本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种超声辅助牡丹籽粕蛋白酶解制备抗氧化肽的方法。
背景技术：
牡丹籽中油脂含量为29～34％，对人体健康有益的亚麻酸和亚油酸的相对含量分别为57.9％和28.1％。2011年卫生部批准牡丹籽油作为新资源食品，此后油用牡丹的种植与利用受到了广泛的关注。目前，油用牡丹的种植面积大概为30万亩左右，且呈增长趋势。按照亩产牡丹籽300公斤计算，可以产生牡丹籽9万吨，每年产生油脂加工废弃物——牡丹籽饼粕高达5万吨之多，当作废弃物被处理对环境造成了极大的压力，更重要的是其中具有较高营养及保健功能的成分没有得到开发利用，造成资源的极大浪费。牡丹籽饼粕中含有35％左右的蛋白质，氨基酸组成合理，是一种理想的、潜在的优质蛋白资源。如果以其作为制备活性肽的原料，不仅可以开发一种天然的活性肽产品，还可以延伸牡丹籽加工产业链，大幅提高经济效益。
目前，人们已成功地以酪蛋白、水产品、玉米、大豆、鸡蛋、乳制品等为原料，经过蛋白酶可控酶解制备出活性肽，但上述原料均为人类的生活食物，用于制备活性肽势必会造成粮食的浪费。通过对牡丹籽饼粕中的蛋白进行酶解制备活性肽不仅可以提高牡丹籽的附加值，而且可以解决蛋白质资源浪费问题。活性肽的制备主要采用蛋白酶水解的方法，但是常规酶解存在水解效率低、水解速度慢、酶利用率低、生产成本高等缺点。利用一些物理手段对底物或参与反应的其它物质进行预处理往往能够加快水解进程。近年来，超声波技术在食品加工领域的应用越来越广泛，尤其在有效成分的提取方面应用较多，而利用超声波技术加快蛋白质酶解的报道较少。迄今为止，尚未有超声波辅助牡丹籽粕蛋白酶解制备活性肽的报道。
技术实现要素：
本发明的技术方案是：
一种超声辅助牡丹籽粕蛋白酶解制备抗氧化肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将牡丹籽粕粉碎，按照牡丹籽饼粕粉与水的质量体积比为1:5～1:20g/ml的比例进行混合；
(2)加入占原料牡丹籽饼粕质量0.5％～6％的蛋白酶，通过滴加用0.5mol/lnaoh溶液调节ph值到7.0，调节温度至50℃，在酶解开始后对酶解体系采用进行脉冲超声处理10～60min，处理条件为：频率20khz，功率10w/l～50w/l、工作/间歇比为0.5s/1s～5s/1s；超声处理停止后，继续酶解，酶解总时间1～3小时；
(3)酶解结束后，将酶解液加热至90℃保持5min从而灭酶，然后将酶解液冷却至室温，调节料液ph值到7.0，4500rpm离心10～20min后，取上清液进行真空浓缩至干物质浓度为30％w/w，将浓缩液冷冻干燥或喷雾干燥制得牡丹籽蛋白水解肽粉。
进一步的，步骤(2)中所述的蛋白酶为中性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶。
本发明的有益效果：
本发明在酶解开始后对酶解体系采用脉冲超声波处理，与经过同样酶解过程但不施加超声的对照试验相比，可以使酶解产物的肽得率提高15％～25％，清除dpph的ec50值降低15％～38％，大大提高了酶解效率和产物的活性。
具体实施方式
下面通过非限制性实施例，进一步阐述本发明，理解本发明。
抗氧化(活性)肽能够清除自由基，抑制或消除以及减缓氧化反应。其抗氧化机理包括：给抗氧化酶提供氢、缓冲生理ph值、螯合金属离子和捕捉自由基等。本发明中通过测定酶解产物对dpph自由基的清除能力评价牡丹籽粕蛋白酶解产物的抗氧化活性。牡丹籽粕蛋白水解肽产品配制成梯度浓度溶液，测定对dpph自由基的清除率，进而计算ec50值。
dpph自由基清除率的测定方法：将牡丹籽蛋白水解肽配制成不同浓度的溶液，取不同浓度溶液各2ml，加入2ml浓度为0.04g/l的dpph无水乙醇溶液，混合均匀，反应20min，4000rpm离心20min，取上清液于517nm处测定吸光值ai；分别取上述各浓度溶液2ml，加入2ml无水乙醇，反应后测得吸光值aj；以2ml浓度为0.04g/l的dpph溶液和2ml无水乙醇反应测得吸光值a0作为参比。清除率计算公式为：
edpph＝[1-(ai-aj)/a0]×100
式中：edpph为对dpph自由基的清除率，％；ai为2ml样品溶液加入2ml的dpph溶液的吸光值；aj为2ml样品溶液加入2ml无水乙醇的吸光值；a0为2ml的dpph溶液加入2ml无水乙醇的吸光值。
ec50的计算：ec50是牡丹籽蛋白水解肽对dpph清除率达到50％时的浓度。首先把样品稀释成一系列浓度，测定各浓度样品对dpph的清除率，绘制清除率和浓度的关系曲线，在曲线上查出样品的ec50值。
试验用4种商业蛋白酶的作用条件生产厂家见表1。
表1试验用蛋白酶的作用条件及生产厂家
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1
将粉碎后的牡丹籽饼粕以与水1:5g/ml的比例混合，加入占牡丹籽饼粕质量0.5％的中性蛋白酶进行酶解，酶解温度为60℃，ph7.0，在酶解开始后对酶解体系采用频率20khz，功率10w/l、工作/间歇比为0.5s/1s的脉冲超声处理10min，停止超声处理，继续酶解，酶解总时间1小时。酶解结束后，将酶解液加热至90℃保持5min灭酶，冷却至室温，4500rpm离心15min后将上清液进行真空浓缩至干物质浓度为30％(w/w)，经冷冻干燥制得牡丹籽蛋白水解肽产品，利用dpph自由基清除率的测定方法测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
对照试验1
操作步骤与实施例1相同，但在酶解开始后不施加超声波处理，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
实施例2
将粉碎后的牡丹籽饼粕以与水以质量体积比1:20g/ml的比例进行混合，以占原料牡丹籽饼粕重量6％的比例加入中性蛋白酶进行酶解，酶解温度为60℃，ph7.0，在酶解开始后对酶解体系采用频率20khz，功率50w/l、工作/间歇比为5s/1s的脉冲超声处理60min，停止超声处理，继续酶解，酶解总时间3小时。酶解结束后，将酶解液加热至90℃保持5min灭酶，冷却至室温，4500rpm离心10min后将上清液进行真空浓缩至干物质浓度为30％(w/w)，经喷雾干燥制得牡丹籽蛋白水解肽产品，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
对照试验2
操作步骤与实施例2相同，但在酶解开始后不施加超声波处理，，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
实施例3
将粉碎后的牡丹籽饼粕以与水以质量体积比1:13g/ml的比例进行混合，以占原料牡丹籽饼粕重量3％的比例加入胰蛋白酶进行酶解，酶解温度为50℃，ph8.0，在酶解开始后对酶解体系采用频率20khz，功率35w/l、工作/间歇比为3s/1s的脉冲超声处理35min，停止超声处理，继续酶解，酶解总时间2小时。酶解结束后，将酶解液加热至90℃保持5min灭酶，冷却至室温，调节料液ph到7.0，4500rpm离心10min后将上清液进行真空浓缩至干物质浓度为30％(w/w)，经喷雾干燥制得牡丹籽蛋白水解肽产品，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
对照试验3
操作步骤与实施例3相同，但在酶解开始后不施加超声波处理，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
实施例4
将粉碎后的牡丹籽饼粕以与水以质量体积比1:15g/ml的比例进行混合，以占原料牡丹籽饼粕重量3％的比例加入复合蛋白酶进行酶解，酶解温度为50℃，ph6.5，在酶解开始后对酶解体系采用频率20khz，功率30w/l、工作/间歇比为2s/1s的脉冲超声处理20min，停止超声处理，继续酶解，酶解总时间1.5小时。酶解结束后，将酶解液加热至90℃保持5min灭酶，冷却至室温，调节料液ph到7.0，4500rpm离心15min后将上清液进行真空浓缩至干物质浓度为30％(w/w)，经喷雾干燥制得牡丹籽蛋白水解肽产品，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
对照试验4
操作步骤与实施例4相同，但在酶解开始后不施加超声波处理，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
实施例5
将粉碎后的牡丹籽饼粕以与水以质量体积比1:10g/ml的比例进行混合，以占原料牡丹籽饼粕重量2％的比例加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解温度为50℃，ph9.0，在酶解开始后对酶解体系采用频率20khz，功率20w/l、工作/间歇比为3s/1s的脉冲超声处理40min，停止超声处理，继续酶解，酶解总时间2小时。酶解结束后，将酶解液加热至90℃保持5min灭酶，冷却至室温，调节料液ph到7.0，4500rpm离心20min后将上清液进行真空浓缩至干物质浓度为30％(w/w)，经喷雾干燥制得牡丹籽蛋白水解肽产品，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
对照试验5
操作步骤与实施例5相同，但在酶解开始后不施加超声波处理，测定多肽产品的得率和对dpph的清除率。
表2实施例与对照试验的多肽得率及清除dpph自由基的ec50值比较
由表2可以看出，在酶解开始后对酶解体系采用脉冲超声波处理，可以使酶解产物的肽得率提高12％～25％，清除dpph的ec50值降低15％～38％，大大提高了酶解效率和产物的活性。