本发明属于食品生物技术领域，具体涉及寡肽的制备方法，尤其涉及以微拟球藻渣为原料制备高附加值寡肽的方法，以及其在食品工业的应用。
背景技术：
二十碳五烯酸(c20:5，n-3，epa)，是一种ω-3多不饱和脂肪酸，具有广泛的生物活性，同时也是一些人体组织细胞膜的重要组成部分，具有重要的生理功能，已经证实增加epa的吸收对治疗冠状动脉心脏病、高血压有效。长期以来，epa主要来源于鱼油，但由于渔业资源的减少以及环境问题的日益突出，人们已开始寻找epa的替代来源。由于微拟球藻(nannochloropsissp.)可在很短的生长周期内积累大量的epa，越来越受到关注，被认为是最有潜力的epa的生产者。目前，微拟球藻已在我国开始大规模养殖。但由于技术所限，微拟球藻提取epa藻油后剩余的藻渣一般都作为固体废弃物或廉价的饲料，总体利用率低，经济效益差。针对这种情况，本发明尝试开发一种以微拟球藻渣为原料制备高附加值寡肽的方法，以达到增效的目的。
寡肽是一种蛋白质水解后的产物，由于其分子量更小，更容易被人体吸收，能在食品行业广泛应用而具有较高的经济价值。高f值寡肽是由2～9个氨基酸残基组成的混合寡肽体系，其显著特征是支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)与芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)含量的摩尔比值较高，一般大于20。研究表明，高f值寡肽具有保肝护肝、促进酒精代谢、抗疲劳、抗氧化、降低血清胆固醇等生理功能。现代营养学研究发现，寡肽经摄食后能够以载体转运或细胞旁路渗透的形式被完整吸收，二肽或三肽的吸收速率显著高于相同组分的游离氨基酸，可广泛应用于保健食品、营养食品和运动员食品等领域。
发明专利zl201210136559.8公开了“一种玉米高f值寡肽饮料的制备方法”；该专利只提供了酶解工艺，并未对所得寡肽的分子量以及f值进行评价，无法明确所得寡肽的产品特性。发明专利申请201610015101.5公开了“一种具有醒酒护肝活性的高f值寡肽生产方法”；该工艺中包含了三级超滤和一级纳滤过程，工艺繁琐，产品损失率和生产成本高，且该专利中并未阐明寡肽的肽链组成。发明专利申请200810237196.0公开了“从盐藻渣中制备水解低聚糖和短肽的方法”，该发明以脱除β－胡萝卜素的盐藻渣为原料，先经多次分离及酶水解，后经浓缩、干燥，制得多种产品。该发明综合利用盐藻渣制得日化、医药、保健多种产品；且有生产工艺简单、能耗低、成本低，生产过程中无“三废”排放等特点。然而，由于盐藻不具有细胞壁，细胞内容物提取简易，该方案不适于具有细胞壁的微藻种类的内容物提取。目前，尚未见以微拟球藻渣为原料制备高附加值寡肽的相关报道。
技术实现要素：
基于目前微拟球藻渣利用不充分以及寡肽生产工艺繁琐的现状，本发明提供了一种以微拟球藻渣为原料制备高附加值寡肽的方法。本发明解决了微拟球藻渣利用率低的问题，提升微拟球藻渣的营养价值，产生了巨大的经济效益。
本发明的技术方案：
采用微拟球藻渣制备高附加值寡肽的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取适量提取过藻油的微拟球藻渣，将其与去离子水按重量体积比1:15-1:30混合，搅拌均匀，在30-70mpa的压力条件下均质处理30-60分钟；冷却至20-35℃，得到预处理后的微拟球藻渣。通过预处理过程，可有效破坏微拟球藻细胞壁及细胞内部结构；同时高压均质作用也可破坏大蛋白分子结构增加蛋白的水溶性，起到了预水解作用，大大提高了后续提取蛋白的效率和得率，也有利于提高终产品——寡肽的f值。
(2)水解：按照料液重量比为1:5～1:15，向步骤(1)得到的微拟球藻渣中加入适量去离子水，得到混合液；向混合液中加入饱和氢氧化钙水溶液，调节ph值至7.0～10.0。向混合液中同时加入水解酶a和水解酶b，恒温、恒定ph值条件下反应；达到反应时间后，加热终止酶解反应，分离并收集得到上清液a；所述反应的温度为30～60℃，反应时间为6～24h。反应过程中通过补充饱和氢氧化钙水溶液维持体系的ph值恒定。多酶复合水解有效提高了微拟球藻渣的水解效率。
所述水解酶a为胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或几种；所述水解酶a与微拟球藻渣的质量比为1:10～1:100。所述水解酶b为氨肽酶、风味蛋白酶和羧肽酶中的一种或几种；所述水解酶b与微拟球藻渣的质量比为0.1:10～1.5:10。
(3)一步精制：调节上清液a的ph值至3.0～9.0，向上清液a中加入活性炭，活性炭与上清液a的重量体积比为1:10～1:100，恒温搅拌，反应结束后，分离并收集得到上清液b。所述活性炭为食品级粉末活性炭，粒度为100-200目。所述反应的温度为15～60℃，反应的时间为0.5～6.0h。
(4)二步精制：将上清液b在真空条件下加热浓缩，得到上清液c；通过浓缩提高寡肽溶液中游离芳香族氨基酸的浓度，使游离芳香族氨基酸从溶液中析出；然后过滤分离，收集得到上清液d；通过过滤分离脱除游离芳香族氨基酸，进一步提高微拟球藻寡肽产品的f值，降低产品中游离氨基酸的质量分数。
所述真空条件的真空度为0.01～0.08mpa，加热温度为40～90℃；所述上清液c的固形物含量为15～30％。所述的过滤分离方式为板框过滤、离心过滤和真空转鼓过滤中的一种或几种。
(5)干燥杀菌：将上清液d经干燥、包装、杀菌，即得高附加值寡肽产品；所述的干燥方式为常压干燥或真空干燥。所述高附加值寡肽的f值高于30，二肽和三肽在总蛋白中所占比例高于90％，大大提高了生物活性和肠道吸收利用率，从而避免了繁琐的分级超滤过程，节约生产成本，缩短生产周期，提高产品得率和产品品质。
采用微拟球藻渣制备的高附加值寡肽的应用，将其应用于制备食品，所述高附加值寡肽的用量为食品总重量的15-30％。
本发明的有益效果：
(1)本发明解决了微拟球藻提取油脂后藻渣价值低、利用率低的问题，提升了微拟球藻渣的营养价值及经济价值，弥补了现有技术的不足。
(2)本发明中对具有细胞壁的微拟球藻渣进行了高压均质处理，有效破坏细胞壁及细胞内部结构，从而大大提高了后续提取效率和寡肽得率。
(3)本发明采用多酶复合水解工艺，有效提高了微拟球藻渣的水解效率，从而避免了繁琐的分级超滤过程，节约生产成本，缩短生产周期，提高产品得率和产品品质。
附图说明
图1：本发明中高附加值寡肽各组分所占比例的分布情况。
其中，(a)为实施例1中高附加值寡肽的组分组成分布；(b)为实施例2中高附加值寡肽的组分组成分布；(c)为实施例3中高附加值寡肽的组分组成分布；(d)为实施例4中高附加值寡肽的组分组成分布。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：采用微拟球藻渣制备高附加值寡肽
(1)取微拟球藻渣10kg，向微拟球藻渣中加入去离子水150l，70mpa下均质处理30分钟，均质后冷却至20℃。
(2)向混合液中加入饱和氢氧化钙水溶液，调节混合液的ph为7.0，向混合液中加入木瓜蛋白酶0.05kg、中性蛋白酶0.05kg和风味蛋白酶1.5kg，在30℃反应釜中搅拌反应24h，反应结束后，加热至90℃终止酶解反应，分离收集上清液a共40l。
(3)调节上清液a的ph值为3.0，加入粒度为100目的活性炭粉4kg，在15℃反应釜中搅拌反应6h，反应结束后，采用板框过滤分离，收集上清液b。
(4)将上清液b在真空条件下加热浓缩，真空度为0.01mpa，加热温度为40℃，浓缩至上清液中固形物含量为30％，即得上清液c，采用板框过滤分离，收集上清液d。
(5)上清液d经喷雾干燥(进风温度为200℃，出风温度为80℃)、包装、杀菌后，即得高附加值寡肽产品。
将所得高附加值寡肽采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，具体如下所述：
1)色谱条件：色谱柱为waterssymmetryc18(150mm×2.1mm，5μm)，流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为0.1％甲酸乙腈溶液，洗脱条件为0～40％b梯度洗脱，洗脱时间为30min，流速为250μl/min，进样量为5μl，柱温为30℃。
2)质谱条件：电离方式为电喷雾，喷雾电压为4.5kv，毛细管温度为350℃，质谱扫描范围(m/z)为50～1500，正离子模式。
3)结果计算：采用mascotdistiller软件分析高附加值寡肽中各组分的肽链序列。
经检测，实施例1制备的高附加值寡肽的得率为29％，蛋白含量为89％，f值为31，总蛋白中二肽和三肽的含量分别为78.9％和14.5％(见附图1a)，灰分含量为6.5％。
实施例2：采用微拟球藻渣制备高附加值寡肽
(1)取微拟球藻渣10kg，向微拟球藻渣中加入去离子水300l，30mpa下均质处理60分钟，均质后冷却至35℃。
(2)向混合液中加入饱和氢氧化钙水溶液，调节混合液的ph为10.0，向混合液中加入碱性蛋白酶1kg和氨肽酶0.05kg，羧肽酶0.05kg，在60℃反应釜中搅拌反应6h，反应结束后，加热至90℃终止酶解反应，分离收集上清液a共120l。
(3)调节上清液a的ph值为9.0，加入粒度为200目的活性炭粉1.2kg，在60℃反应釜中搅拌反应0.5h，反应结束后，采用板框过滤分离，收集上清液b。
(4)将上清液b在真空条件下加热浓缩，真空度为0.08mpa，加热温度为90℃，浓缩至上清液中固形物含量为15％，即得上清液c，采用板框过滤分离，收集上清液d。
(5)上清液d经喷雾干燥(进风温度为200℃，出风温度为80℃)、包装、杀菌后，即得高附加值寡肽产品。
将所得高附加值寡肽采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，具体方法详见实施例1。
经检测，实施例2制备的高f值寡肽的得率为25％，蛋白含量为90％，f值为34，总蛋白中二肽和三肽的含量分别为73.1％和21.5％(见附图1b)，灰分含量为6.3％。
实施例3：采用微拟球藻渣制备高附加值寡肽
(1)取微拟球藻渣10kg，向微拟球藻渣中加入去离子水200l，50mpa下均质处理45分钟，均质后冷却至25℃。
(2)向混合液中加入饱和氢氧化钙水溶液，调节混合液的ph为9.0，向混合液中加入碱性蛋白酶0.5kg和风味蛋白酶0.5kg，羧肽酶0.05kg，在50℃反应釜中搅拌反应12h，反应结束后，加热至90℃终止酶解反应，分离收集上清液a共90l。
(3)调节上清液a的ph值为7.0，加入粒度为200目的活性炭粉0.7kg，在40℃反应釜中搅拌反应2h，反应结束后，采用板框过滤分离，收集上清液b。
(4)将上清液b在真空条件下加热浓缩，真空度为0.05mpa，加热温度为60℃，浓缩至上清液中固形物含量为20％，即得上清液c，采用板框过滤分离，收集上清液d。
(5)上清液d经喷雾干燥(进风温度为210℃，出风温度为80℃)、包装、杀菌后，即得高附加值寡肽产品。
将所得高附加值寡肽采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，具体方法详见实施例1。
经检测，实施例3制备的高f值寡肽的得率为27％，蛋白含量为87％，f值为35，总蛋白中二肽和三肽的含量分别为74.5％和20.5％(见附图1c)，灰分含量为5.7％。
实施例4：采用微拟球藻渣制备高附加值寡肽
(1)取微拟球藻渣10kg，向微拟球藻渣中加入去离子水250l，60mpa下均质处理40分钟，均质后冷却至30℃。
(2)向混合液中加入饱和氢氧化钙水溶液，调节混合液的ph为8.0，向混合液中加入碱性蛋白酶0.5kg，木瓜蛋白酶0.5kg和氨肽酶0.1kg，风味蛋白酶0.1kg，在40℃反应釜中搅拌反应18h，反应结束后，加热至90℃终止酶解反应，分离收集上清液a共55l。
(3)调节上清液a的ph值为6.0，加入粒度为100目的活性炭粉0.2kg，在30℃反应釜中搅拌反应3h，反应结束后，采用板框过滤分离，收集上清液b。
(4)将上清液b在真空条件下加热浓缩，真空度为0.07mpa，加热温度为50℃，浓缩至上清液中固形物含量为25％，即得上清液c，采用板框过滤分离，收集上清液d。
(5)上清液d经喷雾干燥(进风温度为190℃，出风温度为90℃)、包装、杀菌后，即得高附加值寡肽产品。
将所得高附加值寡肽采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，具体方法详见实施例1。
经检测，实施例4制备的高f值寡肽的得率为27％，蛋白含量为86.5％，f值为32，总蛋白中二肽和三肽的含量分别为72.9％和21.9％(见附图1d)，灰分含量为6.6％。
综上可知，实施例1-4制备高f值寡肽的得率为25-29％，蛋白含量为86.5-90％，f值为31-35；总蛋白中二肽的含量为72.9-78.9％，三肽的含量为14.5-21.9％，二肽和三肽在总蛋白中所占比例为93.4-95.0％。与现有技术相比，本发明不但实现了微拟球藻渣的高价值利用，达到了低成本高产出的目标，而且大大提高了寡肽得率。此外，所述高附加值寡肽的f值高于30，二肽和三肽在总蛋白中所占比例高于90％，大大提高了生物活性和肠道吸收利用率，从而避免了繁琐的分级超滤过程，节约生产成本，缩短生产周期，提高产品得率和产品品质。
本发明制备的微拟球藻高附加值寡肽可以广泛应用于保健食品、营养食品或运动员食品等领域，实施例5-7以功能肽含片为例说明本发明制备的高附加值寡肽在食品工业中的应用。
实施例5：高附加值寡肽在食品工业中的应用
取本发明实施例1制备的寡肽粉10g，加入去离子水4ml，混匀；再向其中加入环糊精10g，充分溶解后；向其中依次加入糊精7.5g、苹果酸1.75g、淀粉10.75g、维生素c0.5g、木糖醇5g，均质；再向其中加入硬脂酸镁0.5g，均质，过筛，干燥，压片。
本实施例中，每粒含片的质量约为800mg，其中微拟球藻寡肽的含量为20％。
实施例6：高附加值寡肽在食品工业中的应用
取本发明实施例2制备的寡肽粉15g，加入去离子水20ml，混匀；再向其中加入环糊精15g，充分溶解后；向其中依次加入糊精15g、柠檬酸3.0g、淀粉20g、维生素c3.5g、木糖醇7.5g，均质；再向其中加入硬脂酸镁1.0g，均质，过筛，干燥，压片。
本实施例中，每粒含片的质量约为800mg，其中微拟球藻寡肽的含量为15％。
实施例7：高附加值寡肽在食品工业中的应用
取本发明实施例3制备的寡肽粉30g，加入去离子水20ml，混匀；再向其中加入环糊精15g，充分溶解后；向其中依次加入苹果酸5.0g、淀粉20g、维生素c3.0g、木糖醇6.0g，均质；再向其中加入硬脂酸镁1.0g，均质，过筛，干燥，压片。
本实施例中，每粒含片的质量约为800mg，其中微拟球藻寡肽的含量为30％。