本发明属于天然色素提取纯化技术领域，具体涉及一种从野樱莓渣中提取与纯化花青素的方法。
背景技术：
野樱莓（aroniamelanocarpa），学名黑果腺肋花楸，原产于北美洲东部湿树林和沼泽，我国自1989年起，先后从国外引进8个品种，发展至今我国已经拥有较丰富的种植资源。野樱莓果实中富含多酚、糖类、有机酸、矿物质、维生素和多种微量元素，其中多酚含量是目前水果中最高的。近年来国内对其功能性研究增多，其果汁具有很强的抗氧化性，还有抗癌、抗炎、防止尿路感染、治疗糖尿病、保肝、治疗肥胖的作用，其提取物对防治心脑血管疾病效果显著，经常食用野樱莓，能调整人体机能，调节血压，具有缓解衰老的作用，具有“第三代水果”之称。
野樱莓属于蔷薇科的一种落叶灌木，也是集食用、药用、园林和生态等价值于一身的珍贵树种，其成熟浆果果汁略带点甜（中度含糖量），微酸。其果实可用于加工果汁、果酒、果酱、罐头、果脯等食品和饮料，主要的销售特点是它的抗氧化性能。野樱莓果实及其提取物对心脏病、高血压等心脑血管疾病具有特殊的疗效，伊利诺斯州立大学功能食品项目的研究人员得出了野樱莓果实含有治疗癌症和心脏病的结论。野樱莓还含有对人体有益的成分：维生素b6、b12、e、c，叶酸，奎宁酸，多酚酸，单宁，儿茶素，槲黄素，芸香素，橙皮苷，白藜芦醇和花青素。这些天然活性成分中存在苯环等芳香结构，是潜在的天然抗氧化剂资源。
但野樱莓果实中含有大量单宁，生食果实味道酸涩，口感不佳，不易被消费者接受。虽可加工成饮料、果酱、果干、果冻和果酒，但目前我国在其食品开发加工方面仍处于起步阶段，远不及国外。国内野樱莓果汁产品较少，无法满足大众的需求。以野樱莓为原料加工成的非浓缩还原汁具有丰富的营养保健功能，经常饮用能起到调整人体机能，减缓衰老等多种功效，有必要研究野樱莓为主要原料的可口非浓缩还原汁。野樱莓榨汁后，废弃大量野樱莓榨渣作为废弃物丢弃，因此其利用率大大降低。
花青素(anthocyanin)，又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物。基本结构包含二个苯环，并由一个3碳的单位连结(c6-c3-c6)。也是植物花瓣中的主要呈色物质，水果、蔬菜、花卉等五彩缤纷的颜色大部分与之有关。最新研究表明，花青素有助于预防多种与自由基有关的疾病，包括癌症、心脏病、过早衰老和关节炎；能通过防止应激反应和吸烟引起的血小板凝集来减少心脏病和中风的发生；可通过增强免疫系统能力来抵御致癌物质；能降低感冒的次数和缩短持续时间；具有抗突变的功能从而减少致癌因子的形成；具有抗炎功效，可以预防包括关节炎和肿胀在内的炎症；能增强动脉、静脉和毛细血管弹性；能松弛血管从而促进血流和防止高血压；另外，花青素还可以促进视网膜细胞中的视紫质再生，增进视力。值得一提的是，花青素也是一种天然色素，该色素在酸性条件下，呈现鲜红色，该色素无毒无副作用，安全性能高，着色色调自然，更接近天然物质的颜色。
目前，食品工业上所用的色素多为合成色素，几乎都有不同程度的毒性，长期使用会危害人的健康，因此天然色素就越来越引起了科研领域的关注：随着科技的发展，人们对食品添加剂的安全性越来越重视，合成色素的使用种类和数量已经大幅度下降，因此，开发和应用天然色素已成为世界食用色素发展的总趋势。从20世纪60年代开始，科研工作者就着手从天然资源中分离提取花青素。到目前为止，这些方法普遍存在环境污染严重、设备昂贵，方法烦琐等缺点，且无法进行大规模的分离及纯化，在实际生产中难以得到应用。这也造成现在花青素大量缺乏，价格居高不下的局面。
目前，花青素的提取生产方法主要有：柠檬酸酸化水萃取法、酸化乙醇萃取法、酶法、超声波和脉冲电场。上述前两种溶剂法提取工艺简单，但色素提取率低、需多次浸提、成品纯度低，色价低；国外多采用盐酸化甲醇、硫酸、乙酸或盐酸水溶液提取；国内则采用柠檬酸、盐酸水溶液和酸化乙醇作为提取液。超声波和脉冲电场法可有效地破坏细胞壁和细胞膜，提高组织细胞的渗透性，缩短提取时间，提高花青素得率，改善产品的质量。然而，在提取和纯化等加工过程中往往会发生天然花青素的大量损失，设备投资大。酶法则是生产周期长，占用场地多。
技术实现要素：
本发明针对现有野樱莓果汁制备与提取花青素技术中存在的问题，在制备高质量野樱莓果汁的基础上，采用经济、安全、有效的方法提取花青素产品，提高野樱莓的附加值，为野樱莓的综合利用提供了一种从野樱莓渣中提取与纯化花青素的方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种从野樱莓渣中提取与纯化花青素的方法，包括如下步骤：
(1)挑选和清洗：新鲜的野樱莓或者冷冻保藏解冻的野樱莓用ph值为6.0-7.0的人造酸性氧化电位水浸泡20-30分钟，然后清水冲洗干净；
(2)破浆与酶解：将清洗后的野樱莓放入破浆机中打浆；破浆后加入浆料质量的：0.05-0.15%果胶酶、0.05-0.15%纤维素酶和3-6%半纤维素酶，45℃水浴1.5h，每隔0.5h搅拌一次；
(3)离心分离：酶解的野樱莓浆用浆渣分离机或者离心机室温离心将果汁与野樱莓渣分离，控制转速500-3000转，时间：5-30分钟，皮渣进行提取纯化花青素，果汁备用；
⑷均质提取：用ph值为2.0-4.0的人造酸性氧化电位水与皮渣混合，酸性氧化电位水体积为皮渣体积的2-20倍，用人造酸性氧化电位水调节野樱莓渣溶液的ph至2.5〜4.5；温度25〜55℃条件下，野樱莓渣溶液中加入为野樱莓皮渣质量0.01〜0.3%的果胶酶，混合均匀，酶解2〜6小时，至野樱莓渣溶液中没有果胶被检测出为止，得酶解溶液；母液处理先控制溶液的ph值2.5-4.0，过滤后再控制溶液的ph值3.0-6.5并45-55℃下使用均质机处理3-8min，提取皮渣中花青素与多酚类物质；
（5）纯化：将提取后溶液采用滤布为60〜300目的渣分离机或者滤袋为60〜300目的离心机分离进行粗滤，得澄清溶液；澄清溶液超滤：澄清溶液用管式聚砜膜进行超滤澄清，单程澄清条件：压力为0.1〜0.7mpa，主流液速度为2-3m/s，物料温度为20〜50℃,至没有花青素流出为止；若有花青素流出，补加去离子水继续超滤；
（6）纳滤、浓缩：流出花青素液进行纳滤，压力为0.1-0.7mpa、温度为10-30℃，流出液进一步浓缩，当流出液体积减少至原体积的五分之一，停止纳滤操作，得野樱莓花青素浓缩液，浓缩液干燥后得野樱莓花青素粉末，野樱莓花青素粉末中花青素含量为50～80%。
步骤（6）获得的野樱莓花青素浓缩液加入dlol大孔树脂层析柱上，浓缩液的体积为树脂体积的2〜3倍，先用ph值4.5-6.5酸性氧化电位水洗脱，去除不被大孔树脂吸附的杂质；再用乙醇加ph值4.5-6.5电解酸性还原水洗脱，乙醇与电解酸性还原水的体积比例为20%〜95%：80%〜5%；花青素被洗脱下来，洗脱液即为花青素乙醇溶液；
花青素乙醇溶液进行纳滤，压力为0.1〜0.7mpa、温度为10〜50℃，当花青素乙醇溶液体积减少至原来体积的五分之一，停止纳滤操作，得截留液和乙醇；
用冷冻真空干燥法干燥截留液，在-18℃预冷冻3〜4小时，至截留液完全冻结；然后在真空度为0.05〜0.1mpa，温度为-10〜-30℃条件下，冷冻干燥至水分含量<5%，获得紫红色的野樱莓花青素粉末，野樱莓花青素粉末中花青素的含量为50〜90%。
步骤（3）中获得的果汁与步骤（4）中提取皮渣后获得的提取液按照体积比为3-5:1混合，得到增强型野樱莓原汁；酶解/灭酶：将增强型野樱莓原汁质量0.3-0.7%的单宁酶加入增强型野樱莓原汁中，于4-25℃下酶解0.5-1.5h，然后将酶解液升温至85℃，恒温10min进行灭酶处理，调整ph：向灭酶后的增强型野樱莓原汁中加入ph值2.0-6.0人造酸性氧化电位水，将果汁ph调整至5.5-6.5；除涩：加入果汁质量0.05-0.15%的壳聚糖，搅拌均匀后静置2-4h；均质、脱气：将除涩的增强型野樱莓原汁在58-62℃、22-26mpa条件下均质两次；常温、0.07-0.08mpa下真空脱气；灌装和间歇式微波灭菌：将均质后果汁灌装，放入微波设备内，以650-750w加热45-60s，停顿20-30s，重复2-3次，获得野樱莓非浓缩还原果汁。
获得的野樱莓非浓缩还原果汁进入无菌间，用已灭菌金属盖封罐，然后倒罐，瓶装果汁浸入50-60℃温水中，用冷水淋洗，至温度降至室温。所述超滤采用截留分子量为i〜500kda的超滤装置。所述纳滤采用截留分子量为100-200da的纳滤装置。所述的步骤(4)中酸性氧化电位水与皮渣按质量比为10-1.5：1混合。所述dlol大孔树脂层析柱采用的酸性氧化电位水优选ph为5.5-6.5。
本发明中流出液中花青素含量的检测采用国标检测方法。野樱莓渣溶液中果胶酶的检测方法采用无水乙醇或者95%乙醇检测，具体操作是取蓝莓渣溶液2.5毫升，加入7.5毫升无水乙醇或者95%乙醇，振荡；因果胶不溶于乙醇，如有果胶则有浑浊或者沉淀。
本发明的有益技术效果体现在以下方面:
1、野樱莓榨汁后果渣的有效利用：本发明从野樱莓榨汁后的废弃物中榨渣进一步提取花青素与多酚类物质，实现规模化生产。获得的花青素可用于食品、药物及化妆品等产品中，提高野樱莓资源的附加值。并在野樱莓花青素提取上的技术突破：长期以来，花青素大量缺乏，其传统的提取方法不仅成本高、步骤繁琐而且提取率低，制约其在相关产品中广泛的应用。本发明采用酸性氧化电位水提取以及超滤去杂、纳滤浓缩、大孔树脂纯化等为核心技术，其工艺不仅简单，而且操作成本较低，适合该花青素的规模化生产；
2、采用酸性氧化电位水调节ph值，单宁酶和壳聚糖有效去除野樱莓的酸涩味，利用果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶水解，对野樱莓果渣的再次提取，极大程度地保存了野樱莓中多酚等营养物质和不老莓香气物质。采用高初温、间歇式微波灭菌方法，灭菌后采用无菌灌装、程序降温方法，较之传统灭菌方法最大程度地降低能耗与时耗，极大地降低了野樱莓中的营养和风味物质的损失。产品货架期长，色泽纯正，口感好，适合大部分人饮用，具有保健意义。
3、本发明的酸性氧化电位水提取是零污染植物提取技术，对野樱莓的提取有独特优势：高效、无污染，工艺实现过程中不引入新的杂质、不会产生新的污染源，实现对提取溶剂的循环利用，极大的降低生产能耗和资源的浪费。相对于常规的提取办法为了达到提取率高的目的，往往会加入一定量的添加剂（例如柠檬酸），不仅会造成产品中残留，提取液无法重复使用。酸性氧化电位水植物提取技术对野樱莓提取则成功克服提取过程中有害物残留、溶剂无法回收利用、提取率低等问题，为规模化、绿色、高效的生产扫除障碍。零污染酸性氧化电位水植物提取技术非常适合于野樱莓中功效成分的规模化生产，该技术的另一显著优势在于可以根据提取阶段、目的的不同对工艺参数进行选择性调整，以适应最优生产工艺的需要，为功效成分的高效率提取创造了天然优势。
4、该提取纯化方法具有良好的环境友好性：本发明采用果胶酶或其他新型果蔬加工酶，如粥化酶（含有果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶及蛋白酶等）酶解果渣中果胶，便于花青素溶解于水中；采用超滤法去除溶液中杂质；大孔树脂纯化时用酸性氧化电位水与乙醇作为洗脱剂，采用纳滤技术分离出乙醇，乙醇可循环使用。整个工艺采用物理方法，不采用任何有毒有害溶剂，而且能源较低，有效地保护环境。
5、提取及纯化过程较好地保护花青素不被破坏：我们实验证明：含弱酸性的酸性氧化电位水（ph值4.5-6.5）为洗脱剂保护花青素结构不被破坏。另外在整个过程中，采用中温(25〜55°c)酶解，超滤分离杂质，大孔树脂纯化，纳滤浓缩、冷冻干燥法干燥，最大程度地保留花青素不被破坏。
附图说明
图1为野樱莓含花青素类成分原浆紫外全波长扫描图；图2为野樱莓含花青素类成分提取物紫外全波长扫描图。
具体实施方式
实施例1：制备高质量野樱莓汁和从野樱莓渣中提取纯化花青素与多酚类物质的具体操作步骤如下:
(1)将选用果型圆润饱满、无虫害的不老莓，将挑选后的野樱莓用人造酸性氧化电位水（ph值6.0-7.0）浸泡20-30分钟，清水冲洗干净；用打浆机打浆，得野樱莓浆；
破浆后加入0.05-0.15%的果胶酶、0.05-0.15%的纤维素酶和3-7%的半纤维素酶，50℃水浴1.5h，每隔0.5h搅拌一次；至野樱莓浆溶液中没有果胶被检测出为止。野樱莓浆溶液中果胶的检测采用无水乙醇或者95%乙醇检测。具体操作是取野樱莓浆溶液2.5毫升，加入95%乙醇7.5毫升，振荡。因果胶不溶于乙醇，如有果胶则有浑浊或者沉淀；如没有果胶则停止酶解；
浆渣分离:将野樱莓浆采用滤布为60目的浆渣分离机或者滤袋为60目的离心机将果汁与野樱莓渣分离，控制转速500-3000转，时间：5-30分钟；
均质提取:在野樱莓渣中添加1或3倍体积的酸性氧化电位水，调节野樱莓渣溶液的ph至2.5，并25-55℃下使用均质机处理3-8min，提取皮渣中的花青素与多酚类物质；在野樱莓渣溶液中加入野樱莓渣质量(m/m)0.01%的果胶酶，混合均匀，酶解2小时，
分离:将酶解后的野樱莓渣溶液采用滤布为60目的渣分离机分离，得澄清溶液；
再与前制得的果汁混合，得到野樱莓原汁；
酶解、灭酶：将果汁质量0.3-0.7%的单宁酶加入果汁中，于42-48℃下酶解0.5-1.5h，后将酶解液升温至85℃，恒温10min进行灭酶处理；
调整ph:向灭酶后的黑果腺肋花秋果汁中加入酸性氧化电位水或小苏打，将ph调整至5；
向不老莓果汁中加入果汁质量0.05-0.15%的壳聚糖，搅拌均匀后静置2-4h；
粗滤:使用120目滤布进行粗滤；
超滤:将所得的不老莓浆液用管式聚砜膜进行超滤澄清，单程澄清条件，物料温度为42-48℃、操作压力为0.4-0.5mpa、主流液速度为2-3m/s；
调配:将野樱莓汁制备为：含不老莓原汁含量18-25%，黃砂糖含量为7-10%，用蒸馏水混匀；
均质、脱气：将调配好的不老莓非浓缩还原果汁在58-62℃、22-26mpa条件下均质两次；并于常温、0.07mpa-0.08mpa下进行真空脱气；
灌装和间歇式微波灭菌：将均质后的不老莓非浓缩还原果汁迅速用玻璃瓶灌装，放入微波设备内，以便维持其初温；以650-750w加热45-60s，停顿20-30s，重复2-3次；
封装：杀菌后的不老莓非浓缩还原果汁进入无菌间，用预先杀菌过的金属旋盖封罐，然后倒罐，利用微波加热后罐内余热保持其内部的高温，以延长杀菌时间，保证杀菌强度；
程序降温:将杀菌好的瓶装果汁浸入50-60℃温水中，用冷水淋洗，直至温度降至室温。
实施例2：从野樱莓汁渣中提取纯化花青素的具体操作步骤如下:
打浆:野樱莓打浆机打浆，得野樱莓汁浆；
浆渣分离:将野樱莓浆采用滤布为300目的浆渣分离机将果汁与野樱莓分离（5100r/min条件下离心分离药渣）；
酶解:在野樱莓渣中添加10-20倍体积的酸性氧化电位水，调节野樱莓渣溶液的ph至4.5，温度为550c;在野樱莓渣溶液中加入蓝莓渣质量(m/m)0.3%的果胶酶，混合均匀，酶解6小时，至野樱莓渣溶液中没有果胶被检测出为止。野樱莓渣溶液中果胶的检测采用无水乙醇或者95%乙醇检测。具体操作是取野樱莓渣溶液2.5毫升，加入95%乙醇7.5毫升，振荡。因果胶不溶于乙醇，如有果胶则有浑浊或者沉淀；如没有果胶则停止酶解；
将酶解后的野樱莓渣溶液采用滤布为300目的渣分离机分离，得澄清溶液；
超滤去杂:将澄清溶液加入截留分子量为500kda的超滤装置中，在压力为0.7mpa、温度为50℃条件下超滤，因花青素的分子量约为400da，去除大分子的多糖、蛋白质、纤维素、果胶等杂质；直至流出液中没有花青素流出为止。对流出液采用检测依据国家农业行业标准ny/t1320-2007法定性检测，如仍然有花青素流出，补加酸性氧化电位水继续超滤；
纳滤浓缩:将获得的流出液加入截留分子量为200da的纳滤装置中，在压力为0.7pa、温度为50℃条件下纳滤浓缩；一方面去除小分子的无机盐，另一方面去除水分。当浓缩液的体积减少至流出液的体积的五分之一，停止纳滤浓缩.此时获得的野樱莓花青素粉末为零污染花青素粉末，其中花青素的含量为50～80%，可直接销售。
大孔树脂纯化:将浓缩液加入dlol大孔树脂层析柱上，浓缩液的体积为树脂体积的3倍，先用弱酸性的酸性氧化电位水洗脱（ph值5.0-6.5），去除不被大孔树脂吸附的杂质；再用30-95%的乙醇加弱酸性的酸性氧化电位水洗脱，使得花青素被洗脱下来，洗脱液即为花青素乙醇溶液；
纳滤回收乙醇:将花青素乙醇溶液加入截留分子量200da纳滤装置中，在压力为0.7mpa、温度为50℃条件下分离，当花青素乙醇溶液的体积减少至原体积的五分之一，停止操作，得截留液和乙醇。因乙醇的分子量为46da，透过纳滤膜，而花青素分子量约为400da，不能透过纳滤膜，从而实现两者的分离。同时，回收乙醇；
冷冻干燥:将截留液在18℃条件下，预冷冻3小时，至流出液完全冻结；将预冷冻的截留液在真空度为0.1mpa，温度为-30℃条件下，冷冻干燥至水分含量<5%，获得紫红色的野樱莓花青素粉末。
所述的步骤中，加入果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的目的是提高出汁率和果汁中的花色苷等营养物质的含量;通过使用酶解的办法，有效提取不老莓中多酚等营养物质，并使用均质的方式对皮渣中多酚及风味物质进行二次提取，极大的提高了果汁的保健功能，减少了原料的浪费。
此外，针对野樱莓果汁酸涩的特点，通过使用单宁酶降解单宁、壳聚糖除涩、以及调节ph、糖度的方法，极大的提高了果汁的口感。
采用超滤膜技术对果汁进行澄清，不仅达到理想的澄清效果，还减少了挥发物质的损失，保持了不老莓原有的风味和芳香，缩短生产周期，提高生产效率。在均质后，物料具有较高初温的条件下，使用间歇式微波灭菌技术，极大地降低了能耗与时耗，在传统微波灭菌的基础上进一步降低了对花色苷、多酚的破坏，更大程度地保存了其风味物质，两种技术的结合使用最大限度的保持了不老莓浓郁的风味以及丰富的营养成分。