本发明涉及具有降血糖活性的化合物，具体涉及从中药三白草中提取分离得到的具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜类新化合物及其在预防和治疗糖尿病疾病中的用途，属医药技术领域。
背景技术：
随着人民生活水平日益提高，糖尿病患病率急剧增加，目前全球糖尿病患者已超过3.6亿，预计到2030年将突破6亿。我国已有糖尿病患者人数约9200万，成为世界上糖尿病人数最多的国家。糖尿病患者体内代谢紊乱若得不到及时控制，可引起全身各种急、慢性并发症，可累及多个器官组织损害，如导致失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭、肢体坏疽等多种并发症，甚至死亡。糖尿病已成为继心血管疾病、恶性肿瘤之后导致人类死亡的第三大“健康杀手”。
目前尚缺乏有效治疗糖尿病的药物，多以西药控制症状为主，且具有胃肠道反应、肝损伤、低血糖等严重不良反应。糖尿病在我国传统医学里称为“消渴症”。早在二千多年前《黄帝内经》之《素问》、《灵枢》中就记载了“消渴症”，中医药治疗糖尿病历史悠久，积累了丰富的经验，而中药具有作用缓和持久、毒副作用小，适合糖尿病患者长期服用等特点，并在有效预防和缓解糖尿病及其并发症、提高胰岛素敏感性方面有着化学药物不可替代的综合优势，已引起医药界越来越多关注。因此，从具有显著降血糖活性的中药中寻找具有抗糖尿病活性的新型天然产物具有广阔发展前景。
三白草系三白草科植物saururuschinensis(lour.)baill的干燥地上部分，具有利尿消肿、清热解毒的功效，主要用于治疗尿路感染，尿结石，肾炎水肿，白带过多等症，同时在韩国、日本等地也作为民间常用药物。国内外通过整体动物、细胞、分子等多种药效学实验均已证明三白草具有显著降血糖活性，同时能够改善胰岛素抵抗和凝血异常，但对三白草中具有降血糖生物活性的化学成分研究报道甚少。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，对三白草化学成分和降血糖活性进行系统深入研究，分离得到具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜类化合物。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜化合物，其结构式如下：
分子式为c20h28o5，结构末端有一个α,β-不饱和内酯环，分子链中含有羧基取代基，本发明将其命名为三白草二萜d。
本发明提供的具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜的提取分离方法包括以下步骤：
(1)取干燥的三白草地上部分，用溶剂提取法或超临界co2萃取法提取，回收溶剂后，得到三白草提取物；
(2)取三白草提取物经硅胶柱色谱、mci柱色谱和制备液相色谱方法分离得到目标化合物三白草二萜d。
以上制备方法中，步骤1提取方法可以是冷浸、渗漉、微波提取、超声提取、回流提取、超临界co2萃取等。
步骤(2)所述的硅胶柱层析(湿法装柱，干法上样)，然后采用石油醚-乙酸乙酯(体积比50∶1～0∶100)、乙酸乙酯-甲醇(体积比50∶1～0∶100)梯度洗脱得到10个组分(fr.1～fr.10)后，根据薄层色谱检测，取fr.4部位经mci柱除色素(90％乙醇洗脱)后，经ods中压制备，甲醇-水(1∶1～0∶1)梯度洗脱得fr.4-1～fr.4-5，fr.4-3经半制备hplc分离,色谱条件：inertsilods-3(20mm×250mm，10μm)色谱柱，流动相为甲醇-水＝7∶3，流速10ml/min，柱温为室温，收集tr13.8～14.5min色谱峰，得到叉甲基丁内酯二萜化合物。
以本发明提供的具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜化合物，将三白草二萜d和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂等剂型。
将本发明提供的叉甲基丁内酯二萜化合物制成片剂时，把叉甲基丁内酯二萜化合物和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，整粒，然后压片制成片剂。
本发明提供的叉甲基丁内酯二萜化合物制成胶囊剂时把叉甲基丁内酯二萜化合物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明提供的叉甲基丁内酯二萜化合物制成颗粒剂时，把叉甲基丁内酯二萜化合物和稀释剂乳糖或玉米淀粉、混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
本发明提供的叉甲基丁内酯二萜化合物制成粉针剂、注射液时加入载体按药学常规方法制备得到。
本发明提供的叉甲基丁内酯二萜化合物制成脂肪乳剂、软膏剂或透皮控释贴剂等剂型时加入载体按药学常规方法制备得到。
本发明提供的具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜化合物(三白草二萜d)在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用。
作为优选方案，本发明提供的具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜化合物在制备治疗糖尿病药物中的应用，对防治2型糖尿病的a一葡萄糖普酶和ptpib两个重要的靶点具有明显的抑制作用，特别是对a一葡萄糖普酶的抑制作用强度比临床降血糖药物阿卡波糖高10倍以上，具有显著的生物活性。
有益效果：本发明提供的具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜化合物和现有技术相比具有以下优点：
本发明通过对三白草化学成分进行系统深入研究，经过波谱和质谱数据分析表明从三白草中分离得到一个叉甲基丁内酯二萜化合物(三白草二萜d)为一新化合物。且经过体外降血糖活性研究表明，本发明提供的叉甲基丁内酯二萜化合物(三白草二萜d)对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶等均具有很强的抑制活性，ic50仅为阳性药(阿卡波糖)的约十五分之一。本发明提供的具有降血糖活性的叉甲基丁内酯二萜是一种优良的降血糖新化合物，可开发成新的降血糖药物。
附图说明
图1为叉甲基丁内酯二萜化合物的结构示意图；
图2为叉甲基丁内酯二萜化合物的1hnmr图；
图3为叉甲基丁内酯二萜化合物的13cnmr图；
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1叉甲基丁内酯二萜化合物的制备
(1)取三白草粗粉8kg，采用超临界co2萃取，萃取压力30mpa，萃取温度50℃，萃取时间2h，95％乙醇为夹带剂，夹带剂加入量为药材量的1倍，减压浓缩后得萃取物(约110g)；
(2)取步骤(1)萃取物上硅胶柱层析(湿法装柱，干法上样)，然后采用石油醚-乙酸乙酯(体积比50∶1～0∶100)、乙酸乙酯-甲醇(体积比50∶1～0∶100)梯度洗脱得到10个组分(fr.1～fr.10)后，根据薄层色谱检测，取fr.4部位经mci柱除色素(90％乙醇洗脱)后，经ods中压制备，甲醇-水(1∶1～0∶1)梯度洗脱得fr.4-1～fr.4-5，fr.4-3经半制备hplc分离,色谱条件：inertsilods-3(20mm×250mm，10μm)色谱柱，流动相为甲醇-水＝7∶3，流速10ml/min，柱温为室温，收集tr13.8～14.5min色谱峰，得到叉甲基丁内酯二萜化合物。(收率：15.0mg)，结构式如图1所示。
叉甲基丁内酯二萜化合物的结构解析：
淡黄色胶状物(meoh)，hr-esi-msm/z:347.1859[m-h]-，(calcdforc20h27o5347.1864)，结合1h-nmr、13c-nmr确定分子式为c20h28o5。1hnmr(400mhz,cdcl3)显示有4个甲基质子1.67(3h,s,h-16),1.59(3h,s,h-17),1.26(3h,s,h-19),2.17(3h,d,j＝1.2hz,h-20)，4个烯质子6.87(1h,t,j＝7.4hz,h-10),5.96(1h,d,j＝1.2hz,h-2),5.48(1h,t,j＝7.9hz,h-5),5.13(1h,t,j＝7.2hz,h-14)，另外含有5个次甲基信号2.59(2h,d,j＝8.0hz,h-6),2.32(4h,m,h-12,13),2.10(2h,m,h-9),1.63(2h,m,h-8)；13cnmr显示共有20个c信号，其中包括两个羰基信号δ172.80(c-2),169.46(-cooh),8个烯碳信号154.61(c-3),152.24(c-4),144.64(c-10),132.43(c-15),131.68(c-11),123.50(c-14),116.51(c-2),108.10(c-5),一个连接杂原子碳信号72.82(c-7)。
1h-1hcosy谱中，5.13(1h,t,j＝7.2hz,h-14)分别与1.67(3h,s,h-16),1.59(3h,s,h-17)相关，说明结构中含有异丁烯基片段，6.87(1h,t,j＝7.4hz,h-10)与2.10(2h,m,h-9)相关，2.10(2h,m,h-9)与1.63(2h,m,h-8)相关,2.32(2h,m,h-12,13)与5.13(1h,t,j＝7.2hz,h-14)相关(fig.2-1-3)。结合以上波谱数据，并与文献比对，确定该化合物为叉甲基丁内酯二萜，根据h-10化学位移位于较低场，与三白草二萜b和c一致，而与处于顺式的三白草二萜a向低场位移0.93ppm，确定c-10，c-11的双键为反式构型，由5.46(1h,d,j＝9.3hz,h-5)两重峰变成三重峰5.48(1h,t,j＝7.9hz,h-5)，同时4.62(1h,d,j＝9.3hz,h-6)向高场位移至2.59(2h,d,j＝8.0hz,h-6),碳谱中也由71.75(c-6)向高场位移至40.86(c-6)，表明6位无羟基取代。c-7绝对构型有待进一步确定，经检索该化合物为尚无文献记载的新化合物，命名为三白草二萜d。
实施例2体外降血糖试验
1.α-淀粉酶抑制活性
在96孔板筛中依次加入70μlpbs盐缓冲液(ph＝6.9)，30μg/mlα-淀粉酶5μl，并加入一定浓度的叉甲基丁内酯二萜样品2μl，37℃温浴10min后加入20μl10％淀粉底物，37℃反应20min，加入3μli2-ki溶液终止反应，于550nm处测定吸光度值(a值)；同时设定空白对照(只加缓冲液)、阴性对照(只加缓冲液和酶液)和阳性对照(阿卡波糖)。以上所有样品及空白反应均重复3次，取平均值作为实验数据。
抑制率(％)＝[(a酶-a酶空)-(a样-a样空)]/(a酶-a酶空)×100％
实验结果：化合物叉甲基丁内酯二萜的1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和50μg/ml6个浓度对α-淀粉酶的抑制率分别为2.17％，5.42％，12.83％，23.25％，39.48％，63.09％。计算ic50为29.71μg/ml。(阿卡波糖ic50为492.18μg/ml)。
2、α-葡萄糖苷酶抑制活性
在96孔板筛中依次加入76μlpbs缓冲液(ph＝6.8)，α-葡萄糖苷酶(1u/ml)2μl，加入一定浓度的叉甲基丁内酯二萜样品溶液2μl，37℃恒温下温育10min后，加入底物pnpg20μl，37℃恒温反应30min，于405nm波长下测定吸光度值(a值)；同时设定空白对照(只加缓冲液)、阴性对照(只加缓冲液和酶液)和阳性对照(阿卡波糖)。以上所有样品及空白反应均重复3次，取平均值作为实验数据。
抑制率(％)＝[(a酶-a酶空)-(a样-a样空)]/(a酶-a酶空)×100％
实验结果：化合物叉甲基丁内酯二萜的1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml6个浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为1.07％，3.56％，10.48％，26.76％，49.80％，78.13％。计算ic50为20.47μg/ml，阿卡波糖ic50为318.20μg/ml。
实施例3胶囊剂的制备
取上述实施例1制备得到的叉甲基丁内酯二萜加药用辅料淀粉适量，充分混匀后，装入胶囊，制成胶囊剂口服使用。
实施例4片剂的制备
取上述实施例1制备得到的叉甲基丁内酯二萜，加入乳糖和玉米淀粉，加入适量润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，整粒，然后压片制成片剂。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。