本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种利用基因工程菌降解褐藻多糖生产褐藻寡糖及deh的方法。
背景技术：
褐藻多糖主要是从海带、马尾藻、巨藻等褐藻中提取的多糖聚合物，故又称褐藻胶。褐藻多糖的聚合方式有三种：由β-d-甘露糖醛酸构成的均聚物(ploym)、α-l-古罗醛酸构成的均聚物(ployg)和由β-d-甘露糖醛酸与α-l-古罗醛酸组成的mg随机交替片段(ploymg)。基于褐藻酸的化学稳定性、高粘度和易于形成凝胶的特性，褐藻酸盐被广泛用于食品添加剂、稳定剂和凝胶材料。
褐藻多糖降解后产生的褐藻寡糖有诸多生物学功能，如抗肿瘤、抗凝血、降血糖血脂、抗自由基氧化、抗炎症、调节免疫以及促进生长作用，广泛应用于医药领域、食品领域、日用化工、饲料领域和农业领域。褐藻寡糖有多重方法制备，如酸降解法、氧化降解法、超声降解法和酶降解法，用酶降解法取代传统的物理、化学法获取褐藻寡糖，是先从海藻中提取褐藻多糖，再利用褐藻多糖裂解酶通过降解反应制备褐藻寡糖，酶降解法具有降解条件温和，过程可控，得率高等优点，已经成为生产褐藻寡糖的主要方式。
褐藻多糖裂解酶的作用方式是以β-消除方式催化降解褐藻胶，在寡糖的非还原端c4,5之间形成不饱和双键，并产生一个非还原末端为4-deoxy-l-erythro-5-hexoseuloseuronicacid(deh)的结构，deh被降解为2-keto-3-deoxy-d-gluconate(kdg)后进入entner-doudoroff途径产生两分子的丙酮酸，随后转化为两分子的乙醇，因此利用酶法降解褐藻多糖制造生物能源乙醇来缓解化石能源及降低环境污染具有重要应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是利用基因工程和发酵工程生成褐藻寡糖的工艺方法，通过构建基因工程重组菌，以最大限度利用褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶生产褐藻寡糖和deh(4-deoxy-l-erythro-5-hexoseuloseuronicacid)。
本发明技术方案概述如下：
本发明提供了一种酶法降解褐藻多糖生成deh的方法，包括步骤如下：
a、分别克隆来源于黄杆菌属(flavobacteriumphragmitis)的褐藻多糖裂解酶flph(genbank:wp_091498571.1)和褐藻寡糖酶flphalx(genbank:wp_091498561.1)的基因；
b、分别构建flph和flphalx的表达载体；
c、分别在大肠杆菌宿主细胞中化转和表达含有flph和flphalx基因的表达载体，并纯化重组蛋白；
d、将重组菌表达的flph和flphalx两种重组酶按一定比例复配，以褐藻酸钠为底物转化生成褐藻寡糖和deh。
所述褐藻多糖裂解酶flph和褐藻寡糖酶flphalx的基因的碱基序列分别如seqidno:1和seqidno:2所示。
所述表达载体为pet-28a。
所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
优选的，flph和flphalx两种重组酶按蛋白浓度比例为1:1-1:5复配为酶液。
更优选的，flph和flphalx两种重组酶按蛋白浓度比例为1:4复配为酶液。
优选的，步骤d是在pbs缓冲液反应体系含有0.15mnacl、0.15％(w/v)的褐藻酸钠，加入flph与flphalx蛋白浓度比例为1:1-1:5复配的总浓度100-300μg/ml的酶液，于30℃过夜反应。
本发明有益效果：
本发明利用了flph只能利用褐藻多糖生产褐藻寡糖，不能生产deh，而flphalx不仅可以利用褐藻多糖生产褐藻寡糖，而且可以利用褐藻寡糖生产deh，本发明构建了flph与flphalx两种酶的重组菌并通过对两种酶进行复配来生产deh，利用褐藻酸钠得到的deh转化率可以达到85％以上，得到的deh可以进一步用来生产生物能源乙醇，缓解化石燃料和环境压力，本发明较其他单一酶反应的催化效率更高，操作可控，更适于工业化应用。
附图说明
图1a：flphalx蛋白镍亲和层析sds-page验证图。其中，line1：上清；line2：沉淀；line3：流穿液；line4：溶前；line5：elution；line6：溶后。
图1b：flph蛋白镍亲和层析sds-page验证图。其中，line1：上清；line2：沉淀；line3：流穿液；line4：wash；line5：溶前；line6：溶后；line7：elution。
图2：褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶作用后产物tlc鉴定。其中，line1：底物褐藻酸盐；line2：flphalx反应液；line3：flph：反应液。
图3：褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶作用后产物hplc鉴定图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶重组工程菌的构建
(1)提取黄杆菌属(flavobacteriumphragmitis)基因组，基因组提取方法参照omega公司生产的细菌dna提取试剂盒(货号：d3350-01)说明书。
(2)pcr扩增flph和flphalx基因
引物(5’-3’)flphalx-f：ggaattccatatgaagaattttttagcgcttaatc，
引物(5’-3’)flphalx-r：cccaagcttctaatacatcattttctgctttaaattttg，
采用pcr方法扩增出flphalx约2,300bp的基因片段。
引物(5’-3’)flph-f：ggaattccatatggatttaaaattttcaaaaatttc，
引物(5’-3’)flph-r：cccaagcttctaatgagacacttgaaggtcgtata，
采用pcr方法扩增出flph约860bp的基因片段。
pcr反应体系(50μl)：
在0.2mlep管中按以下顺序分别加入各试剂：
pcr反应条件：
pcr反应结束后，取2μl扩增产物进行琼脂糖凝胶(0.8％)电泳，观察结果并纯化回收约860bp处(flph)和2,300bp处(flphalx)的pcr产物。
(3)dna纯化回收
采用omega公司的小量dna纯化回收试剂盒(货号：d2000-02)，具体操作步骤如下：
1)向pcr产物中加入3-5倍体积的buffercp，充分混匀，室温静置2min。
2)将上述混合溶液转移至吸附柱中，室温静置2min，13,000r/min离心1min，弃滤液。
3)向吸附柱中加入700μldnawashbuffer，13,000r/min离心1min，弃滤液。
4)向吸附柱中加入500μldnawashbuffer，13,000r/min离心1min，弃滤液。
5)13,000r/min离心2min，除去吸附柱漂洗液。将吸附柱放入一个干净的ep管中置于室温放置10分钟，彻底晾干。
6)向吸附膜中间位置悬空滴加30～50μl的ddh2o，室温放置2min。12,000r/min离心2min，收集dna溶液，-20℃保存。
7)用琼脂糖凝胶电泳检测回收成功。
(4)酶切反应
将纯化后的pcr扩增产物用ndei和hindiii双酶切，然后分别和经过同样双酶切后的pet-28a质粒连接。
pcr产物的酶切反应体系(50μl)：
在0.2mlep管中按以下顺序分别加入各试剂：
载体质粒的酶切反应体系(50μl)：
在0.2mlep管中按以下顺序分别加入各试剂：
37℃反应2h，琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物。
(5)参照omega公司的胶回收纯化试剂盒(货号：d2500-02)说明书将酶切产物纯化回收。
(6)连接、转化
通过琼脂糖电泳确定基因与载体的浓度，调整两者的倍数使载体与目的基因的摩尔比为1:1-2:1，连接反应体系如下：
目的基因3μl
载体1μl
solutioni4μl；
16℃反应6h或者过夜。
将连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热击90s，立即冰浴5min；加入500μllb复苏液，37℃，220r/min复苏培养40-60min；4,000r/min离心5min，沉淀用200μllb培养基悬浮，混合涂布于含有amp的抗性平板上，待菌液充分吸收后，37℃倒置培养12～16h至出现单菌落；挑取单菌落，提取质粒dna，做酶切鉴定。
(7)阳性克隆重组质粒的筛选与鉴定
参照omega公司的快速质粒提取试剂盒(货号：d6943-02)提取质粒，将质粒按照下列体系酶切验证重组质粒：
37℃反应4h，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并将验证正确的阳性克隆送去北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
(8)将重组质粒分别转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，37℃过夜培养。挑取单克隆于含氨苄霉素的lb的液体培养基中培养，分别获得褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的基因重组菌株。
实施例2：褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的蛋白表达与纯化
褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的蛋白表达：挑取两重组菌单菌落，分别接入到5ml含amp抗性的lb液体培养基，于37℃，220r/min培养过夜。按照1％的接种量接种到200ml的摇瓶中，37℃，220r/min培养约2h，在od＝600nm处测定菌液吸光度值，当菌体浓度od600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.25mm的iptg，16℃，160r/min，诱导培养16h。4℃5,000r/min,15min收集菌体。
褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的纯化：用lysisbuffer(20mmtirs-hcl20mm咪唑500mmnaclph＝7.4)悬浮细胞，混匀后加入200μl溶菌酶和300μlpmsf，混匀后倒入烧杯中冰浴20min。细胞悬液超声破碎20min(超声2.5s，间隔3.0s)。将破碎液4℃，12,000r/min离心30min，将上清液与用lysisbuffer平衡好的ni-ntasuperflow结合1h，使混合的样品流经纯化柱，用washbuffer(20mmtirs-hcl20mm咪唑500mmnaclph＝7.4)洗去杂质蛋白,再用elutionbuffer(20mmtirs-hcl500mm咪唑500mmnaclph＝7.4)溶出目的蛋白，最后通过sds-page验证，鉴定得到的目的蛋白高纯度高达95％以上，结果如图1所示，然后将褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶用pbs将elutionbuffer透析去除，通过超滤浓缩分别得到褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶。
实施例3：tlc鉴定褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的产物
在1ml反应体系中加上0.15mnacl、0.15％(w/v)的褐藻酸钠以及分别添加适量的褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶，于30℃过夜反应。将反应液煮沸5min后离心去除沉淀，用玻璃点样毛细管点在距薄层层析板上(tlcsilicagel60f254，germany)下端1cm处不同位置，展开剂为正丁醇：醋酸：水(2:1:1，v:v:v)，层析缸展开剂高度要低于样品线，当液面到达距离上端1cm，取出硅胶板，挥发掉展开剂，喷上显色剂(茴香醛：甲醇：h2so4＝1：15：2)，121℃加热10min，结果如图2所示，flph只能降解褐藻多糖生成褐藻寡糖，flphalx的降解产物既有褐藻寡糖也有deh(4-deoxy-l-erythro-5-hexoseuloseuronicacid)。
实施例4：hplc鉴定褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶的产物
在1ml反应体系中加上0.15mnacl、0.15％(w/v)的褐藻酸钠以及添加适量的褐藻多糖裂解酶和褐藻寡糖酶，于30℃下过夜反应。将反应液煮沸5min后离心去除沉淀，将反应液稀释合适浓度到液相小瓶中，采用hplc对产物进行定性分析，测定条件为：
色谱仪：agilent1200；
检测器：蒸发光散射检测器(alltechchrom，elsd6000)
进样：agilent自动进样器；进样量10μl；
色谱柱：prevailcarbohydrateescolumn-w(5μm,4.6×250mm,agelatechnologies,china)；柱温40℃；
流动相：80％乙腈；流速1ml/min。
结果如图3所示，褐藻二糖和deh在柱子中得到很好的保留和分离。
实施例5：复合酶转化褐藻多糖生成deh
在1mlpbs缓冲液反应体系中包含0.15mnacl、0.15％(w/v)的褐藻酸钠，按照flph与flphalx蛋白浓度比例为1:1-1:5复配酶液，酶浓度由bca蛋白浓度测定试剂盒测定(北京索莱宝，货号：pc0020)，于30℃过夜反应。结果显示deh的转化率达到85％以上，其中1:4复配时(flph与flphalx蛋白浓度别为50μg/ml和200μg/ml)转化率最高可达95％以上。
实施例6：生产deh放大反应
参照实施例5中的复配酶比例，在3l摇瓶中按照1l的反应液添加8.7gnacl、1.5g的褐藻酸钠，以及按照flph与flphalx蛋白浓度比例为1:2添加到反应液中，用pbs缓冲液补足到1l，在30℃摇床上设定一个转速，过夜反应，测定转化率，deh转化率达到87％以上。
实施例7：deh产物的纯化
(1)将反应液中的酶煮沸5min使其变性，12,000rpm离心5min去除蛋白质沉淀；
(2)将上一步的上清液用真空冷冻干燥剂干燥，重悬于95％的乙醇中溶解deh，离心后与褐藻寡糖分离；
(3)将溶解于乙醇中的deh用氮吹仪吹干，即可得到deh，收率可达90％以上。
虽然本发明已以较佳实施公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。
序列表
<110>天津科技大学
<120>一种酶法降解褐藻多糖生成deh的方法
<141>2018-05-23
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2304
<212>dna
<213>黄杆菌属(flavobacteriumphragmitis)
<400>1
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