⁺+atch，c：i-1+dp/hg²⁺+atch+ache，d：i-1+dp/hg²⁺+atch+ache+datp+dgtp+tdt，e：i-1+dp/hg²⁺+atch+ache+datp+dgtp+tdt+aldicarb.b：无标记农药检测的凝胶电泳成像：a道：dp，b道：dp/hg²⁺，c道：dp/hg²⁺+datp+dgtp+tdt，d道：dp/hg²⁺+atch+ache+datp+dgtp+tdt，e道：dp/hg²⁺+atch+ache+datp+dgtp+tdt+涕灭威；

图6为本发明实施例提供的a：双核ir(ⅲ)配合物响应不同浓度涕灭威的发光光谱b：λ＝575nm处的发光强度与涕灭威浓度之间的关系。

具体实施方式

为了深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例；下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。

实施例1

检测铱(iii)配合物的选择性：

将可以折叠成g-四链体的dna序列(如：ps2.m,c-myc,pu27andc-kit87)在富含k⁺的tris-hcl缓冲液(20mmtris,100mmkcl,ph7.0)中进行退火处理，冷却至室温后保存在–20℃待用。在具体操作时，0.5μm的双核铱(iii)配合物被分别滴加至含有2.5μm的ssdna(ss-17)，dna(ds-17)或g-四链体dna(ps2.m,c-myc,pu27andc-kit87)的tris-hcl缓冲液(20mmtris,ph7.0)中，3分钟后检测其发光强度。

实施例2

荧光竞争法(g4-fid)实验测定：

在tris-hcl缓冲液(20mmtris，100mmkcl，ph＝7.4)中于90℃下加热10分钟使ps2.mg-四链体dna形成，然后缓慢冷却至室温备用；接下来，分别在0.25μm的ds-17或ps2.m溶液中加入指示浓度的噻唑橙(thiazoleorange，to)(对于ds-17为0.75μm，对于ps2.mg-四联体dna为0.5μm，并将这两个体系分别培育1小时；在滴加相应浓度的双核ir(ⅲ)配合物5分钟后，扫描反应体系的发射强度；通过使用以下等式将to的荧光面积转换成取代百分比(pd)；pd＝100-[(fa/fa0)×100](其中，“fa0”表示在不存在双核ir(ⅲ)配合物时dna/to复合物的荧光面积；“fa”表示存在双核ir(ⅲ)配合物时dna/to复合物的荧光面积。

实施例3

水溶液中农药的检测：

首先，将1μmdna探针(dp)和3μmhg²⁺离子混合，在每个dna探针分子中形成三个t-hg²⁺-t碱基对，获得dp/hg²⁺杂交体；接着，将各种浓度的涕灭威和1mu/ml的ache在37℃于tris-hcl缓冲溶液(10mmtris，10mmmgcl2，100mmnacl，ph＝8.0)中反应30分钟；然后，将30μm氯化乙酰硫胆碱(atch)加入上述溶液中，并在37℃下进一步反应100分钟；接着，在tdt反应缓冲液(0.2m二甲胂酸钾，0.025mtris，0.01％(v/v)tritonx-100，ph＝7.2)中进行tdt酶聚合反应；聚合反应溶液含有0.2mmdatp，0.3mmdgtp，20utdt，0.25mmcocl2和一定体积的tdt反应缓冲液；2小时后，将一定量的kcl加入到反应溶液中以促进g-四链体的形成；最后，在发射检测之前将2μm的双核ir(ⅲ)配合物i-1加入到制备的样品中，进行荧光测试。

表1本发明实施例提供的dna序列