一种用牡丹籽饼粕制备牡丹小肽的方法及牡丹小肽的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用牡丹籽饼粕制备牡丹小肽的方法，该方法为以油用牡丹籽榨油后得到的牡丹籽饼粕为原料，加入水、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶以及碱性2709蛋白酶和/或中性Neutrase蛋白酶进行混合水解制成牡丹功能小肽。所述的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2：0-1.2:0-1.2。本发明提供的方法快速、简便，条件温和，制备得到的牡丹小肽最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高营养、易吸收，克服了植物蛋白难以消化吸收的问题，且抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性显著。
【专利说明】一种用牡丹籽饼粕制备牡丹小肽的方法及牡丹小肽的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于农副产品加工与再利用【技术领域】，具体涉及一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法及牡丹小肽的应用。
【背景技术】
[0002]牡丹籽油含有多种不饱和脂肪酸，尤其是罕见的奇数脂肪酸，是一种具有重要开发价值的食用油脂来源。2011年3月22日，中华人民共和国卫生部批准自丹凤牡丹(faeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang)和紫斑牡丹(Paeoriia rockii)的籽仁经过经压榨、脱色、脱臭等工艺制成的牡丹籽油作为新资源食品可以生产及食用【中华人民共和国卫生部公告，2011年第9号:卫生部关于批准元宝枫籽油和牡丹籽油作为新资源食品的公告】。这将为牡丹籽油的生产和使用起到非常大的促进作用。由于牡丹籽油的高营养价值，我国油用牡丹的种植量在逐渐增多，油用牡丹籽的产量也逐年增加。按照目前的产量，油用牡丹籽产量为3万吨，按照出油率为30%计算，榨油后将会产生大约I万吨的牡丹籽饼柏，这些牡丹籽饼柏的开发利用将会是一个非常重要且任务艰巨的研究课题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，该方法快速、简便，条件温和，制备得到的牡丹小肽最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高营养、易吸收，克服了植物蛋白难以消化吸收的问题，且抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性显著。
[0004]本发明实现上述目的采用的技术方案是:一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，以油用牡丹籽榨油后得到的牡丹籽饼柏为原料，加入水、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶以及碱性2709蛋白酶和/或中性Neutrase蛋白酶进行混合水解制成牡丹功能小肽。
[0005]所述的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase 蛋白酶的重量比为 1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2。
[0006]所述的用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，具体步骤如下:
1)取油用牡丹籽原材料，脱壳后得到牡丹籽仁，备用；将得到的牡丹籽仁用碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3-4次，晾干水分后炒制，然后采用压榨法压榨去除油脂，得到牡丹籽饼柏，备用；
2)将步骤I)得到的牡丹籽饼柏粉碎过60-100目筛，然后加入到反应釜中，加入其重量4-8倍的水在温度为50-70°C下搅拌15-20min，调节pH值为6.4-7.5，得到原料液，备用；
3)将步骤2)得到的原料液升温至110-120°C，保温15-30min进行灭菌，灭菌结束后冷却至40-50°C，加入培养成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的质量百分数为1.0-8.0%，混合蛋白酶由重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合组成，控制温度为40-50 V，搅拌速度为100-200 r/min，在无菌空气条件下水解48-96h，水解结束后升温至110_120°C进行高温灭活，过滤除渣，得到的滤液即为含有牡丹小肽的营养液。
[0007]将步骤3)得到的滤液减压浓缩至体积为原体积的1/4-1/3，经喷雾干燥制得牡丹小肽粉。
[0008]所述的步骤I)除杂用的碱水的pH值为8.5-9.5。
[0009]所述的步骤2)调节pH值用的是20%氢氧化钠溶液。
[0010]所述的步骤3)采用板框过滤或膜过滤进行过滤。
[0011]所述的用牡丹籽饼柏制备的牡丹小肽在抗氧化、抗肿瘤及抗菌方面的应用。
[0012]本发明的有益效果
其一、本发明提供的制备方法快速、简便，条件温和，操作方便，适合规模化制备牡丹功能小肽，充分利用复合蛋白酶来水解牡丹籽饼柏蛋白，制备得到的牡丹小肽分子量较小，分布均匀，最大限度的保留了牡丹籽的功能，天然、高营养、易吸收，克服了植物蛋白难以消化吸收的问题，且抗氧化、抗菌和抗肿瘤等多种生物活性显著。
[0013]其二、本发明充分利用牡丹籽榨油后的废弃物，将牡丹籽饼柏研究开发及再利用，对于牡丹籽饼柏的研究开发利用将会起到一定的促进作用，对牡丹相关深加工产品的研究开发具有借鉴意义。
【具体实施方式】
[0014]一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，以油用牡丹籽榨油后得到的牡丹籽饼柏为原料，加入水、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶以及碱性2709蛋白酶和/或中性Neutrase蛋白酶进行混合水解制成牡丹功能小肽。
[0015]所述的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase 蛋白酶的重量比为 1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2。
[0016]所述的用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，具体步骤如下:
1)取油用牡丹籽原材料，脱壳后得到牡丹籽仁，备用；将得到的牡丹籽仁用碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3-4次，晾干水分后炒制，然后采用压榨法压榨去除油脂，得到牡丹籽饼柏，备用；
2)将步骤1) 得到的牡丹籽饼柏粉碎过60-100目筛，然后加入到反应釜中，加入其重量4-8倍的水在温度为50-70°C下搅拌15-20min，调节pH值为6.4-7.5，得到原料液，备用；
3)将步骤2)得到的原料液升温至110-120°C，保温15-30min进行灭菌，灭菌结束后冷却至40-50°C，加入培养成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的质量百分数为1.0-8.0%，混合蛋白酶由重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合组成，控制温度为40_50°C，搅拌速度为100-200 r/min，在无菌空气条件下水解48-96h，水解结束后升温至110_120°C进行高温灭活，过滤除渣，得到的滤液即为含有牡丹小肽的营养液。
[0017]将步骤3)得到的滤液减压浓缩至体积为原体积的1/4-1/3，经喷雾干燥制得牡丹小肽粉。
[0018]所述的步骤I)除杂用的碱水的pH值为8.5-9.5。
[0019]所述的步骤2)调节pH值用的是20%氢氧化钠溶液。
[0020]所述的步骤3)采用板框过滤或膜过滤进行过滤。[0021]所述的用牡丹籽饼柏制备的牡丹小肽在抗氧化、抗肿瘤及抗菌方面的应用。
[0022]以下结合具体实施例对本发明做进一步说明:
实施例1:
一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，具体步骤如下:
1)取凤丹牡丹籽原材料20kg，脱壳后得到牡丹籽仁，备用；将得到的牡丹籽仁用pH值为9.5碱水浸泡除杂，再用清水洗涤4次，晾干水分后炒制，然后采用压榨法压榨去除油脂，得到牡丹籽饼柏8.7 kg，备用；
2)取步骤I)得到的牡丹籽饼柏Ikg，粉碎过100目筛，然后加入到反应釜中，加入其重量8倍的水在温度为70°C下搅拌20min，用20%氢氧化钠溶液调节pH值为6.4-7.5，得到原料液，备用；
3)将步骤2)得到的原料液升温至120°C，保温30min进行灭菌，灭菌结束后冷却至50°C，加入培养成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的质量百分数为8.0%，混合蛋白酶由重量比为1:1.2: 1.2:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶混合组成，控制温度为50°C，搅拌速度为200 r/min，在无菌空气条件下水解96h，水解结束后升温至11 0-120°C进行高温灭活，采用板框过滤除渣，得到的滤液即为含有牡丹小肽的营养液。
[0023]将步骤3)得到的滤液减压浓缩至体积为原体积的1/3，经喷雾干燥制得牡丹小肽粉 120g。
[0024]实施例2:
一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，具体步骤如下:
1)取紫斑牡丹籽原材料10kg，脱壳后得到牡丹籽仁，备用；将得到的牡丹籽仁用pH值为8.5碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3次，晾干水分后炒制，然后采用压榨法压榨去除油脂，得到牡丹籽饼柏3.6 kg，备用；
2)取步骤I)得到的牡丹籽饼柏Ikg，粉碎过60目筛，然后加入到反应釜中，加入其重量4倍的水在温度为50°C下搅拌15min，用20%氢氧化钠溶液调节pH值为7.0,得到原料液，备用；
3)将步骤2)得到的原料液升温至110°C，保温15min进行灭菌，灭菌结束后冷却至40°C，加入培养成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的质量百分数为1.0%，混合蛋白酶由重量比为1:1.2: 1.2:1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合组成，控制温度为40°C，搅拌速度为100 r/min，在无菌空气条件下水解48h，水解结束后升温至110°C进行高温灭活，采用膜过滤除渣，得到的滤液即为含有牡丹小肽的营养液。
[0025]将步骤3)得到的滤液减压浓缩至体积为原体积的1/4，经喷雾干燥制得牡丹小肽粉 108g。
[0026]实施例3:
一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，具体步骤如下:
I)取以任意比例混合的凤丹牡丹和紫斑牡丹籽原材料15 kg，脱壳后得到牡丹籽仁，备用；将得到的牡丹籽仁用PH值为9.0的碱水浸泡除杂，再用清水洗涤4次，晾干水分后炒制，然后采用压榨法压榨去除油脂，得到牡丹籽饼柏11.6 kg，备用；2)取步骤I)得到的牡丹籽饼柏Ikg，粉碎过80目筛，然后加入到反应釜中，加入其重量6倍的水在温度为60°C下搅拌18min，用20%氢氧化钠溶液调节pH值为6.4，得到原料液，备用；
3)将步骤2)得到的原料液升温至115°C，保温22min进行灭菌，灭菌结束后冷却至45°C，加入培养成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的质量百分数为4.5%，混合蛋白酶由重量比为1:1:1:1:1的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合组成,控制温度为45°C,搅拌速度为150 r/min,在无菌空气条件下水解80h，水解结束后升温至115°C进行高温灭活，采用板框过滤除渣，得到的滤液即为含有牡丹小肽的营养液。
[0027]将步骤3)得到的滤液减压浓缩至体积为原体积的3/10，经喷雾干燥制得牡丹小肽粉107g。
[0028]活性测试试验
1.抗肿瘤活性研究 1)试验材料
胎牛血清，96孔培养板，恒温箱，RPM1640培养液。
[0029]2)方法
对上述实施例中得到的牡丹小肽进行细胞毒活性测试，采用的方法为MTT法。
[0030]3)试验步骤
(I)取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPM1640培养液，制成单细胞悬液5 X IO4个/mL,将该悬液加到96孔培养板中，每孔加入I X IO4个细胞。培养24 h后,加入受试小肽浓度分别为30 μ g/mL、10 μ g/mL。
[0031](2)将平板在37 °C，含5%C02空气及100%湿度的恒温箱中孵育3天，去除培养液。
[0032](3) MTT用无血清的RPM1640培养液配成I mg/mL溶液，每孔加100 μ L，37°C温育4 h，使MTT还原为甲臢。
[0033](4)吸出上层清液，加入150 μ L DMSO使甲臢溶解，于ELISA仪570 nm处测OD值。
[0034]4)试验结果
表1牡丹小肽细胞毒活性实验数据(n=3):-nzr?--
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2.抗氧化活性研究I)试验材料
牡丹功能小肽粉末(制备方法见实施例1)。
[0035]亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、1，1- 二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)、氯化硝基四氮唑(NBT)、无水乙醇、双氧水、2，6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)、水杨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、盐酸(HCl)均为分析纯，大豆卵磷脂(>90%)。
[0036]2)方法
(I)清除超氧阴离子自由基(0_2.)的测定方法
用PH8.0、浓度50mol/L的Tris-HCl缓冲液将牡丹小肽稀释成不同的浓度梯度，各取
1.5mL不同浓度牡丹小肽溶液，然后依次加入0.5mL NBT (300 μ mol/L，以ρΗ8.0的Tris-HCl缓冲液配制),0.5mL NADH (468 μ mol/L,以 ρΗ8.0 的 Tris-HCl 缓冲液配制),0.5mL PMS(60 μ mol/L,以ρΗ8.0的Tris-HCl缓冲液配制)，混匀后在25°C中水浴5分钟，取出在波长560 nm处测定吸光度，空白对照组以缓冲液代替芪类溶液。
[0037]
【权利要求】
1.一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，其特征在于:以油用牡丹籽榨油后得到的牡丹籽饼柏为原料，加入水、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶以及碱性2709蛋白酶和/或中性Neutrase蛋白酶进行混合水解制成牡丹功能小肽。
2.如权利要求1所述的一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，其特征在于:所述的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶的重量比为 1:0.8-1.2:0.8-1.2 :0-1.2:0-1.2。
3.如权利要求1所述的一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，其特征在于:具体步骤如下: 1)取油用牡丹籽原材料，脱壳后得到牡丹籽仁，备用；将得到的牡丹籽仁用碱水浸泡除杂，再用清水洗涤3-4次，晾干水分后炒制，然后采用压榨法压榨去除油脂，得到牡丹籽饼柏，备用； 2)将步骤I)得到的牡丹籽饼柏粉碎过60-100目筛，然后加入到反应釜中，加入其重量4-8倍的水在温度为50-70°C下搅拌15-20min，调节pH值为6.4-7.5，得到原料液，备用； 3)将步骤2)得到的原料液升温至110-120°C，保温15-30min进行灭菌，灭菌结束后冷却至40-50°C，加入培养成熟的混合蛋白酶，并使其在原料液中的质量百分数为1.0-8.0%，所述混合蛋白酶由重量比为1:0.8-1.2:0.8-1.2:0-1.2:0-1.2的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性2709蛋白酶和中性Neutrase蛋白酶混合组成，控制温度为40-50 V，搅拌速度为100-200 r/min，在无菌空气条件下水解48-96h，水解结束后升温至110_120°C进行高温灭活，过滤除渣，得到的滤液即为含有牡丹小肽的营养液。
4.如权利要求3所述的一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，其特征在于:将步骤3)得到的滤液减压浓缩至体积为原体积的1/4-1/3，经喷雾干燥制得牡丹小肽粉。
5.如权利要求3所述的一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，其特征在于:所述的步骤I)除杂用的碱液的PH值为8.5-9.5。
6.如权利要求3所述的一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，其特征在于:所述的步骤2)调节pH值用的是20%氢氧化钠溶液。
7.如权利要求3所述的一种用牡丹籽饼柏制备牡丹小肽的方法，其特征在于:所述的步骤3)采用板框过滤或膜过滤进行过滤。
8.如权利要求1或3所述的用牡丹籽饼柏制备的牡丹小肽在抗氧化方面的应用。
【文档编号】C12P21/06GK104017850SQ201410294944
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】刘普, 邓瑞雪, 易军鹏, 尹卫平, 李小方, 高嘉屿, 田轶, 段文录, 曹辉 申请人:河南科技大学