本发明涉及天然活性物质的提取，提供一种具有免疫活性的野葛根多糖制备方法。
背景技术：
葛根是豆科葛属多年生落叶藤本植物的块根，药食同源，分为粉葛和野葛。粉葛富含淀粉,是重要的食材及食品添加剂；野葛为中医中常用的祛风解毒药，富含异黄酮类、多糖类、氨基酸及微量元素等物质，素有“南方人参”的美誉。现代科学证明其有广泛的药理和保健功能，其有效成分在维持心血管系统稳定性、保护脑神经、抗氧化、防止肝肾损伤、改善代谢与免疫功能等方面均有一定的药理作用，葛根黄酮具有改善心脑血液循环,扩张冠状动脉,降血压,降血糖等作用;大豆苷元有明显抗心律失常作用,抑制白血细胞的增殖及黑色素瘤细胞的分化，具有可观的临床应用前景。
多糖是构成生命的四大基本物质之一，由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。分子量从几万到几千万，具有许多生物活性，包括抗感染、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、抗病毒等作用。多糖广泛存在于高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中，不但是生物体的重要组成部分还参与多种生理功能。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有免疫调节活性的野葛根多糖制备方法，并采用小鼠巨噬细胞raw264.7分泌的免疫活性因子（tnf-α，no，il-6）作为指标，对该多糖的免疫调节活性进行评价。为野葛根功能食品开发提供相关数据。
本发明技术方案如下：
一种具有免疫活性的野葛根多糖制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
（1）将新鲜野葛根除杂，清洗干净，沥干，切碎；
（2）将野葛根碎块加水磨浆，料水比1:30~1:50，热处理，冷却至室温；
（3）在浆液中加入酶进行酶解反应，酶解条件为：先加高温淀粉酶，时间1~2小时，温度50~65℃，ph5~6.5；后加糖化酶，时间1~2小时，温度50~65℃，ph6~7；
（4）将灭酶后的浆液过滤，滤液在40~55℃进行真空浓缩；
（5）浓缩液中加入无水乙醇，体积比1:3~1:5，静置过夜，离心分离得野葛根多糖湿品；
（6）野葛根多糖加水复溶，真空冷冻干燥后得到野葛根多糖成品。
上述方法中，步骤（2）中，所述热处理温度为80~99℃，热处理时间为2~3小时。
上述方法中，步骤（3）中，所述酶解使用的酶为耐高温淀粉酶及糖化酶，用量分别为浆液重量的0.0012%-0.0020%和0.0080%-0.015%。
上述方法中，步骤（3）中淀粉酶酶解时间1.5小时，温度60℃，ph6。
上述方法中，步骤（3）中糖化酶酶解时间1.5小时，温度60℃，ph6.5。
上述方法中，步骤（3）中，所述酶解时加入浆液重量0.2%的氯化钙以增加酶的稳定性及耐热性。
上述方法中，步骤（4）中真空浓缩温度为55℃。
作为优化，步骤（2）中，酶解后进行灭酶处理：高温淀粉酶灭酶温度100℃，ph3以下，时间5分钟；糖化酶灭酶温度98℃，ph6.5，时间20分钟。
以脂多糖为阳性对照，不同浓度（1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml和62.5μg/ml）的野葛根多糖使小鼠巨噬细胞中no、tnf-α和il-6的表达量显著升高，且表达量随着该多糖浓度的升高而升高，呈现出明显的剂量效应关系。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
（1）较传统方法相比，本方法生产的多糖具有显著的免疫调节活性。
（2）采用了复合酶水解提取，提高了葛根多糖的得率。
（3）本方法工艺简单。
附图说明
图1为不同浓度的野葛根多糖对小鼠巨噬细胞表达no（a）的影响。
图2为不同浓度的野葛根多糖对小鼠巨噬细胞表达tnf-α（b）的影响。
图3为不同浓度的野葛根多糖对小鼠巨噬细胞表达il-6（c）的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方法不限于此。
本实施例中所用到的试剂为：
耐高温淀粉酶；糖化酶；无水乙醇；氯化钙；小鼠raw264.7细胞；dmem培养基；小鼠il-6elisa试剂盒、小鼠tnf-αelisa试剂盒；一氧化氮（no）测试盒。
本实施例中所用到的实验仪器为：
旋转蒸发仪，真空冷冻干燥机，co2培养箱。
实施例1
（1）将新鲜野葛根去皮，洗净，沥干，切碎；
（2）将得到的野葛根加水磨浆，料水比1：30，在99℃下热处理2.5小时，冷却至室温
（3）在浆液中加入酶进行酶解反应，酶解条件为：先加耐高温淀粉酶，用量为浆液重量的0.0012%，时间1.5小时，温度60℃，ph6；后加糖化酶，用量为浆液重量的0.0080%。时间1.5小时，温度60℃，ph6.5；酶解后进行灭酶处理：耐高温淀粉酶灭酶温度100℃，ph6.5以下，时间5分钟；糖化酶灭酶温度98℃，ph6.5，时间20分钟；
（4）将灭酶后的浆液过滤，滤液在55℃进行真空浓缩；
（5）浓缩液中加入无水乙醇，体积比1:4，静置过夜，离心分离得野葛根多糖湿品；
（6）野葛根多糖加水复溶，真空冷冻干燥后得到野葛根多糖成品。
按上述方法提取野葛根多糖，得率达25.3%。
实施例2
（1）将新鲜野葛根去皮，洗净，沥干，切碎；
（2）将得到的野葛根加水磨浆，料水比1:40，在99℃下热处理3小时，冷却至室温；
（3）在浆液中加入酶进行酶解反应，酶解条件为：先加耐高温淀粉酶，用量为浆液重量的0.0015%，时间2小时，温度60℃，ph6；后加糖化酶，用量为浆液重量的0.010%。时间2小时，温度60℃，ph6.5；酶解后进行灭酶处理：耐高温淀粉酶灭酶温度100℃，ph3以下，时间5分钟；糖化酶灭酶温度98℃，ph6.5，时间20分钟；
（4）将灭酶后的浆液过滤，滤液在55℃进行真空浓缩；
（5）浓缩液中加入无水乙醇，体积比1:4，静置过夜，离心分离得野葛根多糖湿品；
（6）野葛根多糖加水复溶，真空冷冻干燥后得到野葛根多糖成品。
按上述方法提取野葛根多糖，得率达24.8%。
实施例3
（1）将新鲜野葛根去皮，洗净，沥干，切碎。
（2）将得到的野葛根加水磨浆，料水比1:50，在99℃下热处理3小时，冷却至室温；
（3）在浆液中加入酶进行酶解反应，酶解条件为：先加耐高温淀粉酶，用量为浆液重量的0.0020%，时间2小时，温度60℃，ph6；后加糖化酶，用量为浆液重量的0.015%。时间2小时，温度60℃，ph6.5；酶解后进行灭酶处理：耐高温淀粉酶灭酶温度100℃，ph3以下，时间5分钟；糖化酶灭酶温度98℃，ph6.5，时间20分钟。
（4）将灭酶后的浆液过滤，滤液在55℃进行真空浓缩；
（5）浓缩液中加入无水乙醇，体积比1:4，静置过夜，离心分离得野葛根多糖湿品。
（6）野葛根多糖加水复溶，真空冷冻干燥后得到野葛根多糖成品。
按上述方法提取野葛根多糖，得率达25.1%。
野葛根多糖溶液的配制
将野葛根多糖用dmem培养基溶解后配成1mg/ml的母液，并等梯度稀释成1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml和62.5μg/ml五个剂量组。
细胞培养
解冻小鼠巨噬细胞raw264.7，迅速将解冻细胞转移到15ml的无菌离心管，加入12mldmem培养基，混匀后低速离心（1000rpm/min，5min）。除去培养基，加入新鲜的培养基，将细胞悬浮后转移至细胞培养瓶中。置于co2培养箱中培养（37℃，5%co2），每隔两天换一次培养基。
小鼠巨噬细胞raw264.7分泌细胞因子的测定
将处于对数生长期的raw264.7细胞用胰蛋白酶消化后，配成细胞浓度为1×106个/ml的细胞悬液，反复吹打均匀后接种于96孔板中(100µl/孔)，置于co2培养箱培养使细胞重新贴壁。24h后，吸去培养基，加入100µl不同浓度（1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml和62.5μg/ml）的野葛根多糖溶液，阳性对照组加入100µl含脂多糖（50μg/ml）的培养基，调零组和阴性对照组分别加入100µldmem培养基，每组设3个平行孔。将细胞放回co2培养箱中培养24h，用一氧化氮检测试剂盒和elisa试剂盒测定细胞上清液中各细胞因子（no、tnf-α和il-6）的表达量。
野葛根多糖免疫活性结果分析：
先天性免疫应答的刺激调节可以增强机体对抗外源病原体的威胁。一般认为，免疫系统的刺激调节主要是通过激活巨噬细胞系统和补体系统来实现的。如图1~3所示，经过野葛根多糖处理后，小鼠巨噬细胞中no、tnf-α和il-6的表达量均显著升高，且表达量随着多糖浓度的升高而升高，呈现出明显的剂量效应。如1图所示no的表达随着多糖浓度上升而不断升高，在浓度250µg/ml到500µg/ml内上升速度放缓，在1000µg/ml浓度时no表达量最高；如2图所示，tnf-α的浓度随着多糖浓度的升高而升高，呈现出明显的剂量效应，在低浓度时为阴性对照的2倍左右，经过1000µg/ml多糖处理的小鼠细胞其tnf-α的表达水平为阴性对照的3倍左右；多糖浓度在500µg/ml到1000µg/ml范围内时，tnf-α浓度上升速度明显放缓，tnf-α的表达量无明显差异。如图3所示，多糖对il-6的激活表达较为显著，小鼠巨噬细胞经1000µg/ml的多糖处理后其il-6的表达水平将近是阴性对照组的40倍。综合以上指标，表明该野葛根多糖具有很强的免疫调节活性。
注：不同小写字母表示组间具有显著性差异（p＜0.05），相同字母表示组间不具有显著性差异。横坐标ge-2表示野葛根多糖。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。