本发明属于农业-畜牧兽医领域，具体地说，涉及一种猪孤雌激活胚胎单胚胎体外培养方法。
背景技术：
近年来，体外生产胚胎被广泛的应用于生产有经济价值的动物、疾病模型及生物反应器等，同时，体外受精技术(ivf)、单精子注射技术(icsi)、胚胎移植技术、胚胎分割技术及胚胎干细胞工程等的应用极大的促进了畜牧业的发展，然而，在这些新技术的发展与应用中，体外生产胚胎较低的发育能力及早期胚胎发育阻滞极大的限制了这些新技术的发展与应用。虽然，众多研究通过在哺乳动物早期胚胎体外培养的培养液中添加或减少因子来改进胚胎的发育能力，但是，与体内发育的胚胎相比，体外生产的胚胎在质量和囊胚发育率仍然相差甚远，这就要求我们对其继续深入研究。
随着社会经济及畜牧业等领域的飞速发展，迫切需要体外制备更多更优质的动物胚胎，然而，在现实生产过程中，体外发育的胚胎阻滞在某一阶段尤为严重，浪费了大量资源。
哺乳动物早期胚胎体外发育阻滞现象是指受精卵从合子时期发育到囊胚时期这个过程中，发生的阻断使胚胎停留在某个时期不能继续发育下去的现象，早期胚胎发育阻滞的时间随物种的不同而异，但往往与发育调控过渡的时间相关联，山羊和绵羊均发生于胚胎的8-16细胞期，人的胚胎在体外发育过程中一般容易阻滞在胚胎的4-8细胞期，而猪的胚胎在体外发育过程中阻滞在4细胞阶段严重。因此，有关哺乳动物早期胚胎发育阻滞产生的分子机制是当前生殖和发育生物学研究的热点之一。
研究胚胎发育阻滞现象首先要获得研究对象，同时要保证所研究的对象是单独存在的。目前，针对单胚胎的研究主要集中在小鼠受精卵及各发育阶段胚胎，而小鼠胚胎的获得主要从体内冲取得到，因此，小鼠胚胎获得相对简单，成本低。而针对小鼠单胚胎体外的培养，主要是去透明带后选择海藻酸钙凝胶包埋培养法。由于物种的不同，胚胎大小、胚胎体外培养条件(包括培养基、培养温度等)及培养要求均有不同，所以，小鼠单胚胎体外培养方法不适合用于大的哺乳动物---猪的单胚胎体外培养。
因此，急需建立适合用于猪的单胚胎体外培养方法，以满足对猪的单个胚胎发育进程跟踪观察及进一步研究的需要。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，本发明采用饲养层细胞微滴与单个胚胎进行共培养的方法用于猪的单胚胎体外培养，获得了较好的发育结果，完全可以满足对猪单个胚胎发育进程跟踪观察及进一步研究的需要。
本发明通过以下技术方案来实现发明目的：
第一方面，本发明提供一种猪单胚胎体外培养方法，包括如下步骤：
1)猪体外成熟卵母细胞制备：
采集母猪卵巢；卵巢组织先用75％的酒精洗涤1min，然后用灭菌且预热的生理盐水清洗3次之后用装有标准20号针头的无菌注射器(内有少量平衡后的dpbs)抽取卵巢表面直径为3-8mm的卵泡，抽取液注入50ml尖底离心管中，置于39℃水浴锅中的尖底离心管中；待卵丘-卵母细胞复合体(cocs)沉淀后，用dpbs(购自gibco)洗涤2次后在体视显微镜下检卵。捡取形态正常、胞质均一且至少有3层颗粒细胞包裹的cocs，将检出的cocs用含5％胎牛血清(fbs)的dpbs洗涤3次，然后用体外成熟培养液洗涤3次，移入含有500μl体外成熟培养液并覆盖有石蜡油的五孔细胞培养板中；每滴放cocs100-150枚；液体预先在co2培养箱中平衡2h以上；体外成熟培养42-44h，培养条件39℃，5％co2，饱和湿度；
体外成熟培养液为tcm-199(gibco)+0.1％聚乙烯醇+3.05mm葡萄糖+0.91mm丙酮酸钠+0.57mml-半胱氨酸+100iu/ml青霉素+100μg/ml链霉素+10％(v/v)卵泡液+10iu/mlpmsg(宁波激素制品厂)+10iu/mlhcg(宁波激素制品厂)；
2)猪体外成熟卵母细胞孤雌激活：
将体外成熟培养42-44h的cocs移入含0.1％透明质酸酶的dpbs中消化并用移液枪反复轻微吹打以除去卵丘细胞，用提前预热的激活液洗涤3次，置入带有激活液的融合槽中，用btx-2001融合仪进行电激活，激活参数：30μs，1.1kv/cm，1次直流电脉冲；激活后的卵母细胞用提前预热的胚胎培养液ncsu-23洗涤三次后备用；
激活液配方：0.25mol/l甘露醇+0.5mol/l氯化钙+0.5mol/l硫酸镁+0.5mol/lhepes+0.01％pva；
3)共培养饲养层细胞微滴制备：
(1)输卵管上皮细胞饲养层微滴制备
a、输卵管上皮细胞的分离与原代培养：屠宰场获得母猪输卵管后放入添加双抗的30-37℃灭菌生理盐水中于2h内带回实验室，用灭菌剪刀剪去多余的输卵管系膜，并将输卵管剪成长度2cm的小段，用35℃添加双抗的无菌生理盐水洗涤3次，置于直径35mm的一次性塑料小皿中，在体视显微镜下一边观察一边冲取上皮细胞，操作时左手拿钟表镊子夹住输卵管一侧断口处，右手用1毫升的一次性注射器吸取工作浓度0.25％胰酶直接从镊子夹住的输卵管断口处缓慢注入，以冲取输卵管上皮细胞，重复2-3次后收集小皿中含有输卵管上皮细胞的胰酶液体，迅速加入等体积的含有10％fbs的dmem以终止消化，避免消化过度，细胞死亡，胰酶在输卵管中的时间控制在5min以内，以保证输卵管上皮细胞的纯度。将收集的液体3000r/min离心5min，丢弃上清，加入含有10％fbs的dmem重复离心2次弃上清，得到的沉淀置入含有2毫升添加10％fbsdmem的6孔板中进行培养；培养3天后更换新鲜培养基，待细胞长满6孔板板底时可以消化备用；
b、饲养层共培养细胞微滴制备：于共培养前48h用0.25％胰酶消化已经长满6孔板的输卵管上皮细胞，时间2min，加入含有10％fbs的dmem终止消化，用量程为1毫升移液器轻轻吹打成单细胞悬液，细胞密度调整为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴即用量程为10μl的移液器吸取10μl细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴；每个微滴大小10μl覆盖石蜡油，置于39℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养；
或者，
(2)卵丘颗粒细胞饲养层微滴制备：
将培养成熟的卵母细胞置于成熟液中，用移液枪反复吹打除去卵母细胞外的卵丘细胞，吹打干净并捡出卵母细胞，余下的卵丘颗粒细胞即留在液体中，调整细胞密度为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴即用量程为10μl的移液器吸取10μl细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴；每个微滴大小10μl覆盖石蜡油，置于39℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养；
或者，
(3)猪胎儿成纤维细胞饲养层微滴制备
a、猪胎儿成纤维细胞制备：具体操作方法参照zl201310381274.5《湖北白猪成纤维细胞系》中所公开的方法制备；
b、饲养层共培养细胞微滴制备：于共培养前48h用0.25％胰酶消化已经长满6孔板的猪胎儿成纤维细胞，时间2min，加入含有10％fbs的dmem终止消化，用量程为1毫升移液器轻轻吹打成单细胞悬液，细胞密度调整为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴即用量程为10μl的移液器吸取10μl细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴；每个微滴大小10μl覆盖石蜡油，置于39℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养；
4)单胚胎与饲养层细胞共培养：
(1)带透明带附着的卵母细胞与饲养层细胞共培养
于卵母细胞置入微滴前2h将微滴中的细胞培养基dmem换成新鲜的胚胎培养基ncsu-23置培养箱中备用；
选取步骤2)获得的带有第一极体、胞质均匀的体外成熟卵母细胞于提前平衡2h的胚胎培养基ncsu-23中，洗涤3遍后置入步骤3)制备的共培养饲养层单细胞微滴中进行共培养，每个微滴置1枚卵母细胞；48h进行半量换液；
或者，
(2)去透明带的卵母细胞与饲养层细胞共培养
于卵母细胞置入微滴前2h将微滴中的细胞培养基dmem换成新鲜的胚胎培养基ncsu-23置培养箱中备用；
体外成熟卵母细胞孤雌激活后，选取带有第一极体、胞质均匀、胞膜完整的体外成熟卵母细胞用工作浓度0.25％的链霉蛋白酶消化去除透明带，将无透明带卵母细胞于提前平衡2h的胚胎培养基ncsu-23中洗涤3遍后置入步骤3)制备的共培养饲养层单胚胎培养微滴中进行共培养，每个微滴置1枚卵母细胞，48h进行半量换液；
5)7天获得猪孤雌发育囊胚：于36h统计胚胎卵裂率，共培养7d后，在显微镜下观察胚胎发育情况，并统计囊胚发育率。
优选地，上述方法中步骤4)共培养的单胚胎为体外受精胚胎、单精子注射胚胎、体细胞核移植胚胎中的任一种。
本发明具有以下优点：
本发明首次采用饲养层细胞微滴与单个胚胎进行共培养的方法用于猪的单胚胎体外培养。获得了较好的发育结果，单胚胎培养与传统所用的多胚胎培养发育进程是一致的，而且，带透明带附着或去透明带的单胚胎7天均可获得猪孤雌发育囊胚。本发明中提供的饲养层细胞微滴制备简单，按照本发明中提供的方法能够为研究单个胚胎的发育提供可靠的原始材料，完全可以满足对猪单个胚胎发育进程跟踪观察及进一步研究的需要。本发明中提供的单胚胎培养方法可广泛应用于多种物种的单胚胎培养中。
附图说明
图1是本发明中猪输卵管上皮细胞示意图；
图2是本发明中猪卵丘颗粒细胞示意图；
图3是本发明中猪胎儿成纤维细胞示意图；
图4是本发明中饲养层细胞共培养单胚胎发育囊胚示意图；
a.带透明带附着的卵母细胞发育至囊胚；b.去透明带的卵母细胞发育至囊胚；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】猪体外成熟卵母细胞制备
于武汉市中粮肉食品加工厂采集母猪卵巢后，立即放入添加双抗的35℃灭菌生理盐水中2-4h内送回实验室。卵巢组织先用75％的酒精洗涤1min，然后用灭菌且预热的生理盐水清洗3次之后用装有标准20号针头的无菌注射器(内有少量平衡后的dpbs)抽取卵巢表面直径为3-8mm的卵泡，抽取液注入50ml尖底离心管中，置于39℃水浴锅中的尖底离心管中。待卵丘-卵母细胞复合体(cocs)沉淀后，用dpbs(gibco)洗涤2次，后在立体显微镜下检卵。捡取形态正常、胞质均一且至少有3层颗粒细胞包裹的cocs，将检出的cocs用含5％胎牛血清(fbs)的dpbs洗涤3次，然后用成熟培养液洗涤3次，移入含有500μl成熟培养液并覆盖有石蜡油的五孔细胞培养板中。每滴放cocs100-150枚。液体预先在co2培养箱中平衡2h以上。体外成熟培养42-44h，培养条件39℃，5％co2，饱和湿度。
体外成熟培养液为tcm-199(gibco)+0.1％聚乙烯醇+3.05mm葡萄糖+0.91mm丙酮酸钠+0.57mml-半胱氨酸+100iu/ml青霉素+100μg/ml链霉素+10％(v/v)卵泡液+10iu/mlpmsg(宁波激素制品厂)+10iu/mlhcg(宁波激素制品厂)。
【实施例2】猪体外成熟卵母细胞孤雌激活
将体外成熟培养42-44h的cocs移入含0.1％透明质酸酶的dpbs中消化并用移液枪反复轻微吹打以除去卵丘细胞，用提前预热的激活液洗涤3次，置入带有激活液的融合槽中，用btx-2001融合仪进行电激活，激活参数：30μs，1.1kv/cm，1次直流电脉冲。激活后的卵母细胞用提前预热的胚胎培养液ncsu-23洗涤三次后备用。
激活液配方：0.25mol/l甘露醇+0.5mol/l氯化钙+0.5mol/l硫酸镁+0.5mol/lhepes+0.01％pva。
【实施例3】共培养饲养层细胞微滴制备
(1)输卵管上皮细胞饲养层微滴制备
a、输卵管上皮细胞的分离与原代培养：屠宰场获得母猪输卵管后放入添加双抗的30-37℃灭菌生理盐水中于2h内带回实验室，用灭菌剪刀剪去多余的输卵管系膜，并将输卵管剪成长度2cm的小段，用35℃添加双抗的无菌生理盐水洗涤3次，置于直径35mm的一次性塑料小皿中，在体式显微镜下一边观察一边冲取上皮细胞，操作时左手拿钟表镊子夹住输卵管一侧断口处，右手用1毫升的一次性注射器吸取工作浓度0.25％胰酶直接从镊子夹住的输卵管断口处缓慢注入，以冲取输卵管上皮细胞，重复2-3次后收集小皿中含有输卵管上皮细胞的胰酶液体，迅速加入等体积的含有10％fbs的dmem以终止消化，避免消化过度，细胞死亡，胰酶在输卵管中的时间控制在5min以内，以保证输卵管上皮细胞的纯度。将收集的液体3000r/min离心5min，丢弃上清，加入含有10％fbs的dmem重复离心2次弃上清，得到的沉淀置入含有2毫升添加10％fbsdmem的6孔板中进行培养。培养3天后更换新鲜培养基，待细胞长满6孔板板底时可以消化备用。
b、饲养层共培养细胞微滴制备：于共培养前48h用0.25％胰酶消化已经长满6孔板的输卵管上皮细胞，时间2min，加入含有10％fbs的dmem终止消化，用量程为1毫升移液器轻轻吹打成单细胞悬液，细胞密度调整为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴，即用量程为10μl的移液器吸取10μl细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴，每个微滴大小10μl，覆盖石蜡油，置于39℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养。
(2)卵丘颗粒细胞饲养层微滴制备：将培养成熟的卵母细胞置于成熟液中，用移液枪反复吹打除去卵母细胞外的卵丘细胞，吹打干净并捡出卵母细胞，余下的卵丘颗粒细胞即留在液体中，调整细胞密度为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴即用量程为10μl的移液器吸取10μl细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴，每个微滴大小10μl，覆盖石蜡油，置于39℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养。
(3)猪胎儿成纤维细胞饲养层微滴制备
a、猪胎儿成纤维细胞制备：具体操作方法参照中国专利《湖北白猪成纤维细胞系》中所公开的方法制备。
b、饲养层共培养细胞微滴制备：于共培养前48h用0.25％胰酶消化已经长满6孔板的猪胎儿成纤维细胞，时间2min，加入含有10％fbs的dmem终止消化，用量程为1毫升移液器轻轻吹打成单细胞悬液，细胞密度调整为104个/ml并保证细胞悬液中细胞是均匀存在的，利用此细胞悬液制备共培养饲养层单胚胎培养微滴，即用量程为10μl的移液器吸取10μl细胞悬液，在35mm的一次性小皿上做细胞微滴。每个微滴大小10μl覆盖石蜡油，置于39℃，5％co2，饱和湿度的培养箱中培养，48h后用于细胞共培养。
【实施例4】细胞共培养
(1)带透明带附着的卵母细胞与饲养层细胞共培养
于卵母细胞置入微滴前2h将微滴中的细胞培养基dmem换成新鲜的胚胎培养基ncsu-23置培养箱中备用。
体外成熟卵母细胞孤雌激活后，选取带有第一极体、胞质均匀、胞膜完整的体外成熟卵母细胞于提前平衡2h的胚胎培养基ncsu-23中洗涤3遍后置入实施例3制备的共培养饲养层单胚胎培养微滴中进行共培养，每个微滴置1枚卵母细胞。48h进行半量换液。于36h统计胚胎卵裂率，7d统计囊胚发育率。
(2)去透明带的卵母细胞与饲养层细胞共培养。
于卵母细胞置入微滴前2h将微滴中的细胞培养基dmem换成新鲜的胚胎培养基ncsu-23置培养箱中备用。
体外成熟卵母细胞孤雌激活后，选取带有第一极体、胞质均匀、胞膜完整的体外成熟卵母细胞用工作浓度0.25％的链霉蛋白酶消化去除透明带，将无透明带卵母细胞于提前平衡2h的胚胎培养基ncsu-23中洗涤3遍后置入实施例3制备的共培养饲养层单胚胎培养微滴中进行共培养，每个微滴置1枚卵母细胞。48h进行半量换液。于36h统计胚胎卵裂率，7d统计囊胚发育率。
【实施例5】采用传统的微滴培养法进行单胚胎体外培养实验
本实验在35mm一次性小皿上制备微滴进行单胚胎体外培养，主要进行了一下对照实验：a：微滴大小分成三组：5μl/滴，10μl/滴，50μl/滴，100μl/滴；b：在微滴大小分组的基础上采用不同的培养基进行单胚胎体外培养：①采用新鲜的猪胚胎培养基ncsu-23进行单胚胎体外培养；②取五孔板中已经培养出囊胚的ncsu-23直接进行单胚胎体外培养；③取五孔板中25％已经培养出囊胚的ncsu-23加75％的新鲜ncsu-23直接进行单胚胎体外培养；④取五孔板中50％已经培养出囊胚的ncsu-23加50％的新鲜ncsu-23直接进行单胚胎体外培养；⑤取五孔板中75％已经培养出囊胚的ncsu-23加25％的新鲜ncsu-23直接进行单胚胎体外培养；⑥新鲜的胚胎培养基ncsu-23添加10％fbs；⑦新鲜的ncsu-23添加1％必须氨基酸和0.5％非必须氨基酸；⑧新鲜的tcm199添加10％fbs；⑨新鲜的tcm199添加1％必须氨基酸和0.5％非必须氨基酸。
每组实验至少重复三次以上，每组实验单个对照组不少于100枚胚胎。
结果：微滴大小为10μl/滴，采用tcm199添加10％fbs培养效果较好，胚胎卵裂率60％，发育至16细胞10％，无桑椹胚及囊胚，胚胎主要阻滞在4细胞阶段。采用ncsu-23进行培养时，细胞发育至8细胞死亡，卵裂率50％。
【实施例6】采用传统微滴法加饲养层细胞进行单胚胎体外培养实验
本实验在35mm一次性小皿上制备饲养层微滴进行单胚胎体外培养，微滴大小10μl/滴。主要进行了一下对照实验：每种饲养层细胞均按b中的培养基进行更换。a：饲养层细胞包括卵丘颗粒细胞、猪胎儿成纤维细胞和输卵管上皮细胞；b：培养基包括如下几种：①采用新鲜的猪胚胎培养基ncsu-23进行单胚胎体外培养；②取五孔板中已经培养出囊胚的ncsu-23直接进行单胚胎体外培养；③取五孔板中25％已经培养出囊胚的ncsu-23加75％的新鲜ncsu-23直接进行单胚胎体外培养；④取五孔板中50％已经培养出囊胚的ncsu-23加50％的新鲜ncsu-23直接进行单胚胎体外培养；⑤取五孔板中75％已经培养出囊胚的ncsu-23加25％的新鲜ncsu-23直接进行单胚胎体外培养；⑥新鲜的胚胎培养基ncsu-23添加10％fbs；⑦新鲜的ncsu-23添加1％必须氨基酸和0.5％非必须氨基酸；⑧新鲜的tcm199添加10％fbs；⑨新鲜的tcm199添加1％必须氨基酸和0.5％非必须氨基酸。
每组实验至少重复三次以上，每组实验单个对照组不少于100枚胚胎。
结果：添加饲养层细胞后，单胚胎体外培养效果较之不加饲养层细胞要好。采用新鲜的猪胚胎培养基ncsu-23加饲养层细胞较tcm-199添加10％fbs效果要好，且输卵管上皮细胞做单层单胚胎体外培养囊胚率比较高，达8.3％。猪胎儿成纤维细胞和卵丘细胞做饲养层均出现囊胚，但较输卵管上皮细胞偏低。
【实施例7】单胚胎饲养层微滴共培养与传统多胚胎共培养发育进程对照试验
体外成熟激活后的卵母细胞进行分组培养：a、在饲养层细胞微滴中共培养，每个微滴置一枚卵母细胞；b、按传统方法置入五孔板中覆盖石蜡油培养，100-150枚/500μl培养基；c、按传统微法培养，10-15枚/μl培养基。
表1单胚胎饲养层微滴共培养与传统多胚胎共培养发育进程对照试验
根据表1所示，单胚胎培养与传统所用的多胚胎培养发育进程是一致的。
【实施例8】囊胚发育率统计
7天获得猪孤雌发育囊胚。共培养7d后，在400x的显微镜下观察胚胎发育情况，并统计囊胚发育率。见图4。
经测定及对照试验，以上实施例中的猪孤雌激活胚胎单胚胎体外培养方法，均可以得到正常发育至囊胚的胚胎。
综上所述，本发明通过使用饲养层细胞微滴与目的胚胎共培养，可以得到正常发育单胚胎，且本发明中提供的饲养层细胞微滴制备简单，按照本发明中提供的方法能够为研究单个胚胎的发育提供可靠的原始材料，本发明中提供的单胚胎培养方法可广泛应用于多种物种的单胚胎培养中。
本发明尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。