本发明涉及微生物分离培养
技术领域：
，特别是涉及一种从石油污染土壤富集分离优势固氮菌的方法。
背景技术：
：生物固氮是指固氮微生物将大气中的氮气转化为可被生物体利用的氮源过程，可分为共生固氮、联合固氮和自生固氮。自生固氮菌通常在自然环境或培养基中独立生活就能够固定分子态氮，并将其还原为氨。固氮菌广泛的分布在自然界中，而针对油污土壤微生物的分析表明，固氮菌的数量与土壤一定浓度石油污染存在正相关。随着土壤石油污染浓度的升高，存在固氮酶活性的高表达和固氮菌的富集，推测原因是由于石油在微生物降解过程中，会产生大量可利用的碳源，氮源的缺乏促进固氮菌的富集，而优势固氮菌的存在对提高石油降解效率具有重要作用，一些菌株即便是浓度较低也可以增加石油降解能力。ikechukwu等人将固氮菌(azotobactervinelandii)和降解石油的假单胞菌(pseudomonassp)混合接种于污染土壤中，石油烃降解率从23.2–44.45％提高到66.83-69.6％。从石油污染土壤中分离固氮菌，尤其是优势固氮菌，将为石油污染土壤的生物治理提供重要的菌株资源。然而石油中各成分的存在影响并抑制了包括固氮菌在内的大多数微生物的生长，导致微生物的多样性降低，同时，固氮过程的高耗能以及对氧需求的多样性，限制了从石油污染土壤中分离获得优势的固氮菌。传统方法中，主要是对原位固氮菌进行分离，常见的固氮菌分离方法主要使用ashby无氮培养基，通过将待分离样品梯度稀释后，表面涂布于无氮培养基中，在30℃培养3-5天后，观察并筛选纯化菌株。后续通过固氮酶结构基因nifh的扩增和序列分析，结合固氮酶活性分析对其是否是固氮菌进行确定。通过人工添加速效碳源的方法，为固氮菌合成固氮酶提供能量，同时模拟石油降解后期碳氮比失衡，将促进优势固氮菌的富集，同时利用0-2％微好氧培养，可以有效提高优势固氮菌的分离效率。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种从石油污染土壤中富集分离优势固氮菌的方法以克服现有技术的不足。本发明首先提供一种改进了的无氮固体培养基，其1l的配方为：葡萄糖20-50g；k2hpo40.5-1.0g；mgso4·7h2o0.1-0.2g；三价铁柠檬酸盐【fe(ⅲ)-citrate】0.02-0.05g；namoo4·2h2o0.001-0.76g；琼脂粉8-15g；加水至1l；ph7.0。优选地，本发明的提供的无氮固体培养基，其1l的配方为：葡萄糖25-40g；k2hpo40.8-1.0g；mgso4·7h2o0.15-0.2g；三价铁柠檬酸盐0.03-0.05g；namoo4·2h2o0.001-0.05g；琼脂粉8-12g；加水至1l；ph7.0。更优选地，本发明的提供的无氮固体培养基，其1l的配方为：葡萄糖30g；k2hpo41.0g；mgso4·7h2o0.2g；三价铁柠檬酸盐0.05g；namoo4·2h2o0.001g；琼脂粉10g；加水至1l；ph7.0。上述无氮固体培养基中，由于增加了碳源，为固氮菌的生长提供了能量，便于更好地培养并分离固氮菌。现有技术中无氮固体培养基中碳源较少，通常添加葡萄糖为10g左右，申请人在固氮酶活性测定过程中发现每升培养基中，葡萄糖达到30-50g时，固氮菌的以氮气为唯一氮源的生长能力最高，超过80g时，则对固氮菌的生长有抑制作用，因此利用此碳源浓度分离固氮菌，将更有利于菌株在无氮培养基中生长的能力，从而提高检出率。本发明对固氮酶分析中发现，大多数固氮菌可以在0-2％氧浓度条件下保持固氮酶活性，即便是具有防氧保护机制的好氧固氮菌，其固氮酶也是对氧敏感，只是存在高呼吸或保护蛋白，创造无氧微环境，从而保证其能够在高氧浓度下具有固氮酶活，同时，在石油污染物降解过程中，由于好氧降解往往会形成缺氧的微环境，因而0-2％氧浓度条件更接近石油污染土壤的微环境，从而有利于优势固氮菌的分离。本发明提供了一种从石油污染土壤分离固氮菌的方法，包括以下步骤：(1)采集石油污染土壤置于厌氧管中，加葡萄糖诱导，选择固氮活性高的土壤样品，制备悬浮液进行梯度稀释；(2)取上述的无氮固体培养基，并在无氮固体培养基的融化状态分别加入固氮酶活性高的土壤样品的不同稀释度的悬浮液，同一个固体培养基仅加入一种稀释度的悬浮液；混匀后转移至厌氧管中，制备薄层培养基，静置培养，若培养基表面或内部有菌落生长，则分离得到了石油污染土壤中富集的优势固氮菌。本发明的从石油污染土壤分离固氮菌的方法中，步骤(1)中葡萄糖富集作用，添加的葡萄糖浓度为0.01-0.05g/土样g。步骤(1)中诱导时间为25-35℃培养2-7天。优选地，步骤(1)中静置培养的条件为30℃培养2-4天。本发明方法的步骤(1)中，葡萄糖的加入可以诱导固氮菌的富集，诱导后土壤固氮酶活性高于起始土壤固氮酶活性一倍以上即可认为是固氮酶活性高的土壤样品。本申请实施例是通过充入占厌氧管10％体积比的乙炔气体20小时候，测量乙烯含量，选择固氮活性高的样品。步骤(2)中培养基融化状态是指50-55℃下培养基的融合状态。步骤(2)中采用亨盖特滚管法分离菌株使用0和2％氧浓度进行培养。若氧浓度太高，菌株由于无法消耗过量氧气，而不能为固氮酶合成和行使功能提供必要的厌氧环境。步骤(2)中静置培养的条件为25-35℃培养2-4天。优选地，步骤(2)中静置培养的条件为30℃培养2-4天。本发明实施例提供了一种从石油污染土壤富集分离优势固氮菌的方法，包括以下步骤：(1)采集石油污染土壤5g，加入过滤除菌的葡萄糖浓缩液，使其终浓度为0.01-0.05g/土样g，亨盖特厌氧管中密闭培养，30℃诱导2-7天后，充入乙炔后根据乙烯测得量，选择固氮活性高或固氮菌数量多的样品，加水制备悬浮液进行梯度稀释；(2)制备本发明所述的无氮固体培养基，在培养基融化状态分别加入不同稀释度的悬浮液100μl，混匀后转移至亨盖特厌氧管中，冰水混合物中滚管制备薄层培养基，封闭亨盖特厌氧管后，抽真空后充入高纯氮气，反复抽充6次后，保证厌氧管中为高纯氮气，而后调整氧浓度为0和2％，30℃静置培养2-4天，若培养基表面或内部有菌落生长，则分离得到了石油污染土壤中的优势固氮菌，本申请中所述优势固氮菌是数量占大多数且固氮酶活性高的固氮菌。本发明还提供了利用上述方法分离得到的固氮菌的纯化方法，挑取无氮固体培养基中生长的菌落，采用gcmy培养基纯化，所述gcmy培养基的1l的配方为：葡萄糖10-30g；k2hpo40.5-1.0g；mgso4·7h2o0.1-0.2g；feso4·7h2o0.02-0.05g；cacl2·2h2o0.05-0.1g，namoo4·2h2o0.001-0.76g；酵母粉0.5-1g；水解酪蛋白0.5-1g；麦芽汁0.5-1g；琼脂粉15g；加水至1l；ph7.0。优选地，所述gcmy培养基的1l的配方为：葡萄糖10g；k2hpo41.0g；mgso4·7h2o0.2g；feso4·7h2o0.05g；cacl2·2h2o0.1g；namoo4·2h2o0.001g；酵母粉0.5g；水解酪蛋白0.5g；麦芽汁0.5g；琼脂粉15g；加水至1l；ph7.0。本发明还提供了一种分离厌氧固氮菌的方法，采用上述方法分离得到固氮菌，挑取无氮固体培养基内生长的菌落，采用厌氧管滚管法进行纯化，得到厌氧固氮菌。本发明提供了上述方法在提高石油污染土壤中优势固氮菌分离效率的应用。本发明的有益效果在于：本发明关注碳氮失衡状态下优势固氮菌的分离，同时发现多数固氮菌在0-2％氧浓度条件下具有固氮酶活性特征，采用0-2％氧浓度培养，促进固氮酶活性，从而获得石油污染土壤中发挥固氮作用机制的优势菌株，具有良好的应用前景。附图说明图1为兼性厌氧固氮菌klebsiellasp.pj3-5不同氧气浓度下固氮酶活性。图2为好氧固氮菌azotobactersp.pj-12不同氧气浓度下固氮酶活性。图3为兼性厌氧pseudoxanthomonassp.fw8不同氧气浓度下固氮酶活性。图4为微好氧固氮菌azospirillumsp.fw2不同氧气浓度下固氮酶活性。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本申请中涉及的菌株azotobactersp.pj12和klebsiellasp.pj3-5，其保藏号分别为cgmccno.14659和14658，该两种菌均于2017年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。azospirillumsp.fw2和兼性厌氧pseudoxanthomonassp.fw8公开于参考文献为：azospirillumformosensesp.nov.,adiazotrophfromagriculturalsoilinternationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,2012,62(5):1185-1190。和pseudoxanthomonasmexicanasp.nov.andpseudoxanthomonasjaponensissp.nov.,isolatedfromdiverseenvironments,andemendeddescriptionsofthegenuspseudoxanthomonasfinkmannetal.2000andofitstypespecies，internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology(2004),54,2245–2255本发明所使用的培养基为：(1)无氮固体培养基(无氮土壤改良)：葡萄糖30g；k2hpo41.0g；mgso4·7h2o0.2g；fe(ⅲ)-citrate0.05g；namoo4·2h2o0.001g；琼脂粉10g；加水至1l；ph7.0(2)gmcy培养基：葡萄糖10g；k2hpo41.0g；mgso4·7h2o0.2g；feso4·7h2o0.05g；cacl2·2h2o0.1g；namoo4·2h2o0.001g；酵母粉0.5g；水解酪蛋白0.5g；麦芽汁0.5g；琼脂粉15g。实施例中sq-204型气相色谱测定条件：载体：n2，放大器量程：10-11a/mv，柱温：70℃，检测器温度：150℃。实施例1不同氧浓度条件下固氮菌的固氮酶活性分析(1)菌株的活化：好氧固氮菌azotobactersp.pj12使用gmcy培养基，兼性厌氧固氮菌klebsiellasp.pj3-5、微好氧azospirillumsp.fw2和兼性厌氧pseudoxanthomonassp.fw8使用lb培养基30℃活化培养；(2)将活化好的菌株挑取单菌落接种到5ml的液体培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养(fw12培养2天，h5、fw2和fw8培养12h)；(3)将培养好的菌液按相应的量接入100ml的新鲜培养基中(h5、fw2和fw8按1％量接入，fw12按4％接种量)，培养时间如上；(4)收集新鲜的菌液，用无菌的去离子水洗涤1次；(5)无氮培养基悬浮菌体，并将od600值调至约0.2；(6)取上述菌液5ml加入至25ml的厌氧管中，抽气设备置换空气为氮气，加入10％体积的乙炔气体，调整氧气浓度分别为0％、1％、2％、3％、5％、10％、15％、21％，30℃，200rpm震荡培养，2hr取样测定；(7)取100μl的气体注入气相色谱仪，记录乙烯的含量，并计算结果。结果表明，无论是好氧还是兼性厌氧固氮菌在0-5％氧浓度条件下均具有较高的固氮酶活性，而菌株最高固氮酶活性则有所区别，有的在无氧条件下固氮酶活性最高，有的则在氧浓度为2％或3％时固氮酶活性最高，结果见图1-4，鉴于此，后续对优势固氮菌的分离分别选择了0和2％氧浓度进行筛选。实施例2新民高凝油污染土壤优势固氮菌的分离(1)样品采集：从油田采集石油污染土壤。(2)优势固氮菌的富集：称取石油污染土壤5g，转移至亨盖特厌氧管中，而后加入过滤除菌的葡萄糖浓缩液，使其终浓度为0.01g/土样g，30℃诱导2-4天。(3)充入10％体积乙炔气体(即1.4ml)，24hr取100μl气体于气谱(sq-204型气相色谱，fid检测器，2米填充柱，内装gdx502)测定气体中乙烯含量。该步骤的目的是筛选碳氮失衡条件下，土壤固氮酶活性高也就意味着有固氮菌的富集，这个高活性可以是固氮酶活性高的菌株富集或者是固氮菌数量的增多。(4)固氮菌的分离：将土壤固氮酶活性较高的样品，加入15ml无菌水制成土壤悬浮液，漩涡振荡器震荡10min，促进分散，静止2-5分钟，吸取悬浮液，进行梯度稀释(100～10-5)，使用无氮固体培养基，分别采用亨盖特滚管法、平面涂布和混菌法进行培养。滚管法具体操作为：在5ml融化状态培养基中分别加入不同稀释度的悬浮液100μl，混匀后转移至亨盖特厌氧管中，封闭管口后，水平放置厌氧管，在冰水混合物中滚管制备薄层培养基，抽真空后充入高纯氮气，反复抽充6次后，保证厌氧管中为高纯氮气，而后调整氧浓度为0和2％。混菌法具体操作为将无氮固体培养基融化，保持在50-55℃，加入1ml不同稀释度的悬浮液，充分混匀后，静止培养；表面涂布的方法为将无氮固体培养基融化后，倒入无菌平板中，待凝固后，加入不同稀释度的悬浮液0.1ml，涂布均匀后，静止培养。每个稀释度3个重复。30℃培养2-4天后，会在培养基表面或内部有菌落生长，即分离获得了石油污染土壤中的固氮菌，挑取单菌落至gmcy培养基纯化后，-80℃保存。(5)固氮菌系统发育地位分析：将纯化后的菌株，挑取菌落，悬浮于100μl无菌水中，煮沸10min，冰浴5min后离心，取上清做为pcr模板。pcr扩增的反应体系(50μl)：pcr反应条件：预变性94℃4min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃90s，共30个循环；72℃延伸10min。将pcr扩增产物凝胶电泳检测，在1.5kb有特异性条带，回收后，送华大基因测序，ezcloud序列同源性比对。(6)固氮酶活性测定：具体过程参见实施例1，选择0,1％,2％,3％氧浓度，对分离菌株的固氮酶活性进行测定。新民石油污染土壤的富集培养3天后，本底固氮酶活性可以达到7844nmol/g土壤干重，而经过葡萄糖诱导后，固氮酶活性可达到15036nmol/g，说明新民石油污染土壤中存在土著的固氮菌，经过葡萄糖诱导后，进一步提高其固氮酶活性，表明存在优势固氮菌的富集。在此基础上，对优势固氮菌进行分离。结果发现，平板涂布法(与滚管法相同的培养基，平板涂布法就是常规的方法，吸取100ul稀释液，涂布在无氮固体培养基表面，培养条件是正常的空气条件下)中，30℃培养3天后，只获得了一个单菌落，经16srdna序列分析表明，与根瘤菌属rhizobiumnaphthalenivorans同源性达到100.00％；亨盖特滚管法分别采用0、2％两个氧浓度分离土壤10-2、10-3稀释液中的固氮菌，结果发现，2％氧气浓度下过夜培养，即可在管内壁的培养基上，长出数量极多、形态单一的细小菌落(菌落数>300)。0％氧气浓度下与2％氧浓度下生长的菌株相比，菌落形态一致，但菌落出现的时间较晚；说明该优势固氮菌固氮需要微好氧的环境；混菌培养法(培养基与滚管法的相同，加入1ml稀释液后，混入25ml融化好的无氮固体培养基，混匀后静止培养)，同样在30℃过夜培养下出现旺盛生长的菌落。亨盖特滚管法和混菌法中获得的菌落形态分为两种。一种为绒状，围绕菌落核心，周围呈絮状散发；另一种为菌落紧实。分别挑取6株两种形态的菌落纯化后，经16srrna基因序列扩增、测定表明，所有菌株均与bacilluscereus同源性最高，为99.58％，命名为bacillussp.xm1。此结果表明，观察到的两种形态可能只是由于氧环境的不同，而表现出菌落形态的不同，说明在新民石油污染土壤中(含油量20.44％-33.26％)，优势固氮菌数量可达到105/g土样(之前原位分离方法中，固氮菌的数量为103/g土样)，数量级有增加，但类型比较单一，有可能是在此碳氮失衡条件下行使固氮能力的主要菌株。优势固氮菌固氮酶活性分析表明，菌株xm1在0,1,2,3％氧浓度条件下均具有固氮酶活性，结果见表1。表1菌株bacillussp.xm1固氮酶活测定结果-乙炔还原法氧浓度生成乙烯峰面积(20hr后测定)0％1898.950551.372642.71％4623.1811881.50711189.52％7815.5851232.9912011.2453％852.09400实施例3盘锦油田石油污染土壤优势固氮菌的分离(1)样品采集：从油田采集石油污染土壤。(2)优势固氮菌的富集：称取石油污染土壤5g，转移至亨盖特厌氧管中，而后加入过滤除菌的葡萄糖浓缩液，使其终浓度为0.01g/土样g，30℃诱导2-4天。(3)充入10％体积乙炔气体(即1.4ml)，24hr取100μl气体于气谱(sq-204型气相色谱，fid检测器，2米填充柱，内装gdx502)测定气体中乙烯含量。(4)固氮菌的分离：将土壤固氮酶活性较高的样品，加入15ml无菌水制成土壤浸出液，漩涡振荡器震荡10min，促进分散，静止2-5分钟，吸取悬浮液，进行梯度稀释(100～10-5)，使用无氮土壤培养基(固体)，分别采用亨盖特滚管法(参见实施例2的方法)进行培养。每个稀释度3个重复。亨盖特滚管法需要将管内气体置换为氮气，调整氧气浓度为0和2％，30℃培养2-4天后，会在培养基表面或内部有菌落生长，即分离获得了石油污染土壤中的固氮菌，挑取单菌落至gmcy培养基纯化后，-80℃保存。(5)固氮菌系统发育地位分析：将纯化后的菌株，挑取菌落，悬浮于100μl无菌水中，煮沸10min，冰浴5min后离心，取上清做为pcr模板，pcr扩增的反应体系(50μl)：pcr反应条件：预变性94℃4min；变性94℃30s，退火57℃30s，延伸72℃90s，共30个循环；72℃延伸10min。将pcr扩增产物凝胶电泳检测，在1.5kb有特异性条带，回收后，送华大基因测序，ezcloud序列同源性比对。盘锦石油污染土壤的本底固氮酶活性较低，只有14nmol/g土壤干重，而经过葡萄糖诱导3天后，固氮酶活性可达到136nmol/g，说明盘锦石油污染土壤中土著固氮菌数量较少或固氮酶活性较低，经过葡萄糖诱导后，可提高其固氮酶活，表明存在优势固氮菌的富集。在此基础上，对优势固氮菌进行分离，亨盖特滚管法分别采用0、2％两个氧浓度分离土壤10-2、10-3稀释液中的固氮菌，挑取不同形态的菌落6个，结果发现，16srrna基因序列扩增、测定表明，所分离获得菌株全部为一个种属的菌株rhizobiumpusense，同源性为98.35％，说明在盘锦石油污染土壤中(含油量6.78％)，优势固氮菌数量可达到104/g土样(之前原位分离方法中，固氮菌的数量为103/g土样)，数量级有增加，但类型比较单一，有可能是在此碳氮失衡条件下行使固氮能力的主要菌株。本发明中由于后续纯化是在好氧条件下利用丰富培养基进行纯化，因此，没有分离获得完全厌氧的固氮菌，若步骤(2)采用厌氧管滚管法进行纯化，则可分离到厌氧的优势固氮菌。由此可见，本发明对于最大限度的获得石油污染环境中的优势固氮菌具有简便易行的特点，同时本发明中平板涂布在所有稀释度中只获得一个单菌落，数量较少，不具有代表性。而滚管法和混菌法获得了大量的菌落(稀释度10-3菌落数>300)，经测序鉴定表明，样品中的优势固氮菌种类少，且生长速度很快，2％氧浓度条件下，过夜培养即可以在无氮培养基中出现单菌落，两种分离方法获得的菌株数量相当，多样性一致，但滚管法由于菌落生长在薄层培养基上，更利于单菌落的挑取和纯化，而混菌法需要从培养基不同层面上挑取菌落，增加了单菌落挑取的难度。虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12