本发明涉及抗菌药技术领域，尤其涉及一种抗菌融合肽。
背景技术：
现有的抗菌肽的来源有三种，天然物中提取、化学方法合成和生物方法合成。
关于化学方法合成：
氨基酸是两性物质，分子中一般含有氨基(-nh2)和羧基(-cooh)，是抗菌肽化学合成的基本原料。研究者通常将不参加缩合反应的氨基(-nh2)、羧基(-cooh)以及带有活泼基团的侧链保护起来，待到所有氨基酸都按照抗菌肽序列偶合完成之后，再进行脱保护反应。
癌症是由于机体异常细胞的过度繁殖增生，从而损害健康、危及生命的疾病。抗癌药物具有抑制癌细胞增长的作用，但抗癌药物通常不能够抑制细菌增长，即不具备抗菌活性。
癌症患者通常身体比正常人虚弱，更容易受到细菌感染。目前的医疗实践当中，对于受到细菌感染的癌症患者（或者有受到细菌感染可能的患者），在使用抗癌药物的同时，需要另外使用抗菌药物。药物的增多对于患者的健康具有负面的影响，如果能够研发出具有抗菌作用的抗癌药，则有望减少患者的用药量，减少用药对于患者健康的负面影响。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于乳腺癌抑制肽brca1(782-786，sisll)的抗菌融合肽。
为实现上述目的，本发明的抗菌融合肽为tat（47-57）氮端连接brca1(782-786)的sisll-tat，其肽链序列为：sisllygrkkrrqrrr。
本发明的目的还在于提供另一种基于乳腺癌抑制肽的抗菌融合肽。
为实现上述目的，本发明的抗菌融合肽的肽序为tat（47-57）碳端连接brca1(782-786)的tat–sisll，其肽链序列为：ygrkkrrqrrrsisll。
本发明的目的还在于提供一种上述抗菌融合肽的制备方法，依次按以下步骤进行：
以wang树脂为载体，fmoc为氨基酸侧链保护基团，哌啶的dmf溶液为脱保护试剂，hbtu、hobt和diea为氨基酸缩合剂，根据目标抗菌融合肽的序列，从碳（c-）端到氮（n-）端将相应的氨基酸进行偶合；直到氮端氨基酸偶合完成后，脱除氮端氨基酸的fmoc保护基团，洗涤后吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割试剂，切割后抽滤，将滤液收集至冰乙醚中，-20℃下静置20小时，使沉淀物完全生成；离心弃去上清液；对沉淀物使用冰乙醚充分洗涤和离心弃去上清液三次以上；剩下的沉淀物经干燥，所得固体粉末进一步用去离子水溶解后，通过反相高效液相色谱（即rp-hplc）分离纯化，收集主峰流出液，并冷冻干燥后获得相应的目标抗菌融合肽。
所述反相高效液相色谱对抗菌融合肽的分离纯化的条件如下：
抗菌融合肽sisll-tat：色谱柱agilentzorbax300sb-c18，色谱柱直径9.4mm，长250mm，填料粒径5μm，色谱柱的温度25℃；检测波长220nm；流速1.0ml·min-1；流动相a相：0.1%tfa（三氟乙酸）的h2o；流动相b相：0.1%tfa的ch3cn（乙腈）；流动相梯度：10%~30%b相/0~20min（从0至20分钟流动相b的含量由10%增至30%）；收集保留时间为12.323min的流出液，冷冻干燥后得到白色粉末状的sisll-tat，产率76%。
抗菌融合肽tat-sisll：色谱柱agilentzorbax300sb-c18，色谱柱直径9.4mm，长250mm，填料粒径5μm，色谱柱的温度25℃；检测波长220nm；流速1.0ml·min-1；流动相a相：0.1%tfa（三氟乙酸）的h2o；流动相b相：0.1%tfa的ch3cn（乙腈）；流动相梯度：10%~30%b相/0~20min（从0至20分钟流动相b的含量由10%增至30%）；收集保留时间为12.223min的流出液，冷冻干燥后得到白色粉末状的tat-sisll，产率73%。
上述抗菌融合肽在药品中的应用。
本发明具有如下的优点：
将抗癌肽与细胞穿膜肽融合在一起，能够使抗癌肽能够更容易进入细胞内部，从而提升抗癌肽的抗癌效果。但正常情况下，这种融合作用并不能使抗菌融合肽产生抗菌作用。本发明在抗癌肽的基础上得到了具有抗菌效果的融合肽，且抗菌融合肽的抗菌效果则接近了强力抗菌药卡那霉素的抗菌作用，为进一步具体研发具有抗癌抗菌双重作用的药物提供了基础，有利于减少癌症患者的用药量。
附图说明
图1是sisll-tat的1hnmr(d2o,400mhz)谱图；
图2是sisll-tat的13cnmr(d2o,100mhz)谱图；
图3是sisll-tat的esi-ms(ch3oh)图；
图4是tat-sisll的1hnmr(d2o,400mhz)谱图；
图5是tat-sisll的13cnmr(d2o,100mhz)谱图；
图6是tat-sisll的esi-ms(ch3oh)图。
具体实施方式
实施例一
如图1至图3所示，本发明提供了一种抗菌融合肽，为tat（47-57）氮端连接brca1(782-786)的sisll-tat，其肽链序列为：sisllygrkkrrqrrr。
实施例二
如图4至图6所示，本发明提供了一种抗菌融合肽，抗菌融合肽的肽序为tat（47-57）碳端连接brca1(782-786)的tat–sisll，其肽链序列为：ygrkkrrqrrrsisll。
本发明还提供了实施例一和实施例二中抗菌融合肽的制备方法，该方法是：
以wang树脂为载体，fmoc为氨基酸侧链保护基团，哌啶的dmf溶液为脱保护试剂，hbtu、hobt和diea为氨基酸缩合剂，根据目标抗菌融合肽的序列，从碳（c-）端到氮（n-）端将相应的氨基酸进行偶合；直到氮端氨基酸偶合完成后，脱除氮端氨基酸的fmoc保护基团，洗涤后吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割试剂，切割后抽滤，将滤液收集至冰乙醚中，-20℃下静置20小时，使沉淀物完全生成；离心弃去上清液；对沉淀物使用冰乙醚充分洗涤和离心弃去上清液三次以上；剩下的沉淀物经干燥，所得固体粉末进一步用去离子水溶解后，通过反相高效液相色谱（即rp-hplc）分离纯化，收集主峰流出液，并冷冻干燥后获得相应的目标抗菌融合肽。
其中，反相高效液相色谱对抗菌融合肽的分离纯化的条件如下：
抗菌融合肽sisll-tat的分离纯化条件：色谱柱agilentzorbax300sb-c18，色谱柱直径9.4mm，长250mm，填料粒径5μm，色谱柱的温度25℃；检测波长220nm；流速1.0ml·min-1；流动相a相：0.1%tfa（三氟乙酸）的h2o；流动相b相：0.1%tfa的ch3cn（乙腈）；流动相梯度：10%~30%b相/0~20min（从0至20分钟流动相b的含量由10%增至30%）；收集保留时间为12.323min的流出液，冷冻干燥后得到白色粉末状的sisll-tat，产率76%；
抗菌融合肽tat-sisll的分离纯化条件：色谱柱agilentzorbax300sb-c18，色谱柱直径9.4mm，长250mm，填料粒径5μm，色谱柱的温度25℃；检测波长220nm；流速1.0ml·min-1；流动相a相：0.1%tfa（三氟乙酸）的h2o；流动相b相：0.1%tfa的ch3cn（乙腈）；流动相梯度：10%~30%b相/0~20min（从0至20分钟流动相b的含量由10%增至30%）；收集保留时间为12.223min的流出液，冷冻干燥后得到白色粉末状的tat-sisll，产率73%。
本发明还提供了实施例一和实施例二中抗菌融合肽在药品中的应用，为制备具有抗癌抗菌双重作用的药物提供了基础，有利于减少癌症患者的用药量。
本发明使用的仪器与试剂的具体情况为：
cp224c电子分析天平(0.0001g)(上海奥豪斯仪器有限公司)；tgl-10b台式高速离心机(上海安亭)；lgj-10冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂)；agilent1260高效液相色谱仪(美国agilent公司)；brukeravance400型核磁共振仪(德国bruker公司)，d2o为溶剂；thermoscientificlcqfleet离子阱质谱仪(美国thermofisherscientific公司)；wrx-4显微熔点仪(上海光学仪器厂)。
fmoc-氨基酸、wang树脂、1-羟基苯并三氮唑(hobt)、苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)和n，n-二异丙基乙胺(diea)购于浙江昂拓生物技术有限公司，哌啶购于国药化学试剂有限公司，n，n-二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、苯酚、甲醇和乙醚购于天津市科密欧化学试剂有限公司，三氟乙酸(tfa)、苯甲硫醚和乙二硫醇购于阿拉丁试剂上海有限公司，其中，乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
制备出的抗菌融合肽sisll-tat的结构表征：m.p.>210℃。1hnmr(400mhz，d2o，ppm)δ：6.99(d，j=8.0hz，2h)，6.70(d，j=8.0hz，2h)，4.37-4.41(m，1h)，4.32(t，j=8.0hz，1h)，4.05-4.21(m，14h)，3.62-3.89(m，6h)，3.03-3.08(m，14h)，2.84(t，j=8.0hz，5h)，2.78(s，1h)，2.22(t，j=8.0hz，2h)，1.45-1.75(m，35h)，1.32-1.37(m，9h)，0.65-0.79(m，18h)。13cnmr(100mhz，d2o，ppm)δ：177.58，175.95，174.44，173.76，173.66，173.38，173.27，173.17，173.10，173.07，172.85，171.86，171.46，167.82，163.39，163.04，162.69，162.33，156.64，154.36，130.37，127.90，120.63，117.73，115.37，114.83，111.93，63.78，60.84，60.18，58.45，55.20，54.23，53.59，53.31，53.10，52.79，52.62，52.53，43.06，40.48，39.49，39.33，39.07，36.28，30.92，30.21，28.16，28.01，27.89，27.05，26.19，24.50，24.38，24.24，24.15，22.17，22.12，21.88，20.64，20.51，14.58，10.22。esi-msm/z(%)：calcdfor[c88h161n37o21]：2072.48，found：729.75(100)[m+3k]3+，692.25(69)[m+3h]3+，519.42(14)[m+4h]4+。
制备出的抗菌融合肽tat-sisll的结构表征：m.p.>210℃。1hnmr(400mhz，d2o，ppm)δ：7.04(d，j=8.0hz，2h)，6.75(d，j=8.0hz，2h)，4.36(q，j=8.0hz，2h)，4.09-4.28(m，14h)，3.66-3.87(m，6h)，3.02-3.06(m，14h)，2.84(t，j=8.0hz，4h)，2.22(t，j=8.0hz，2h)，1.50-1.69(m，41h)，1.28-1.32(m，5h)，0.72-0.78(m，18h)。13cnmr(100mhz，d2o，ppm)δ：177.58，176.52，174.15，173.66，173.54，173.33，173.27，172.86，171.60，171.34，170.55，169.75，163.37，163.02，162.67，162.32，156.63，155.11，130.77，125.31，121.42，120.64，117.74，115.78，114.84，111.94，63.78，60.88，58.43，55.30，54.40，53.50，53.27，53.11，52.76，52.20，51.60，42.04，40.49，39.53，39.32，39.07，36.20，35.92，30.92，30.40，30.29，28.22，28.06，27.08，26.22，26.17，24.45，24.34，24.18，22.15，22.12，20.55，20.45，14.70，10.29。esi-msm/z(%)：calcdfor[c88h161n37o21]：2072.48，found：729.67(43)[m+3k]3+，692.17(100)[m+3h]3+，519.42(17)[m+4h]4+。
抗菌融合肽的抗菌活性和溶血活性实验
实验所用仪器及试剂：
1.仪器
spectramr酶标仪(美国dynex公司)；ldzx-50fb型灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；shp-150型生化培养箱(上海精宏科技仪器有限公司)；biofuge台式高速冷冻离心机(德国heraeus公司)；thz-300c恒温培养摇床(上海一恒科技仪器有限公司)；vs-1300l-u洁净工作台(苏净安泰空气技术有限公司)；ay120精密电子天平(日本shimadzu公司);bk5000生物显微镜(optec);elix系列超纯水系统(法国millipore公司);hd-3紫外检测仪。
2.细菌获取
实验所用菌种革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌(bacillussubtiliskctc3068)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureusatcc29213)；革兰氏阴性菌：鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimuriumcmcc50013)和大肠杆菌(escherichiacoliatcc25922)均由河南省疾病预防控制中心提供。
3.主要试剂
卡那霉素(kanamycin)、四甲基唑氮蓝（mtt）购于sigma公司；蛋白胨、琼脂粉、triton-x100购于华美生物工程公司。
4.溶液的配制：
4mg·ml-1多肽溶液的配制：准确称取0.0200g多肽，用无菌水定容5ml，4℃下避光保存，备用。
磷酸盐缓冲溶液(pbs缓冲溶液,0.01mol·l-1,ph7.4)：称取kh2po40.1200g，k2hpo40.9000g，nacl3.4500g和kcl0.1000g溶于水中，用hcl溶液调ph值至7.4后定容500ml。
mtt溶液：准确称取mtt500mg溶解于100mlph值为7.0的磷酸盐缓冲溶液，无菌微孔滤膜(0.22μm)除菌过滤后，分装，-20℃下避光保存。
lb液体培养基：称取蛋白胨5g，酵母粉2.5g，nacl5g于500ml烧杯中，加入蒸馏水450ml，待溶解后用浓氢氧化钠溶液调节ph至7.2-7.4后定容500ml。0.1mpa，115℃下，湿热灭菌30min，密封，常温保存。
（1）mtt法分析抗菌融合肽对细菌的最低抑菌浓度
采用mtt法测定了多肽的最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentrations,mic)，即sisll-tat,tat-sisll，tat(47-57)，brca1(782-786)和抗菌药物卡那霉素(kanamycin)对菌株微生物生长情况的影响。在无菌条件下挑选菌株到lb液体培养基中，303k、160r·min-1下培养至对数期，用新鲜lb液体培养基稀释为2×104cfu×ml-1的悬浮液。采用二倍系列稀释法在96孔板中分别加入抗菌融合肽无菌水溶液100μl，再加入菌株悬浮液100μl，混匀后，310k下孵育20h。空白对照组为100μl的pbs溶液和100μl的lb液体培养基混合液，阴性对照组为100μl磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)和100μl菌株悬浮液混合液。每个实验重复3组。用酶标仪测定a570nm值来监测细菌的生长情况，通过如下公式计算多肽的抑菌率。完全抑制细菌生长的多肽的最低浓度定义为多肽的最低抑菌浓度。
（2）分光光度法测定抗菌融合肽tat-sisll和sisll-tat对人红细胞溶血活性
进行抗菌融合肽tat-sisll和sisll-tat对人红细胞溶血活性的测定。经郑州大学生命科学伦理委员会批准的议定书同意，健康志愿者签订书面知情同意书后，通过静脉抽取健康志愿者血液20ml流入含肝素钠的抗凝管内，用磷酸盐缓冲溶液（10mm,ph7.4）洗涤、2000rpm转速下离心10min(×5)后，将红细胞制备为2%人红细胞悬浮液。采用二倍系列稀释法在1.5ml离心管中分别加入抗菌融合肽溶液100μl，再加入2%人红细胞悬浮液100μl，混匀后，310k下孵化30min。阴性对照组为磷酸盐缓冲溶液和2%人红细胞悬浮液各100μl的混合液，阳性对照组为1%tritonx-100的生理盐水溶液和2%人红血细胞悬浮液各100μl的混合液。每个实验重复3组。吸取各孔上清液分别移入96孔板中，用酶标仪测定a570nm值，计算溶血率。引起5%溶血的多肽浓度为最小溶血率浓度(minimunhemolyticoncentration,mhc)。
结果与讨论
表一：抗菌融合肽的抗菌活性和溶血活性
（1）抗菌融合肽tat-sisll和sisll-tat的抗菌活性
多肽sisll–tat,tat–sisll，tat(47–57)，brca1(782-786)和抗菌药物卡那霉素的抗菌活性用最低抑菌浓度(mic)值进行评价，如表一所示。由mic值可以看出，brca1(782–786)对实验所用的四种菌株生长的抑制能力很弱。而抗菌融合肽sisll–tat和tat–sisll对菌株生长的抑制能力较好，mic值在10-44µg·ml-1之间。sisll–tat抑制革兰氏阳菌枯草杆菌生长的效果最好，mic值为10.52µg·ml-1，抑制金黄色葡萄球菌生长的mic值为17.27µg·ml-1，抑制大肠杆菌生长的mic值为21.12µg·ml-1，抑制鼠伤寒沙门菌生长的mic值为32.26µg·ml-1。相比之下，tat–sisll的抑菌能力稍微差一点，其抑制枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌生长的mic值分别为12.23µg·ml-1，22.78µg·ml-1，21.42µg·ml-1和43.12µg·ml-1。抗菌融合肽brca1(782-786)连在tat(47–57)氮端比连在tat(47–57)碳端表现出较好的抗菌活性。这可能是由于在细胞穿膜肽tat(47-57)氮端修饰上小分子brca1(782-786)后，tat(47-57)穿透细胞膜的能力并不减弱，并可以携带brca1(782-786)小肽快速透过细胞膜，进入细胞内部，在短时间内可达到良好的抗菌效果。brca1(782-786)连在tat(47-57)的碳端，57位的arg残基连在ser残基上，arg可以提高多肽的穿膜能力，因此这可能会减弱tat(47-57)的穿透细胞膜的能力。
抗菌融合肽sisll-tat和tat-sisll分子中都有+8净电荷，有利于抗菌融合肽与核酸带负电荷的磷酸骨架静电结合；分子中有tyr、leu和ile残基，可增加抗菌融合肽的疏水性，有利于肽与核酸的碱基对之间结合，从而破坏细菌的遗传物质。
（2）抗菌融合肽tat-sisll和sisll-tat对人红细胞溶血活性分析
抗菌融合肽tat-sisll和sisll-tat对人红细胞的溶血性在一定程度上反应了它们对红细胞的毒性。最低溶血浓度(mhc)值用来评价多肽溶血活性的大小，数值越大，溶血活性越弱，表明抗菌融合肽越不易瓦解人红细胞。表一汇总了抗菌融合肽tat-sisll和sisll-tat对人红细胞的溶血性影响。表中数据显示，与抗菌药物卡那霉素相比，tat-sisll和sisll-tat没有溶血活性，表现在mhc值（产生5%溶血的最低肽浓度）均大于250µg·ml-1；tat(47-57)溶血率达到5%时的mhc值大于62.5µg·ml-1；brca1(782–786)测试的溶血率达到5%的mhc值大于250µg·ml-1。结合肽的mic值，抗菌融合肽tat-sisll和sisll-tat在发挥抑菌活性时的浓度均未达到最低溶血浓度，说明抗菌融合肽tat-sisll和sisll-tat安全性比较高，具有成为优异抗菌抗癌肽的潜力。
序列表
<110>河南工程学院
<120>一种抗菌融合肽及其制备方法和应用
<141>2018-05-17
<160>4
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