本发明属于亚硫酸氢根荧光探针制备领域，具体涉及一种基于萘醌的亚硫酸氢根荧光探针及其制备和应用。
背景技术：
亚硫酸氢盐在食品工业中被广泛的用作防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂和漂白剂，能够防止食品氧化，抑制酶促褐变和非酶褐变，而且能够和微生物反应来促进食品的稳定，对食品达到保鲜的效果。因此被广泛的用在葡萄、干果、马铃薯、果汁和葡萄酒等食品加工中。在医药中，通常用硫磺熏蒸的方法来加工药材，其目的有利于一些根茎类药材的干燥，有助于中药材贮藏中的防虫、防霉以及常用于中药材的漂白增色，但是加工过程中会产生hso3-，当hso3-残留量较多时，可能会造成中药材本身有效成分的改变，影响中药材的质量和疗效。长期服用hso3-残留量过高的中药材会对人体产生严重危害。因此关于hso3-在食品和药品中的含量在许多国家都受到严格的控制，例如，在中国，葡萄酒和啤酒中亚硫酸氢盐的含量不得超过0.05mg/kg，糖中的亚硫酸氢盐含量不得超过0.10g/kg。
邻萘醌是在2005年报道的一种荧光染料，因为含有酮、腈基等强吸电子基团，这类染料可在有机溶剂中与硫醇、胺等物质发生快速的亲核反应。在pbs溶液中可用于荧光识别传感生物活性硫醇cys、hcy和h2s。由于该类化合物的活性太高，硫醇和硫化氢等多种亲核性能够与其发生反应，选择性较差。相对于硫醇和硫化氢，亚硫酸氢钠具有更高的亲核加成反应活性，因此本专利通过将腈基变为酯基，降低其亲核反应活性，从而实现了对so2的特异性识别传感。为设计新型的基于亲核加成反应的高选择性荧光探针提供了新的思路。
技术实现要素：
本发明提出了一种于萘醌的亚硫酸氢根荧光探针及其制备和应用，以萘醌为荧光团，双键为反应位点，构建了荧光探针(ⅰ)。探针与亚硫酸氢根发生迈克尔加成产物，从而实现了对亚硫酸氢根的检测。
实现本发明的技术方案是：一种基于萘醌的亚硫酸氢根荧光探针，结构式如(ⅰ)所示：
所述的基于萘醌的亚硫酸氢根荧光探针的制备方法，步骤如下：
(1)将苊醌溶解于甲苯中，向其中加入腈基乙酸乙酯、乙酸铵和乙酸，在回流温度下反应6-10h，反应结束后，冷却至室温，用旋转蒸发仪除去甲苯，加入碳酸氢钠水溶液进行稀释后，用二氯甲烷和水进行萃取，合并浓缩得到黄灰色固体，用氯仿和正己烷进行重结晶，得到化合物1-a和1-b的混合物；
(2)将步骤(1)得到的混合物溶解于乙腈中，加入碳酸钾，在回流温度下反应4-8h，反应结束后，分离纯化得到结构式为(ⅰ)的荧光探针。
所述步骤(1)混合物中1-a和1-b的物质的量之比为1：1。
所述步骤(1)中1-a(z)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)乙酸乙酯的结构式为
所述步骤(1)中苊醌、腈基乙酸乙酯、乙酸铵和乙酸的物质的量之比为1：(1-3)：(0.2-0.5)：(0.5-1.5)。
所述回流温度为100-120℃。
所述步骤(2)中混合物与碳酸钾的物质的量之比为12：(1-1.2)。
所述的荧光探针在检测环境水样、食糖中的亚硫酸氢根的应用。
分别测试探针储存液加入亚硫酸氢根前后的紫外可见光谱和荧光光谱的变化，荧光的激发波长为365nm；检测水溶液中亚硫酸氢根的检测。
荧光光谱的变化为：以365nm光激发时，在430nm处的荧光迅速增强，约35min达到最高值。
本发明的有益效果是：(1)本专利涉及一种新型的荧光探针；(2)即使在毫摩尔级的亚硫酸氢根的存在下，探针(ⅰ)与亚硫酸氢根也能很好的反应；(3)本发明中的探针合成简单，能快速检测水溶液中的亚硫酸氢根，选择性好、灵敏度高、探针(ⅰ)最低检测限为26nm。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1、2、3化合物1-a和1-b的1hnmr图谱。
图2是实施例1、2、3探针(ⅰ)的1hnmr图谱。
图3是实施例1、2、3探针(ⅰ)的13cnmr图谱。
图4是在pbs缓冲(10mm，ph＝7.4)体系中，10μm探针(ⅰ)与50μm亚硫酸氢根反应时，荧光光谱随时间的变化图。
图5是在pbs缓冲(10mm，ph＝7.4)体系中，10μm探针(ⅰ)与不同浓度亚硫酸氢根(0-50μm)反应的荧光光谱图。
图6是在pbs缓冲(10mm，ph＝7.4)体系中，10μm探针(ⅰ)与浓度范围在0-50μm的亚硫酸氢根反应时，在430nm处的荧光强度与亚硫酸氢根浓度的线性关系图。
图7是在pbs缓冲(10mm，ph＝7.4)体系中，10μm探针(ⅰ)及其加入不同的阴离子和小分子(50μm)反应35min时于430nm处的荧光发射光谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
化合物(z)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)乙酸乙酯(1-a)和(e)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)(1-b)的合成
称取苊醌1.00g(5.49mmol)，溶解于20ml甲苯中，向其中加入腈基乙酸乙酯0.62g(5.56mmol)，乙酸铵0.1g(1.30mmol)，乙酸0.3g(5.00mmol)。在100℃下反应6h，反应结束后，冷却至室温，用旋转蒸发仪即可除去甲苯，加入碳酸氢钠水溶液进行稀释后，用二氯甲烷和水进行萃取，并用硫酸镁干燥有机相，合并浓缩得到黄灰色固体，用氯仿和正己烷进行重结晶，得到化合物1-a和1-b的混合物，其中1-b较易溶于正己烷中，经核磁鉴定混合物中1-a和1-b的含量约为1：1。
1hnmr(cdcl3,400mhz,ppm):8.74(d,j＝7.40hz,1h),8.44(dd,j＝7.20hz,1h),8.20(d,j＝1.28hz,1h),8.18(d,j＝1.28hz,1h),8.12(d,j＝8.28hz,2h),8.09(d,j＝12.48hz,1h),7.82(d,j＝8.08hz,2h),7.78(d,j＝9.20hz,2h),4.54(m,j＝7.16hz,4h),1.49(m,j＝7.08hz,6h)。
探针(ⅰ)的合成：
称取混合物(z)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)乙酸乙酯和(e)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)(332mg,1.2mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入8ml乙腈使其溶解，加入碳酸钾(13.8mg，0.10mmol)，在100℃温度下反应4h，反应结束后，冷却至室温，用旋转蒸发仪除去溶剂，之后用二氯甲烷萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，除去二氯甲烷，粗产品通过硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1,v/v)，得黄色探针(ⅰ)。
1hnmr(cdcl3,400mhz,ppm):8.68(d,j＝7.40hz,1h),8.34(t,j＝7.31hz,2h),8.23(d,j＝8.24hz,1h),7.89(t,j＝7.72hz,1h),7.78(t,j＝7.84hz,1h),4.52-4.57(m,j＝7.12hz,2h)；
13cnmr(cdcl3,100mhz,ppm):179.50,163.39,139.12,136.76,135.01,132.43,132.28,132.09,128.65,128.27,127.20,126.67,122.90,122.73,113.39,62.88。
实施例2
化合物(z)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)乙酸乙酯(1-a)和(e)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)(1-b)的合成
称取苊醌1.00g(5.49mmol)，溶解于20ml甲苯中，向其中加入腈基乙酸乙酯1.22g(10.98mmol)，乙酸铵0.17g(2.2mmol)，乙酸0.16g(2.74mmol)。在110℃回流温度下反应8h，反应结束后，冷却至室温，用旋转蒸发仪即可除去甲苯，加入碳酸氢钠水溶液进行稀释后，用二氯甲烷和水进行萃取，并用硫酸镁干燥有机相，合并浓缩得到黄灰色固体，用氯仿和正己烷进行重结晶，得到化合物1-a和1-b的混合物，其中1-b较易溶于正己烷中，经核磁鉴定混合物中1-a和1-b的含量约为1：1。
探针(ⅰ)的合成：
称取混合物(z)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)乙酸乙酯和(e)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)(332mg,1.2mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入8ml乙腈使其溶解，加入碳酸钾(15.2mg，0.11mmol)，在110℃回流温度下反应6h，反应结束后，冷却至室温，用旋转蒸发仪除去溶剂，之后用二氯甲烷萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，除去二氯甲烷，粗产品通过硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1,v/v)，得黄色探针(ⅰ)。
实施例3
化合物(z)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)乙酸乙酯(1-a)和(e)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)(1-b)的合成
称取苊醌1.00g(5.49mmol)，溶解于20ml甲苯中，向其中加入腈基乙酸乙酯1.86g(16.47mmol)，乙酸铵0.21g(2.74mmol)，乙酸0.49g(8.24mmol)。在120℃反应10h，反应结束后，冷却至室温，用旋转蒸发仪即可除去甲苯，加入碳酸氢钠水溶液进行稀释后，用二氯甲烷和水进行萃取，并用硫酸镁干燥有机相，合并浓缩得到黄灰色固体，用氯仿和正己烷进行重结晶，得到化合物1-a和1-b的混合物，其中1-b较易溶于正己烷中，经核磁鉴定混合物中1-a和1-b的含量约为1：1。
探针(ⅰ)的合成：
称取混合物(z)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)乙酸乙酯和(e)-2-氰基-2-(2-氧代亚萘基-1(2h)-亚基)(332mg,1.2mmol)于50ml的圆底烧瓶中，加入8ml乙腈使其溶解，加入碳酸钾(16.6mg，0.12mmol)，在120℃下反应8h，反应结束后，冷却至室温，用旋转蒸发仪除去溶剂，之后用二氯甲烷萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，除去二氯甲烷，粗产品通过硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1,v/v)，得黄色探针(ⅰ)。
1.探针与亚硫酸氢根反应的荧光强度随时间的变化
配制ph＝7.4的pbs(10mm)缓冲溶液；称取探针(ⅰ)，用dmso溶解，准确配制2mm的探针(ⅰ)储存液；配制20mm的亚硫酸氢根。向比色皿中加入2.0ml的pbs缓冲溶液，混合均匀后，加入10μl浓度为2mm的探针(ⅰ)储存液，再加入5当量亚硫酸氢根，进行荧光光谱测试。如图4所示，该探针在430nm处的荧光强度逐渐增强，大约在35min内反应达到平衡。
2.探针与亚硫酸氢根反应的荧光强度随亚硫酸氢根浓度的变化
向2ml的pbs缓冲(10mm，ph＝7.4)体系中，加入10μl浓度为2mm的探针(ⅰ)储存液，再加入不同浓度亚硫酸氢根(0-50μm)，反应35min，以365nm光激发，进行荧光光谱测定。随着亚硫酸氢根浓度的增加，荧光强度逐渐增加。如图5和图6所示，对荧光强度与亚硫酸氢根的浓度进行线性拟合，发现亚硫酸氢根的浓度范围为0-50μm时，荧光强度与浓度呈现很好的线性关系，检测限为26nm，具有很高的灵敏度，远低于水溶液中糖的含量(0.10g/kg)，。3.不同阴离子和小分子对探针的影响
配制20mm的不同种类的阴离子和小分子储备液。向2ml的pbs缓冲(10mm，ph＝7.4)体系中，加入10μl浓度为2mm的探针(ⅰ)储存液，再分别加入20当量的分析物：f-,cl-,br-,i-,so42-,no3-,no2-,co32-,h2po4-,hpo42-,aco-,scn-,s2o32-,clo-,hs-,hco3-,h2o2,cys,hcy,gsh)，反应35min后，进行荧光光谱测定。如图7所示，实验结果表明其它种类的阴离子和小分子不与探针发生反应，不干扰探针对亚硫酸氢根的特异性识别。
4.探针(ⅰ)在实际样品中的应用
为了研究探针(ⅰ)在实际生活中的应用，我们将探针应用到对食品中hso3-的准确检测中。我们测试了白砂糖中hso3-的含量。首先准确称取500mg的白砂糖将其溶解在15ml的pbs(10mm，ph＝7.4)缓冲溶液中。然后向其中加入终浓度为10um的探针溶液，反应30min后测量430nm处的荧光强度，然后根据图6的荧光标准曲线计算亚硫酸氢钠的含量。我们实际测得白砂糖中亚硫酸氢钠的含量为：14.0474mg/kg。而国家规定食糖中亚硫酸氢钠的含量不得超过100mg/kg，说明我们所测的食糖中的亚硫酸氢钠的含量没有超标。然后通过加标回收法向样品中加了5μm的hso3-，其结果表1所示。由实验结果表明，探针(ⅰ)可用于检测食品中hso3-的含量。
表1探针(ⅰ)检测白砂糖中的nahso3
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。