一种革兰氏阴性菌全基因组DNA提取试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及革兰氏阴性菌基因组提取纯化方面。

背景技术：

革兰氏阴性菌是根据对细菌进行革兰氏染色的结果来区分的，将细菌作革兰氏染色，凡染后菌体呈紫色的，称“革兰氏阳性菌”，菌体呈伊红色，称“革兰氏阴性菌”。葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌是临床最为常见的病原菌，葡萄球菌属于革兰阳性球菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科，除大肠杆菌以外，变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感（嗜血）杆菌、副流感（嗜血）杆菌、卡他（摩拉）菌、不动杆菌属、志贺菌属、巴斯德菌属、霍乱弧菌、类志贺吡邻单胞菌等也是革兰氏阴性菌。

基因组dna是指细胞内所有遗传信息，它涵盖了生物体特征、特性，革兰氏阴性菌作为生活中常见的菌体类别，包括了大量致病菌类，通过对其基因组的研究，可以更加完善地研究其生活习性、细胞结构以及致病机理，对我们的疾病研究和预防有着重大意义，因此，基因组dna的高效率、高质量的提取也至关重要。

基因组dna的提取作为分子生物学的基础研究手段，提取方法主要包括酚氯仿抽提法、溴化乙锭-氯化铯（eb-cscl）梯度密度离心法、十六烷基三乙基溴化铵（ctab）法、十二烷基硫酸钠（sds）法。酚氯仿法产物纯度较高，但是所用有机试剂有毒性，长期操作会损害操作人员的身体健康；eb-cscl法产物会有eb残留污染，eb具有毒性且实验所需超速离心机设备费用也较高；ctab法主要是裂解细胞后与核酸形成复合物，但比较适合用于植物基因组提取；sds法操作较为简单，所得产物纯度较低，且会伴随大量杂质，影响产物纯度。因此，安全快速提取纯度高的基因组dna尤为重要。

异硫氰酸胍是一种化学物质，分子式是ch5n3·hscn。主要用于变性裂解细胞；提取rna和dna，抑制rna酶和dna酶的活性。作为此试剂盒裂解及去除蛋白质的主要成分，在特定的范围浓度，可以特异性保留目的核酸物质，抑制酶活，且极易去除，不会残留或影响后续实验。

生物磁珠作为目前市场广泛使用的纯化介质，有着独特的优势，便于操作，仅通过外加磁场配合不同的盐离子溶液就可以达到抓取、洗涤、释放基因组dna的目的，同时也被广泛应用于自动化核酸纯化系统方面，具有广阔的市场前景和开发应用的价值。

现有的磁珠提取方式多依靠于rna酶和蛋白酶来去除rna和蛋白质，不仅增加了实验成本，耗费了的实验时间，还会影响产物纯度、操作人员的使用及后续下游实验需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种革兰氏阴性菌全基因组dna提取试剂盒，克服现有的商用试剂盒产量低、纯度差、耗时长、操作繁琐、含有有毒有机试剂的问题，以期达到可以快速安全提取高纯度的基因组dna的目的。

通过发明人长时间的研究测试和技术改良，发现异硫氰酸胍不仅可以裂解细胞、变性蛋白，而且还可以有效地将dna及rna沉淀析出，本发明使用的胍盐浓度配合一定的范围ph值以及其它离子强度，可以有效地选择性优先沉降dna，同时，依靠裂解液中盐离子成分以及ph值可以有效地促使大部分rna降解，保证了在不使用rna酶和蛋白酶的情况下提取产物中无rna和蛋白质污染。

本发明为一种革兰氏阴性菌全基因组dna提取试剂盒，其特征在于各组分组成如下。

1）裂解液成分包括：0.5～2.5m异硫氰酸胍（guscn），0.2～2m醋酸钠（naac），0.03～0.1m三羟甲基氨基甲烷（tris-hcl），10～30mm乙二胺四乙酸（edta），0.1%～5%（质量体积比）十二酰基肌氨酸钠，10%～25%（体积比）异丙醇，所述裂解缓冲液的ph值为8.5～10.0。

2）结合液成分为：55～80%（体积比）乙醇、5～100mmtris-hcl、0.1～0.5m氯化钠（nacl）。

3）磁珠液成分包括：3%～10%（质量体积比）磁性微球，0.01%～2%（体积比）tween-20，10～100mm三羟甲基氨基甲烷（tris-hcl），其中磁性微球为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，直径为50～1000nm，所述磁性微球也可在表面修饰有羟基、羧基、氨基等基团，所述磁珠液的ph值为7.5～8.0。

4）洗涤液1的成分包括：：30%～70%（体积比）无水乙醇，0.1～2mnacl，10～300mm异硫氰酸胍（guscn），0.01%～0.5%（体积比）聚乙二醇辛基苯基醚（triton-x100），所述洗涤液1的ph值为8.5～9.2。

5）洗涤液2的成分包括：5～100mm三羟甲基氨基甲烷（tris-hcl），50～80%（体积比）无水乙醇，所述洗涤液2的ph值为7.5～8.0。

6）溶解液的成分包括：5～50mm三羟甲基氨基甲烷（tris-hcl），1～20mm乙二胺四乙酸（edta），所述溶解液的ph值为7.0～8.5。

上述试剂盒可用于对革兰氏阴性菌的基因组dna的提取，试剂盒内含说明书一份，可放置于室温保存，提取后的产物应放于4℃或-20℃保存。

本发明中试剂盒提取使用使用了一种实验方法，其特征在于包括以下的实验步骤：

1）菌体的富集：将过夜培养好的菌液以12，000rpm的转速于高速离心机上离心2分钟，使得菌体沉淀于1.5ml离心管底部，弃掉上清；

2）裂解：向所述步骤1菌体沉淀中加入0.4ml的裂解液并震荡混匀，充分裂解5分钟；

3）结合：向所述步骤2中加入0.01～0.03ml的磁珠液及0.2ml的结合液，震荡混匀后静置2分钟；

4）第一次吸附；将所述步骤3所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉；

5）第一次洗涤：向所述步骤4中加入0.6ml的洗涤液1，震荡混匀；

6）第二次吸附：将所述步骤5所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉；

7）第二次洗涤：向所述步骤6中加入0.6ml的洗涤液2，震荡混匀；

8）第三次吸附：将所述步骤7所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉；

9）热风干：将所述步骤8所用离心管开盖放置于56℃烘干箱中3分钟；

10）溶解：向所述步骤9中加入0.1～0.5ml的溶解液，放置于56℃烘箱3分钟；

11）回收：将所述步骤10所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移取上清液至新的1.5ml离心管并进行妥善保管或进行下游实验。

本发明优势在于可以快速地在20分钟内完成实验，减少了实验人员操作和时间成本；通过本发明所得产物纯度较高，通过nanodrop2000测得260/280在1.75～1.88之间，260/230在1.95～2.10之间，提取产物在琼脂糖凝胶电泳检测图中条带集中、亮度高；本发明的内含各种溶液体系中不含有苯酚、氯仿等有机的有毒试剂，且无需使用rna酶和蛋白酶即可得到纯度较高的基因组dna，保证了实验安全，控制了实验成本；本发明试剂盒可用于自动化核酸提取仪等自动化设备，用途广泛。

附图说明。

附图为本发明所述试剂盒提取大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感（嗜血）杆菌、副流感（嗜血）杆菌基因组dna的琼脂糖凝胶电泳检测图，分别对应泳道1、2、3、4、5、6、7。

具体实施方式。

为更好说明本发明试剂盒操作和效果，下面将结合实际操作案例进行演示和说明。

实施例1。

1）将过夜培养1ml大肠杆菌菌液以12，000rpm的转速于高速离心机上离心2分钟，使得菌体沉淀于1.5ml离心管底部，弃掉上清培养基。

2）向所述步骤1菌体沉淀中加入0.4ml的裂解液并震荡混匀，充分裂解3分钟；

其中裂解液成分为：1mguscn，0.3naac，0.05mtris-hcl，10mmedta，0.5%（质量体积比）十二酰基肌氨酸钠，17%（体积比）异丙醇。裂解液的ph值为8.8。

3）向所述步骤2中加入0.01ml的磁珠液及0.2ml的结合液，震荡混匀后静置2分钟，

其中磁珠液成分为：8%（质量体积比）200nm磁性微球，0.05%（体积比）tween-20，50mmtris-hcl；

磁珠液的ph值为7.7；

其中结合液成分为：75%（体积比）乙醇、50mmtris-hcl、0.42mnacl；

结合液的ph值为8.8。

4）将所述步骤3所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。

5）向所述步骤4中加入0.6ml的洗涤液1，震荡混匀；

其中洗涤液1的成分为：50%（体积比）无水乙醇，0.15mnacl，100mmguscn，0.05%（体积比）triton-x100；

洗涤液1的ph值为8.6。

6）将所述步骤5所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。

7）向所述步骤6中加入0.6ml的洗涤液2，震荡混匀；

其中洗涤液2的成分为：10mmtris-hcl，75%（体积比）无水乙醇；

洗涤液2的ph值为7.5。

8）将所述步骤7所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。

9）将所述步骤8所用离心管开盖放置于56℃烘干箱中3分钟。

10）向所述步骤9中加入0.1ml的溶解液，放置于56℃水浴3分钟；

其中溶解液成分为：25mmtris-hcl，2.5mmedta；

溶解液的ph值为8.2。

11）将所述步骤10）所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移取上清液至新的1.5ml离心管，以nanodrop2000进行定量分析并取0.005ml进行琼脂糖凝胶电泳检测。通过nanodrop定量，浓度可达280μg/ml，产率为28μg/（ml菌液），a260/a280为1.83，a260/a230为2.04。

实施例2。

1）将过夜培养1ml变形杆菌菌液以12，000rpm的转速于高速离心机上离心2分钟，使得菌体沉淀于1.5ml离心管底部，弃掉上清培养基。

2）重复步骤1两次，并向菌体沉淀中加入0.4ml的裂解液并震荡混匀，充分裂解6分钟；

其中裂解液成分为：1mguscn，0.3naac，0.05mtris-hcl，10mmedta，0.5%（质量体积比）十二酰基肌氨酸钠，17%（体积比）异丙醇；

裂解液的ph值为8.8。

3）向所述步骤2中加入0.02ml的磁珠液及0.2ml的结合液，震荡混匀后静置2分钟；

其中磁珠液成分为：8%（质量体积比）200nm磁性微球，0.05%（体积比）tween-20，50mmtris-hcl；

磁珠液的ph值为7.7；

其中结合液成分为：75%（体积比）乙醇、50mmtris-hcl、0.42mnacl；

结合液的ph值为8.8。

4）将所述步骤3所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。

5）向所述步骤4中加入0.6ml的洗涤液1，震荡混匀；

其中洗涤液1的成分为：50%（体积比）无水乙醇，0.15mnacl，100mmguscn，0.05%（体积比）triton-x100；

洗涤液1的ph值为8.6。

6）将所述步骤5所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。

7）向所述步骤6中加入0.6ml的洗涤液2，震荡混匀；

其中洗涤液2的成分为：10mmtris-hcl，75%(体积比)无水乙醇；

洗涤液2的ph值为7.5。

8）将所述步骤7所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移除上清液弃掉。

9）将所述步骤8所用离心管开盖放置于56℃烘干箱中3分钟。

10）向所述步骤9中加入0.3ml的溶解液，放置于56℃水浴3分钟；

其中溶解液成分为：25mmtris-hcl，2.5mmedta；

溶解液的ph值为8.2。

11）将所述步骤10所用离心管置于磁力架吸附1分钟，用移液器小心移取上清液至新的1.5ml离心管，以nanodrop2000进行定量分析并取0.005ml进行琼脂糖凝胶电泳检测。通过nanodrop定量，浓度可达272μg/ml，产率为27.2μg/（ml菌液），a260/a280为1.78，a260/a230为1.97。

实施例3。

实施步骤与实施例1相同，分别测试了痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感（嗜血）杆菌、副流感（嗜血）杆菌这五种革兰氏阴性菌的1ml过夜培养菌液的基因组dna提取效果，产率分别为29.2、28.0、27.3、23.8、25.1μg/（ml菌液）。

以上实施例仅是对本发明的举例，以便更清楚地说明本发明试剂盒的提取效果，但并不是说本发明仅仅局限于此几种实施例，对于其他革兰氏阴性菌依旧有着同样良好的提取效果，同时也依然在本发明的保护范围之中。