一种无酶法全核酸提取试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及细菌核酸提取纯化方面。

背景技术：

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称rna）和脱氧核糖核酸（简称dna）。dna是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。rna在蛋白质合成过程中起着重要作用，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。核酸的研究可从本质上揭示微生物的结构、组成，甚至是致病机理的神秘面纱，可以更有效的研究如何预防、治疗由此产生的疾病，因此，对核酸的研究有着至关重要的意义。

细菌（学名：bacteria）是生物的主要类群之一，属于细菌域，也是所有生物中数量最多的一类，形状相当多样，主要有球状、杆状，以及螺旋状。将细菌做革兰氏染色，可将细菌分为两大类，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（g+），被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（g-）。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，没有磷壁酸，其细胞壁中游肽桥、肽尾和双糖形成的网状结构较为疏松，而脂类物质含量高，因此在核酸提取过程中，革兰氏阳性菌不易裂解，造成了一定提取困难，往往科学工作者会使用溶菌酶来破碎菌体细胞，不利于后续的纯化过程，影响产物的纯度。本发明的提取方法可应用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，提取过程不需要使用任何酶试剂。

生物磁珠是指磁珠一般具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够有助于磁分离地均匀分散；具有合适的且差别较小的粒径，保证了足够强的磁响应性又不会沉降；具有丰富的表面活性基团，以便可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。通过在磁珠表面包被上特异性抗体、受体等，用于分离纯化样品中的靶体。磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种无酶法全核酸提取试剂盒，可以快速安全地进行核酸提取，期间无需使用任何酶试剂，所得产物纯度高。

本发明提供了一种无酶法全核酸提取试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含：裂解液、结合液、磁珠液、洗涤液a、洗涤液b以及溶解液。

本发明的试剂盒配合了一种核酸提取纯化方法，具体操作步骤如下。

1）取1ml过夜培养的菌液，以10，000rpm的转速进行离心，所述时间为1～2分钟。

2）弃掉步骤1所述上清液。

3）向根据步骤2所述得到的菌体沉淀中加入裂解液，震荡混匀并静置5分钟，使菌体细胞完全裂解；

其中所述裂解液使用体积为300～600ul，所述的裂解液成分为2～5m胍盐、10～50mm三羟甲基氨基甲烷（tris-hcl）、5～30mm乙二胺四乙酸（edta）、0.1～2m醋酸钠（naac）、0.01～1%（体积比）聚乙二醇辛基苯基醚（triton-x100）；

所述胍盐可以是盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍、乙酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍等任意一种，其优选浓度为4～5m，所述tris-hcl优选浓度为10～30mm，所述edta优选浓度为10～20mm，所述triton优选浓度为0.1～0.5%，所述naac优选浓度为0.5～1.2m。其中裂解液的ph值为8.2；

所述的菌体沉淀特征其为可以是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，若为革兰氏阴性菌，裂解时间可按5分钟静置裂解；若为革兰氏阳性菌，可将裂解时间增加至8～10分钟。

4）向根据步骤3所述得到的溶液中加入10～30ul磁珠液和200～300ul结合液，震荡混匀，室温静置3分钟；

其中所述磁珠液特征为包含20mg/ml磁性微球、0.1～1m氯化钠（nacl）、10～50mmtris-hcl，其所述的磁性微球特征为表面修饰有硅羟基且具有超顺磁性，直径为50～1000nm。其中所述的结合液特征为包括60～80%乙醇（体积比）、10～30mmtris-hcl、0.2～0.4mnacl、0.1～0.5%吐温80（tween80）（体积比）；

优选的磁性液成分为0.4～0.5mnacl、15～25mmtris-hcl。优选的结合液成分为65～75%乙醇、10～25mmtris-hcl、0.2～0.25mnacl、0.1～0.2%tween80。

5）将离心管放置于磁力架上吸附1～2分钟，吸出并弃掉上清液。

6）向离心管中加入600～1000ul的洗涤液a，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；

其中所述洗涤a特征为包括50～500mm柠檬酸钠、10～50mmtris-hcl、10%～40%乙醇（体积比）；

优先的洗涤液a成分为150～250mm柠檬酸钠、13～25mmtris-hcl、15～25%乙醇。

7）根据所述步骤6的操作重复完成一次。

8）向离心管中加入600ul洗涤液b，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；

其中所述洗涤b特征为包括50～85%乙醇、10～30mmtris-hcl；

优选地洗涤液b成分为60～75%乙醇、20～25mmtris-hcl。

9）将离心管开盖置于55℃烘箱中2～3分钟。

10）向离心管中加入20～500ul溶解液，震荡混匀，放于56℃烘箱中2～3分钟后放于磁力架上吸附1分钟，吸取上清液转移至新的离心管中，做好标记放于-20℃保存；

其中所述溶解液的特征为包含10～50mmtris-hcl、1～20mmedta；

优选地溶解液成分为15～25mmtris-hcl、2～5mmedta；

其所述的溶解液ph值为8.2。

本发明实验操作简单便捷，可以在15到20分钟内完成提取工作，在提取过程中无需使用复杂、价格高的仪器或试剂，且试剂盒内中不含有酚氯仿等有毒的有机试剂，可以保证实验人员长期操作的安全性，并且在提取过程中无需应用任何的酶试剂，最后所得到的核酸包含有dna和rna，若菌体细胞含有质粒，产物中会存有少量质粒，其各类核酸片段完整性较好，产物纯度较高，260/280可在1.82～1.97之间，260/230可在1.93～2.02之间，可以很好应用于下游的各种检测、测序等实验。

附图说明

附图为实施例1的大肠杆菌的琼脂糖凝胶电泳检测图和实施例2的变形杆菌的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中泳道1、2、3、4为实施例1提取效果，泳道5、6、7、8为实施例2提取效果。

具体实施方式

本发明的试剂盒目的是将细菌的核酸提取出来，得到纯度高、完整性好的dna和rna。试剂盒包括：裂解液、结合液、磁珠液、洗涤液a、洗涤液b、溶解液。以下实施例是通过具体实施方式对本发明进行更加明确的说明，但并不是说本发明仅局限于以下实施方式。

实施例1。

大肠杆菌全核酸的提取。

1）取1ml过夜培养的大肠杆菌菌液，以10，000rpm的转速进行离心2分钟。

2）弃掉步骤1所述上清液。

3）向根据步骤2所述得到的大肠杆菌菌体沉淀中加入400ul裂解液，震荡混匀并静置5分钟，使大肠杆菌菌体细胞完全裂解；

其中裂解液成分为4m异硫氰酸胍、20mmtris-hcl、12mmedta、0.8mnaac、0.15%（体积比）triton-x100。

4）向根据步骤3所述得到的溶液中加入10ul磁珠液和200ul结合液，震荡混匀后于室温静置3分钟；

磁珠液含有20mg/ml磁性微球、0.4mnacl、20mmtris-hcl，其所述的磁性微球特征为表面修饰有硅羟基且具有超顺磁性，直径为300nm，其中结合液成分为70%乙醇（体积比）、25mmtris-hcl、0.21mnacl、0.1%（体积比）tween80。

5）将离心管放置于磁力架上吸附1分钟，吸出并弃掉上清液。

6）向离心管中加入600ul洗涤液a，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；

洗涤a成分为200mm柠檬酸钠、20mmtris-hcl、20%（体积比）乙醇。

7）根据所述步骤6的操作重复完成一次。

8）向离心管中加入600ul洗涤液b，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；

洗涤b成分为65%乙醇、20mmtris-hcl。

9）将离心管开盖置于55℃烘箱中3分钟。

10）向离心管中加入100ul的溶解液，震荡混匀，放于56℃烘箱中3分钟后放于磁力架吸附1分钟，吸取上清转移至新的离心管中，做好标记放于-20℃保存；

溶解液成分为20mmtris-hcl、2mmedta。

所得100ul产物使用nanodrop2000进行荧光分光光度检测，其a260值为9.31，核酸浓度为465.5ng/µl，a260/a280值为1.95，a260/a230值为2.08；

对大肠杆菌提取纯化得率为46.5微克/ml菌液。

实施例2。

变形杆菌全核酸的提取。

1）取1ml过夜培养的变形杆菌菌液，以10，000rpm的转速进行离心2分钟。

2）弃掉步骤1所述上清液。

3）向根据步骤1和步骤2所述得到的变形杆菌菌体沉淀中加入500ul裂解液，震荡混匀并静置10分钟，使变形杆菌菌体细胞完全裂解；

裂解液成分为4.5m盐酸胍、30mmtris-hcl、10mmedta、1.2mnaac、0.5%（体积比）triton-x100。

4）向根据步骤3所述得到的溶液中加入20ul磁珠液和250ul结合液，震荡混匀后于室温静置3分钟；

其中磁珠液成分为20mg/ml磁性微球、0.42mnacl、20mmtris-hcl，其磁性微球为表面修饰有硅羟基且具有超顺磁性，直径为300nm，其中结合液成分为包括75%乙醇（体积比）、15mmtris-hcl、0.24mnacl、0.2%吐温80（tween80）（体积比）。

5）将离心管放置于磁力架上吸附2分钟，吸出并弃掉上清液。

6）向离心管中加入600ul洗涤液a，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；

洗涤a成分为200mm柠檬酸钠、20mmtris-hcl、20%（体积比）乙醇。

7）根据所述步骤6的操作重复完成一次。

8）向离心管中加入600ul洗涤液b，震荡混匀，放置于磁力架上吸附30秒，吸出并弃掉上清液；

洗涤b成分为65%乙醇、20mmtris-hcl。

9）将离心管开盖置于55℃烘箱中3分钟。

10）向离心管中加入100ul溶解液，震荡混匀，放于56℃烘箱中3分钟后放于磁力架吸附1分钟，吸取上清转移至新的离心管中，做好标记放于-20℃保存；

溶解液成分为20mmtris-hcl、2mmedta。

所得100ul产物使用nanodrop2000进行荧光分光光度检测，其a260值为7.82，核酸浓度为390.8ng/µl，a260/a280值为2.02，a260/a230值为1.98；

对变形杆菌提取纯化得率为39.1ug/ml菌液。