本发明涉及类胡萝卜素提取领域，尤其是涉及一种培养斜生栅藻藻种生产天然类胡萝卜素的方法。
背景技术：
类胡萝卜素被证实是高级营养制品和药品之一，在维护骨骼和牙齿健康、预防骨质疏松症、预防和治疗白内障和黄斑变性、防治糖尿病、预防阿尔茨海默氏病及预防心脑血管疾病具有突出的保健功能(吴青莹等.中国食物与营养,2016，22(4):32-34)，它是癌症预防剂、溃疡抵制剂和生命延长剂。然而，人体自身无法合成类胡萝卜素，主要是从蔬菜和水果中摄取，在销售市场中的类胡萝卜素的以化学合成为主，远不能满足现代消费者的需求，而且目前大部分企业使用的类胡萝卜素大多是含有致基因突变作用成分的化学合成产品，而天然类胡萝卜素则不存在这方面的问题(华跃进等，专利号201210001376)。因此，从化学合成转为从斜生栅藻新驯化藻种中提取是一种理想的选择。
大豆黄浆水是豆制品加工过程中所产生的废水，大豆黄浆水含有维生素b2、维生素b12、碳水化合物、大豆低聚糖、大豆异黄酮和大豆乳清蛋白等功能性成分，总糖含量约为0.6-0.7%左右。用大豆黄浆水生产类胡萝卜素，延长了产业链，实现了变废为宝，减少了环境污染(李云捷等，科技与创新，2016，5：9-10)，实现资源的循环利用，并且创造出一定的社会和经济效益，对实现所向往的美好生活有重要的现实意义。
硒被美誉为“长寿元素”、“天然解毒剂”等，我国是缺硒大国，缺硒人口4亿之众，缺硒与40多种疾病有关。硒是一种生物抗氧化剂,它在斜生栅藻的代谢中,很可能是作为生长因子参与类胡萝卜素合成相关酶系的正向调节，适当浓度时促进藻细胞的生长及次级代谢产物的合成。适量硒和天然类胡萝卜素中的虾青素等成分能够协同作用,故具有极高的经济价值。而且富硒天然类胡萝卜素具有重要而广泛的医学预防保健功能,如能抗高血压、抗糖尿病、抗高血脂、防癌抗癌、抗脂肪肝、抗老年痴呆症、抗炎抗溃疡、抗衰老和延年益寿等等。
茉莉酸甲酯作为一种內源的信号分子，可以诱导许多植物的生理反应，调控植物的生长发育、抗逆性反应和次生代谢产物的合成。
斜生栅藻新驯化藻种(scenedesmusobliquusnew)非常容易大规模生产,是一种极具潜力的硒天然类胡萝卜素生物来源，这种藻具有突出的抗氧化能力的主要原因之一是其能合成包含特有的虾青素在内的次生类胡萝卜素并且含量积累高，藻体很可能通过次生类胡萝卜素的流动性来高效支持藻细胞生长。开发利用富硒天然类胡萝卜素具有重要的商业应用价值。解决补硒问题能够扩大消费人群，让更多的消费者享受到硒天然类胡萝卜素强大抗氧化性所带来的好处。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种斜生栅藻新驯化藻种(scenedesmusobliquusnew)生产天然类胡萝卜素的方法，该方法是针对大量的大豆黄浆水作为废物被排放掉而造成的大量浪费和严重污染(万端极等，专利号201310660674)以及新型斜生栅藻特有高抗氧化能力（特别是scenecarotenoid）的开发利用，提供的一种解决黄浆水治理难题、工艺精简化的利用黄浆水培养斜生栅藻生产天然类胡萝卜素新产品的方法，所用藻种为本实验室选育驯化的，来源于荆楚理工学院生物工程学院。本发明的方法包括以下步骤：
s1、黄浆水预处理：将豆制品制作过程中的黄浆水收集后，使用5-7层纱布过滤，过滤后调整黄浆水滤液的ph值至7.5-8.0；
s2、制取富硒黄浆水培养基：在s1制得的黄浆水滤液中添加质量体积比为8%-12%的富硒马铃薯汁和质量体积比为25%-35%的浓缩富硒泉水，黄浆水滤液、富硒马铃薯汁和浓缩富硒泉水的质量比为7:2:1，然后采用121℃、30min高压蒸汽灭菌法灭菌，制得富硒黄浆水培养基；
s3、活化斜生栅藻藻种：用s2中获得的富硒黄浆水培养基培养活化斜生栅藻藻种；
s4、藻种初步培养：在富硒黄浆水培养基中接种s3中活化后的斜生栅藻藻种,初始接种密度是0.95×106个/ml，使用红光灯管照射培养，强度为1500-2000lux,加入茉莉酸甲酯，25℃静止培养,直至斜生栅藻培养到对数生长期；
s5、藻种诱导培养：将对数生长期的斜生栅藻的培养温度提高到32-37℃，在蓝光灯管照射下,提高光照强度到7500-7700lux进行诱导培养，光暗周期为21h：3h的培养架中培养，添加葡萄糖和木糖到培养基中使葡萄糖和木糖浓度分别达到8-12g/l和27.0-37.0g/l，每天震荡摇瓶一次,培养15-20天；
s6、破坏叶绿素和藻体细胞破壁：取出s5中藻液离心去上清，收集藻体沉淀，在藻体沉淀中加入质量分数为2%-4%的koh溶液和18%-20%的甲醇溶液破坏叶绿素8-10min，离心收集沉淀，溶于灭菌水中，然后进行低温高压均质破壁处理或超声波破壁处理得到破壁后的藻体细胞；
s7、类胡萝卜素萃取：将s6中破壁后的藻体细胞中加入冰浴过的质量分数为75%-90%的乙醇溶液进行类胡萝卜素提取，料液比为1:4.2，料液比单位为mg/ml，提取时间为冰浴40-50min，重复提取次数2-3次，直至藻体变白，过滤并收集类胡萝卜素提取液；
s8、类胡萝卜素干品制备：将s7中的类胡萝卜素提取液经过蒸去溶剂、浓缩、结晶、真空干燥后得到类胡萝卜素干品。
所用斜生栅藻藻种为本实验室选育驯化，来源于荆楚理工学院生物工程学院，斜生栅藻藻种的含虾青素为0.09%，由紫外辐射和亚硝基胍复合胁迫的方法培育而成。
富硒马铃薯汁的含硒量为1.75-1.95mg/kg，浓缩富硒泉水含硒量为20-24mg/l。
红光灯管为左右两侧给光，两侧红光灯管与藻液之间的距离均为12-14cm，富硒黄浆水培养基中茉莉酸甲酯浓度在对数生长期前3天由3.5mg/ml提高到5.25mg/ml。
蓝光灯管为顶部给光，顶部与藻液之间的距离为32-34cm，胁迫诱导类胡萝卜素。
低温高压均质破壁的条件为:9℃,70mpa,料液比为1:5.5，料液比单位为mg/ml，循环2-3次。
本发明利用了豆制品黄浆水培养斜生栅藻新驯化藻种(scenedesmusobliquusnew)生产天然类胡萝卜素物质，为综合利用豆制品黄浆水开辟了一种新的用途，变废为宝，首次生产富硒天然类胡萝卜素新品，用于(保健）食品和饲料添加剂中使用,从而提高豆制品企业经济效益。
本发明的有益效果是：（1）适量硒加快藻体生长，藻体繁殖超快，每克藻体干重最后可得新型天然类胡萝卜素scenecarotenoid干品123.12mg，充分利用了斜生栅藻新驯化藻种(scenedesmusobliquusnew)生产类胡萝卜素的高效、生产周期短的特点，对实现工业化生产有明显帮助。（2）藻体细胞中富硒类胡萝卜素提取率高，且产品没有毒性残留、安全性高，在补有机硒成为新时尚的前提下，极具开发前景和市场价值。
附图说明
图1是本发明方法的工艺流程框图。
具体实施方式
以下将结合附图所示及实施例对本发明作进一步详细说明，本发明中的“质量体积比”是指富硒马铃薯汁和浓缩富硒泉水的质量占与黄浆水滤液体积的比值，其中当富硒马铃薯汁和浓缩富硒泉水的质量以“g”作为单位时，相对应的体积的单位为“l”。
实施例1
以jn-6001型低温高压均质机进行低温高压均质破壁和乙醇提取为例
本发明的一种斜生栅藻藻种生产天然富硒天然类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：s1、黄浆水预处理：将豆制品制作过程中的黄浆水收集后，使用5-7层纱布过滤，过滤后使用naoh调整黄浆水滤液的ph值至7.5-8.0；
s2、制取富硒黄浆水培养基：在s1制得的黄浆水滤液中添加质量体积比为8%-12%的富硒马铃薯汁(来自"世界硒都"恩施)和质量体积比为25%-35%的浓缩富硒泉水(来自"世界硒都"恩施)，黄浆水滤液、富硒马铃薯汁和浓缩富硒泉水的质量比为7:2:1，然后采用121℃、30min高压蒸汽灭菌法灭菌，制得富硒黄浆水培养基；
s3、活化斜生栅藻藻种：用s2中获得的富硒黄浆水培养基培养活化斜生栅藻藻种；
s4、藻种初步培养：在富硒黄浆水培养基中接种s3中活化后的斜生栅藻藻种,初始接种密度是0.95×106个/ml，使用红光灯管照射培养，强度为1500-2000lux,加入茉莉酸甲酯，25℃静止培养,直至斜生栅藻培养到对数生长期；
s5、藻种诱导培养：将对数生长期的斜生栅藻的培养温度提高到32-37℃，在蓝光灯管照射下,提高光照强度到7500-7700lux进行诱导培养，光暗周期为21h：3h的培养架中培养，添加葡萄糖和木糖到培养基中使葡萄糖和木糖浓度分别达到8-12g/l和27.0-37.0g/l，相对氮缺乏，硝酸钠的浓度为0，每天震荡摇瓶一次,培养15-20天；
s6、破坏叶绿素和藻体细胞破壁：取出s5中藻液离心去上清，收集藻体沉淀，在藻体沉淀中加入质量分数为2%-4%的koh溶液和18%-20%的甲醇溶液破坏叶绿素8-10min，离心收集沉淀，溶于灭菌水中，然后采用jn-6001型低温高压均质机（广州聚能生物科技有限公司）进行低温高压均质破壁处理得到破壁后的藻体细胞；
s7、类胡萝卜素萃取：将s6中破壁后的藻体细胞中加入冰浴过的质量分数为87%的乙醇溶液进行类胡萝卜素提取，料液比为1:4.2，料液比单位为mg/ml，提取时间为冰浴40-50min，重复提取次数2-3次，直至藻体变白，过滤并收集类胡萝卜素提取液，类胡萝卜素的抽出率在93%以上；
s8、类胡萝卜素干品制备：将s7中的类胡萝卜素提取液经过蒸去溶剂、浓缩、结晶、真空干燥后得到类胡萝卜素干品。
斜生栅藻藻种的含虾青素为0.09%，由紫外辐射和亚硝基胍复合胁迫的方法培育而成，采用《湖北农业科学》中的《产虾青素的斜生栅藻藻种的培育》中的方法进行培育得到的斜生栅藻新驯化藻种(scenedesmusobliquusnew)。
富硒马铃薯汁的含硒量为1.75-1.95mg/kg，浓缩富硒泉水含硒量为20-24mg/l。
红光灯管为22w，内设光调节旋钮，红光灯管为左右两侧给光，两侧红光灯管与藻液之间的距离均为12-14cm，富硒黄浆水培养基中茉莉酸甲酯浓度在对数生长期前3天由3.5mg/ml提高到5.25mg/ml。
蓝光灯管为20w，内设光调节旋钮，蓝光灯管为顶部给光，顶部与藻液之间的距离为32-34cm，胁迫诱导类胡萝卜素。
低温高压均质破壁的条件为:9℃,70mpa,料液比为1:5.5，料液比单位为mg/ml，循环2-3次。
所述培养架使用的是本人已申请的实用新型专利“一种微藻培养箱”中的培养架。
实施例2
以超声波辅助和乙醇提取为例
s1、黄浆水预处理：将豆制品制作过程中的黄浆水收集后，使用5-7层纱布过滤，过滤后使用naoh调整黄浆水滤液的ph值至7.5-8.0；
s2、制取富硒黄浆水培养基：在s1制得的黄浆水滤液中添加质量体积比为8%-12%的富硒马铃薯汁和质量体积比为25%-35%的浓缩富硒泉水，黄浆水滤液、富硒马铃薯汁和浓缩富硒泉水的质量比为7:2:1，然后采用121℃、30min高压蒸汽灭菌法灭菌，制得富硒黄浆水培养基；
s3、活化斜生栅藻藻种：用s2中获得的富硒黄浆水培养基培养活化斜生栅藻藻种；
s4、藻种初步培养：在富硒黄浆水培养基中接种s3中活化后的斜生栅藻藻种,初始接种密度是0.95×106个/ml，使用红光灯管照射培养，强度为1500-2000lux,加入茉莉酸甲酯，25℃静止培养,直至斜生栅藻培养到对数生长期；
s5、藻种诱导培养：将对数生长期的斜生栅藻的培养温度提高到32-37℃，在蓝光灯管照射下,提高光照强度到7500-7700lux进行诱导培养，光暗周期为21h：3h的培养架中培养，添加葡萄糖和木糖到培养基中使葡萄糖和木糖浓度分别达到8-12g/l和27.0-37.0g/l，每天震荡摇瓶一次,培养15-20天；所述培养架使用的是本人已申请的实用新型专利“一种微藻培养箱”中的培养架。
s6、破坏叶绿素和藻体细胞破壁：取出s5中藻液离心去上清，收集藻体沉淀，在藻体沉淀中加入质量分数为2%-4%的koh溶液和18%-20%的甲醇溶液破坏叶绿素8-10min，离心收集沉淀，溶于灭菌水中，溶解后进行超声波细胞破壁；超声波辅助破壁38℃提取，提取时间45min，类胡萝卜素的抽出率相对较高；
s7、类胡萝卜素萃取：将s6中破壁后的藻体细胞中加入冰浴过的质量分数为75%的乙醇溶液，料液比为1:6，料液比单位为mg/ml，提取时间为冰浴40-50min，重复提取次数2-3次，直至藻体变白，过滤并收集类胡萝卜素提取液；
s8、类胡萝卜素干品制备：将s7中的类胡萝卜素提取液经过蒸去溶剂、浓缩、结晶、真空干燥后得到类胡萝卜素干品。
斜生栅藻藻种的含虾青素为0.09%，由紫外辐射和亚硝基胍复合胁迫的方法培育而成，采用《湖北农业科学》中的《产虾青素的斜生栅藻藻种的培育》中的方法进行培育得到的斜生栅藻新驯化藻种(scenedesmusobliquusnew)。
富硒马铃薯汁的含硒量为1.75-1.95mg/kg，浓缩富硒泉水含硒量为20-24mg/l。
红光灯管为22w，内设光调节旋钮，红光灯管为左右两侧给光，两侧红光灯管与藻液之间的距离均为12-14cm，富硒黄浆水培养基中茉莉酸甲酯浓度在对数生长期前3天由3.5mg/ml提高到5.25mg/ml。
蓝光灯管为20w，内设光调节旋钮，蓝光灯管为顶部给光，顶部与藻液之间的距离为32-34cm，胁迫诱导类胡萝卜素。
两种提取方法的比较实验见表1：
表1
结果显示，萃取时间都为45min（即一节课左右,尤其适合学生等群体的创新创业）的条件下，本发明方法优选乙醇进行萃取，选用的提取方法中，乙醇没有毒性残留，用量少，产品安全性高。运用实施例1中方法培养斜生栅藻驯化新种可生产天然类胡萝卜素123.12mg/g干重，比实施例2中方法提取的类胡萝卜素产量提高了近一倍，低温促进了提取率，乙醇使用浓度提高，收益增加。
本课题组在2017年国家发明专利“一种富硒虾青素小球藻粉的制备方法(凌善锋等，专利公开(公告)号107384907a）”运用内源酶等酶法结合高压均质破壁提取虾青素，获得优良的效果，所以，本课题组现在正在开展进一步运用虾头壳内源酶粗酶或（和）纤维素酶等酶法辅助提取斜生栅藻天然类胡萝卜素。
上述仅本发明较佳可行的实施例而已，非因此局限本发明保护范围，依照上述实施例所作各种变形或套用均在此技术方案保护范围之内。