本发明属于加工工艺领域，涉及超声波辅助酶法制备茶渣ace抑制肽的方法及其应用。
背景技术：
茶叶中含有大量有益于人体健康的物质，长期饮用有助于延缓衰老，降低血压血脂。我国作为世界上生产及消费茶叶最多的国家之一，大批茶叶生产加工厂的兴起在推动行业发展的同时，也产生了大量的废弃茶渣。1998年，krishnapillais从废弃茶渣中提取出多种有益成分，粗蛋白(17％-19％)、粗纤维(16％～18％)及茶多酚(1％-2％)，并发现它们均具有一定的功能性：茶蛋白可在食品加工过程中部分替代大豆蛋白，还具有防电离辐射、抗氧化等功能；茶多糖可防治糖尿病；茶多酚具有清除自由基能力。
其中，茶渣蛋白作为茶渣中重要的组分之一，具有不溶于水，氨基酸组成合理等特点，经过粗加工后大部分仍保留于茶渣之中，可被充分利用。然而，现有的多数文献还只是停留在研究茶蛋白的提取工艺及功能性质，而未能基于已验证得到的茶蛋白的功能性质如降血压、抗衰老、抗疲劳等，进一步开发制备相对应的功能性茶多肽，以便更好的被人体所吸收利用。
高血压作为常见的心血管疾病，许多人深受其害。世界上每年有近150万人因罹患高血压而身亡，我国更是有近乎2亿的庞大高血压病患群体。因此积极寻找、开发研制高效、安全的降血压药物成为解决这个严重的公共问题的关键。据现代医学研究结果表明，血管紧张素转化酶(ace酶)的高活性是引发高血压的主要原因。人工化学合成的ace抑制剂如疏甲丙脯氨酸，作为降压药虽具有良好的降压效果，但同时伴有一定的咳嗽、皮疹等副作用。因此，人们将目标转向易获取、安全性高的食物源ace抑制肽。
食源性ace抑制肽主要来源于动物蛋白和植物蛋白。目前植物源ace抑制肽多集中于从大豆蛋白、菜籽蛋白、玉米蛋白、花生蛋白等中提取。而茶叶属于草本类植物，且茶蛋白本身已被验证有一定的降血压作用，因此若能尝试利用超声波辅助酶解制备得到茶渣ace抑制肽，不但能够丰富植物源ace抑制肽种类，也为高血压患者带来极大的福音，为茶渣再利用的深入研究提供新的思路。
但是，目前鲜少报道从茶渣中提取茶渣ace抑制肽的方法，而利用茶渣蛋白制备茶渣ace抑制肽并加入超声波辅助酶解的研究尚未见报道。
技术实现要素：
为弥补茶渣功能性多肽研究方面的空缺，本发明的目的是提供一种超声辅助酶法制备茶渣ace抑制肽的方法。以本发明所提供的酶解工艺，可制备得到活性较高的茶渣ace抑制肽，一方面为茶渣及茶渣副产品的进一步开发和利用提供基础，另一方面有望应用于高血压疾病的预防和治疗当中。
本发明的另一目的在于提供一种高ace抑制率的茶渣ace抑制肽，所述茶渣ace抑制肽采用超声辅助酶法制备。
本发明的另一目的在于提供一种茶渣ace抑制肽在降血压药物或保健食品方面的应用。
本发明上述目的是通过以下技术方案予以实现：
一种超声波辅助酶法制备茶渣ace抑制肽的方法，包括以下步骤：
(1)将茶渣制备为茶渣粉末；利用反相微乳法提取茶渣粉末中所含的茶渣蛋白，并将所得的蛋白液进行真空浓缩、冷冻干燥处理；
(2)取步骤(1)中所得的冻干茶渣蛋白溶于蒸馏水，配置成蛋白溶液；然后进行超声处理；
(3)取步骤(2)中经超声预处理的茶渣蛋白溶液，加入碱性蛋白酶并搅拌均匀，调节溶液ph；再水解得到茶渣蛋白酶解液；
(4)取步骤(3)中茶渣蛋白酶解液进行灭酶操作，再离心取上清液，备用；
(5)取步骤(4)的上清液进行浓缩干燥，即得茶渣ace抑制肽。
其中，所述步骤(1)中茶渣粉末的制备方法为：将茶渣经沸水浸提、烘干粉碎、过80目筛制得；所述茶渣选自混合的废弃茶渣。
优选的，所述步骤(2)中蛋白溶液浓度为1～5％，超声处理条件为：超声波功率为100～600w，超声波温度控制在20～80℃，超声波时间为5～80min。
更优选的，所述步骤(2)中蛋白溶液浓度为1～2.5％，超声波功率为300～400w，超声波温度控制在45～60℃，超声波时间为28～60min。
优选的，所述步骤(3)的实验操作具体为：加入碱性蛋白酶8000u/g并搅拌均匀，快速调节溶液ph7～9；然后置于恒温水浴振荡器中水解2～4h，反应温度为45℃～70℃，得到茶渣蛋白酶解液。
更优选的，所述步骤(3)中快速调节ph8.5～9，反应温度为45～60℃。
优选的，所述步骤(3)中所加碱性蛋白酶为本发明经过前期大量的研究所筛选出的酶解茶渣蛋白效果好且制备所得茶渣ace抑制肽活性较高的食品级工业用酶，本发明所用碱性蛋白酶购买于诺维信(中国)生物技术有限公司，测其酶活力为6.53×104u/g。
优选的，所述步骤(4)中的实验操作具体为：将所述茶渣蛋白酶解液置于90℃～100℃水浴保温5～10min进行灭酶操作；结束后冷却至室温，10000r/min离心10～20min，取上清液，备用。
更优选的，将步骤(4)中离心所得的上清液超滤，所用滤膜的分子截留量为3kd，再将超滤液浓缩干燥即得茶渣ace抑制肽。
另外，由上述超声波辅助酶解制备茶渣ace抑制肽的工艺方法制备得到的高ace抑制率的茶渣ace抑制肽以及该茶渣ace抑制肽在降血压药物或降血压功能性食品方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)首次从茶渣中制备得到茶渣ace抑制肽，并通过超声辅助酶解的方式得到较高活性的茶渣ace抑制肽。
(2)有别于将超声波直接作用于酶解反应的方式，本发明仅对茶渣蛋白进行超声预处理，旨在改变蛋白的构象，使得折叠于蛋白质内部的活性部位一一展露，有利于酶与底物结合，推动酶解的进程，促进活性较高的小分子量(＜3kda)茶渣ace抑制肽的生成。
(3)制备茶渣ace抑制肽实施的过程中所需的酶解、超声波、离心、超滤、冷冻干燥等设备技术成熟度高、可行性强，便于后期大规模的工业化生产和投放；
(4)本发明以茶渣为原料，制备所得茶渣ace抑制肽具有绿色天然、无毒副作用等特点，有望在食品、药品等生产加工环节得到实际应用，以此提高茶渣副产物的附加值。
附图说明
图1为实施例5超声功率对茶渣ace抑制肽的抑制率影响。
图2为实施例6超声时间对茶渣ace抑制肽的抑制率影响。
图3为实施例7超声温度对茶渣ace抑制肽的抑制率影响。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
(1)茶渣经沸水浸提、烘干粉碎、过80目筛，制得茶渣粉末；利用反相微乳法提取茶渣粉末中所含的茶渣蛋白，并将所得的蛋白液进行真空浓缩、冷冻干燥处理。
(2)取步骤(1)中所得的冻干茶渣蛋白溶于蒸馏水，配置成浓度为2.5％的蛋白溶液；然后进行超声处理，超声处理的条件为：超声功率300w，超声温度控制在45℃，超声时间28min。
(3)取步骤(2)中经超声预处理的茶渣蛋白溶液，加入碱性蛋白酶(8000u/g)并搅拌均匀，快速调节溶液ph8.5；然后置于恒温水浴振荡器中水解2h，反应温度为60℃，得到茶渣蛋白酶解液，测定此时酶解液的水解度为24.5％。蛋白质水解度的测定采用ph-stat法，反应快速、直观。(操作方法参考：adler-nissen，j.enzymichydrolysisoffoodproteins.london:el-sevierappliedsciencepublishers；1986.pp.116-124)
(4)取步骤(3)中茶渣蛋白酶解液置于100℃沸水浴中保温10min进行灭酶操作。结束后冷却至室温，10000r/min离心10min，取上清液经分子截留量为3kda的滤膜进行超滤处理。对所得超滤液进行真空浓缩、冷冻干燥，并对产物的ace抑制活性进行测定，得ace抑制率为82.3％。ace活性测定采用紫外分光光度法。参考cushman并稍作修改(cushmandw，cheunghs.spectrophotometricassayandpropertiesoftheangiotensin-convertingenzymeofrabbitlung[j].biochempharmacol，1971，20：1637-1648.)。每份茶渣蛋白水解液需同时做一个空白样，一个对照，它们的区别主要在于上述试剂的添加顺序差异，具体操作如表1所示。
表1检测ace抑制活性的操作(单位μl)
在37℃水浴1h，反应结束后迅速加入1mol/lhcl以终止反应(样c需提前加入hcl)；接着向每份样品中加入1ml冰冻乙酸乙酯，旋涡混合后离心(4000r/min,l5min)；吸取上层脂溶液750μl，置于120℃烘箱烘干；待冷却后加入3ml去离子，旋涡半分钟，在228nm波长处测定吸光度。
计算公式如下：
ace抑制活性％＝(ab-aa)/(ab-ac)×100％
其中:aa样品a的吸光值；
ab样品b的吸光；
ac样品c的吸光值。
对比例1
取消实施例1步骤(2)中对蛋白溶液进行超声预处理的操作，对配置好的浓度为2％的茶渣蛋白溶液进行步骤(3)，其余等同于实施例1，步骤(3)所得酶解液的水解度为21.3％，步骤(4)经超滤后的滤液经过真空浓缩、冷冻干燥，测得产物的ace抑制率为66.7％。
实施例1与对比例1相比较，区别在于是否加入超声波作用，通过对比可发现，经过超声处理的蛋白溶液，水解度及所得产物的ace抑制活性均优于未经超声处理的。
对比例2
取消实施例1步骤(4)中对酶解液进行超滤处理，即只对经超声辅助酶解所得的酶解液进行步骤(4)中的真空浓缩、冷冻干燥处理，其余等同于实施例1，步骤(3)所得酶解液的水解度为24.5％，酶解液经步骤(4)中真空浓缩、冷冻干燥处理，测得ace抑制率为64.8％。
实施例1与对比例2相比较，区别在于酶解液是否进行超滤处理，通过对比发现，超滤所截留的分子量＜3kda的茶渣ace抑制肽比未经超滤处理的具有更高的ace抑制活性。
对比例3
取消实施例1步骤(2)中对蛋白溶液进行超声预处理的操作以及取消实施例1步骤(4)中对酶解液进行超滤处理，即准确称取一定量的冻干茶渣蛋白，按比例加蒸馏水溶解；接着加入碱性蛋白酶(8000u/g)并搅拌均匀，快速调节溶液ph8.5；然后置于60℃恒温水浴振荡器中水解2h，反应结束后水解液经灭酶、离心等处理，取上清液测定水解度为21.3％，将滤液经过真空浓缩、冷冻干燥，测得产物的ace抑制率为52.3％。
实施例1与对比例3相比较，区别在于酶解液是否加入超声波处理和超滤处理，通过对比发现，超声波预处理酶解液以及超滤所截留的分子量＜3kda的茶渣ace抑制肽比未经超滤处理的具有更高的ace抑制活性。
实施例2
(1)茶渣经沸水浸提、烘干粉碎、过80目筛，制得茶渣粉末；利用反相微乳法提取茶渣粉末中所含的茶渣蛋白，并将所得的蛋白液进行真空浓缩、冷冻干燥处理。
(2)取步骤(1)中所得的冻干茶渣蛋白溶于蒸馏水，配置成浓度为2.5％的蛋白溶液；然后进行超声处理，超声处理的条件为：超声功率400w，超声温度控制在45℃，超声时间28min。
(3)取步骤(2)中经超声预处理的茶渣蛋白溶液，加入碱性蛋白酶(8000u/g)并搅拌均匀，快速调节溶液ph8.5；然后置于恒温水浴振荡器中水解2h，反应温度为60℃，得到茶渣蛋白酶解液，测定此时酶解液的水解度为19.5％。
(4)取步骤(3)中茶渣蛋白酶解液置于100℃沸水浴中保温10min进行灭酶操作。结束后冷却至室温，10000r/min离心10min，取上清液经分子截留量为3kda的滤膜进行超滤处理。对所得超滤液进行真空浓缩、冷冻干燥，并对产物的ace抑制活性进行测定，得ace抑制率为72.3％。
实施例3
(1)茶渣经沸水浸提、烘干粉碎、过80目筛，制得茶渣粉末；利用反相微乳法提取茶渣粉末中所含的茶渣蛋白，并将所得的蛋白液进行真空浓缩、冷冻干燥处理。
(2)取步骤(1)中所得的冻干茶渣蛋白溶于蒸馏水，配置成浓度为2.5％的蛋白溶液；然后进行超声处理，超声处理的条件为：超声功率300w，超声温度控制在60℃，超声时间28min。
(3)取步骤(2)中经超声预处理的茶渣蛋白溶液，加入碱性蛋白酶(8000u/g)并搅拌均匀，快速调节溶液ph8.5；然后置于恒温水浴振荡器中水解2h，反应温度为60℃，得到茶渣蛋白酶解液，测定此时酶解液的水解度为18.9％。
(4)取步骤(3)中茶渣蛋白酶解液置于100℃沸水浴中保温10min进行灭酶操作。结束后冷却至室温，10000r/min离心10min，取上清液经分子截留量为3kda的滤膜进行超滤处理。对所得超滤液进行真空浓缩、冷冻干燥，并对产物的ace抑制活性进行测定，得ace抑制率为66.4％。
实施例4
(1)废弃茶渣，经沸水浸提、烘干粉碎、过80目筛，制得茶渣粉末；利用反相微乳法提取茶渣粉末中所含的茶渣蛋白，并将所得的蛋白液进行真空浓缩、冷冻干燥处理。
(2)取步骤(1)中所得的冻干茶渣蛋白溶于蒸馏水，配置成浓度为2.5％的蛋白溶液；然后进行超声处理，超声处理的条件为：超声功率300w，超声温度控制在45℃，超声时间60min。
(3)取步骤(2)中经超声预处理的茶渣蛋白溶液，加入碱性蛋白酶(8000u/g)并搅拌均匀，快速调节溶液ph8.5；然后置于恒温水浴振荡器中水解2h，反应温度为60℃，得到茶渣蛋白酶解液，测定此时酶解液的水解度为16.8％。
(4)取步骤(3)中茶渣蛋白酶解液置于100℃沸水浴中保温10min进行灭酶操作。结束后冷却至室温，10000r/min离心10min，取上清液经分子截留量为3kda的滤膜进行超滤处理。对所得超滤液进行真空浓缩、冷冻干燥，并对产物的ace抑制活性进行测定，得ace抑制率为54.2％。
实施例5
(1)废弃茶渣，经沸水浸提、烘干粉碎、过80目筛，制得茶渣粉末；利用反相微乳法提取茶渣粉末中所含的茶渣蛋白，并将所得的蛋白液进行真空浓缩、冷冻干燥处理。
(2)取步骤(1)中所得的冻干茶渣蛋白溶于蒸馏水，配置成浓度为2.5％的蛋白溶液；然后进行超声处理。控制超声温度45℃，超声时间60min，改变超声功率从200～400w。
(3)取步骤(2)中经不同超声功率预处理的茶渣蛋白溶液，分别加入碱性蛋白酶(8000u/g)并搅拌均匀，快速调节溶液ph8.5；然后置于恒温水浴振荡器中水解2h，反应温度为60℃，得到茶渣蛋白酶解液。
(4)取步骤(3)中茶渣蛋白酶解液置于100℃沸水浴中保温10min进行灭酶操作。结束后冷却至室温，10000r/min离心10min，取上清液进行真空浓缩、冷冻干燥，并对产物的ace抑制活性进行测定，结果如表2所示。随着超声功率的加强,茶渣ace抑制肽的抑制率先增后减。当超声功率为300w,抑制率达到最高62.3％。通过实验发现，超声功率继续增强,抑制率明显下降。这可能是因为超声的机械作用一定程度上改变了蛋白质的结构,强度适宜的超声作用使之结构变的更有利于与酶结合反应,从而增大了抑制率；反之,则使得抑制率减小。
表2超声功率对茶渣ace抑制肽活性的影响
实施例6
(1)废弃茶渣，经沸水浸提、烘干粉碎、过80目筛，制得茶渣粉末；利用反相微乳法提取茶渣粉末中所含的茶渣蛋白，并将所得的蛋白液进行真空浓缩、冷冻干燥处理。
(2)取步骤(1)中所得的冻干茶渣蛋白溶于蒸馏水，配置成浓度为2.5％的蛋白溶液；然后进行超声处理。控制超声温度45℃，超声功率300w，改变超声时间10～60min。
(3)取步骤(2)中经不同超声时间预处理的茶渣蛋白溶液，分别加入碱性蛋白酶(8000u/g)并搅拌均匀，快速调节溶液ph8.5；然后置于恒温水浴振荡器中水解2h，反应温度为60℃，得到茶渣蛋白酶解液。
(4)取步骤(3)中茶渣蛋白酶解液置于100℃沸水浴中保温10min进行灭酶操作。结束后冷却至室温，10000r/min离心10min，取上清液进行真空浓缩、冷冻干燥，并对产物的ace抑制活性进行测定，结果如表3所示。随着超声时间的推移，在超声30min时茶渣ace抑制肽的抑制率最大达62.7％。将温度控制于上述范围内，可解释为短暂的超声处理可使得包藏于蛋白质内部的活性部位有所释放,增加与酶接触的几率。但超声长时间持续进行，不利于蛋白质活性部位的维稳，蛋白易发生聚集,因此ace抑制率呈下降的趋势。
表3超声时间对茶渣ace抑制肽活性的影响
实施例7
(1)废弃茶渣，经沸水浸提、烘干粉碎、过80目筛，制得茶渣粉末；利用反相微乳法提取茶渣粉末中所含的茶渣蛋白，并将所得的蛋白液进行真空浓缩、冷冻干燥处理。
(2)取步骤(1)中所得的冻干茶渣蛋白溶于蒸馏水，配置成浓度为2.5％的蛋白溶液；然后进行超声处理。控制超声功率300w，超声时间60min，改变超声温度从30～60℃。
(3)取步骤(2)中经不同超声温度预处理的茶渣蛋白溶液，分别加入碱性蛋白酶(8000u/g)并搅拌均匀，快速调节溶液ph8.5；然后置于恒温水浴振荡器中水解2h，反应温度为60℃，得到茶渣蛋白酶解液。
(4)取步骤(3)中茶渣蛋白酶解液置于100℃沸水浴中保温10min进行灭酶操作。结束后冷却至室温，10000r/min离心10min，取上清液进行真空浓缩、冷冻干燥，并对产物的ace抑制活性进行测定，结果如表4所示。超声温度增加，茶渣ace抑制肽的抑制率先增后减。超声温度为45℃，抑制率达到最高62.8％。超声温度持续上升，抑制率急速下降。一方面，可能过高的超声温度损伤了蛋白酶的活性，使得酶解产物的ace抑制力表现为下降趋势；另一方面温度过高也有可能导致茶渣蛋白变性溶解性降低，从而影响后续的酶解效果。
表4超声温度对茶渣ace抑制肽活性的影响