本发明涉及免疫学、药学及医学相关领域。本发明涉及一种能偶联单个b细胞表位或半抗原用于制备免疫调节肽和抗体的线性23肽及其用途，其由1个th2细胞表位改造而来，23肽分子共价连接单个b细胞表位或半抗原，如dpp4的一个b细胞表位，黄嘌呤氧化酶的一个b细胞表位而构成免疫调节肽，免疫调节肽免疫动物，能产生高滴度的能和含此b细胞表位的蛋白特异结合的抗体，免疫调节肽免疫的动物通过杂交瘤技术或抗体库或单细胞及结合基因工程等技术可制备th2单克隆抗体及单链抗体等各种抗体。免疫调节肽和抗体均显著增强偏向th2的免疫调节，抑制含b细胞表位的蛋白的酶活或其功能，改善相关病症，可用于开发药物治疗th1偏高疾病和开发检测试剂检测含b细胞表位的蛋白或肽。
背景技术：
b细胞表位或半抗原通常分子太小不足以激起充分的免疫反应，需要将其和载体蛋白偶联免疫动物才能产生高滴度的抗体，带有很多抗原表位的载体蛋白有利于刺激辅助性t细胞，进一步诱导b细胞免疫反应，。免疫系统是将肽-蛋白作为一个整体来激起免疫反应的，因而产生的抗体中有针对多肽的，有针对链接剂的，也有针对载体蛋白的，因此通过用b细胞表位或肽半抗原和载体蛋白偶联或融合后免疫生物制备抗体特别是用于杂交瘤技术制备单克隆抗体和用噬菌体抗体库技术等制备单链抗体等基因工程抗体是常用的免疫技术，但是后期产生过多种类抗体使筛选需要的特异抗体变得较为困难，最普遍使用的载体钥孔血蓝蛋白(klh，keyholelimpethemocyanin)比牛血清白蛋白(bsa)有更高的免疫原性，因而是最常被选用的载体蛋白。bsa(bovineserumalbumin)，即牛血清白蛋白，属于最稳定的和可溶的白蛋白，是一种很流行的弱抗原化合物载体蛋白。bsa的不利之处在于在很多实验中，它被当作封闭剂使用，如果多肽-bsa偶联物的抗血清用于这样的检测分析中，通常会出现假阳性，因为这些血清含有抗bsa的抗体。此外，klh和blh免疫后产生的抗体以th1抗体偏多，用于连接b细胞表位或肽半抗原形成的免疫原是不适合用来治疗th1偏高的疾病如1型糖尿病及并发症和相关疾病，动脉粥样硬化，心血管病、老年痴呆、肾脏病，肾炎，类风湿性关节炎，反应性关节炎，多发性硬化，自身免疫性甲状腺炎，接触性皮炎，结节性红斑，习惯性流产等等。因此寻找合适的小分子载体且能产生偏th2抗体的载体分子一直是探究的重要方向。
表位是蛋白质抗原性的基础，蛋白质抗原可通过表位体现其免疫特性，就某一蛋白质而言，它含有多种表位如b细胞表位又称抗原决定簇(antigenicdeterminant，ad)，t辅助细胞(th)表位等等，还有抑制性表位，毒性表位，交叉反应性表位等等。选择合适的表位并且通过合适的方法与其他肽或者蛋白质等连接以及用什么分子内和分子外佐剂及剂型，如何免疫等等才能得到理想的多肽或蛋白疫苗免疫后才产生特异的高效价(或高滴度)抗体是有巨大的挑战性的。小鼠体内th1会产生igg2a亚型抗体，th2型则会产生igg1和igg2b亚型抗体，人体也会产生同样的特异性抗体，th2亚型抗体可以增加th2型细胞因子的产生并能治疗th1偏高疾病，缓解病症，抗体及th2亚型和th1亚型抗体可以用于检测特点目标抗原。
b细胞表位或肽半抗原的确定对多肽疫苗的合成、诊断试剂的制备、单克隆抗体的筛选等研究工作具有重要意义，但是b细胞表位或肽半抗原促使机体产生高滴度抗体的前提是要具有强免疫原性，效价达到8000以上制备单克隆抗体或基因工程抗体的关键。通常为了增加b细胞表位或肽半抗原的免疫原性，通过将b细胞表位或肽半抗原偶联到klh、bsa等蛋白或者构建到大分子的融合蛋白上增加th应答，该方法存在费时，耗钱，制备周期长等许多不利之处。免疫原诱导高的特异的抗体应答，必需包括b细胞表位(或肽半抗原)和th细胞表位，这已经很清楚。如何选择合适的t辅助细胞(th)表位及如何与b细胞表位或肽半抗原连接来显著提高b细胞表位或肽半抗原的免疫原性是一个世界难题，特别是用此免疫原生产制备治疗性疫苗和制备用于治疗疾病的特异亚型的单克隆抗体或基因工程抗体是具有巨大的挑战的。
p277肽是hsp60的437～460位的一段特异性多肽，共24个氨基酸，也是能与效应t细胞反应的抗原决定簇，是在t1dm预防中发挥作用的特异片段。而p2多肽是p277对t1dm起主要作用的th2表位肽，将其改造作为载体肽共价连接b细胞表位或肽半抗原来制备免疫调节肽，再用免疫调节肽制备抗体，将具有重要的价值。
技术实现要素：
发明目的：
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种能偶联单个b细胞表位或半抗原用于制备免疫调节肽和抗体的线性23肽及其用途，其由1个th2细胞表位改造而来。
本发明的目的之二在于提供该23肽的制备技术方案。
本发明涉及一线性23肽，其特征在于该23肽命名为lp1，所示氨基酸序列为：gfeyqdsgtiipaldsltpaned，所述氨基酸序列见seqidno.1。lp1由1个th2细胞表位改造而来，此th2细胞表位来源于人热休克蛋白hsp60上437～460位的1个和糖尿病相关的p277肽，p277肽的n端有1个由13个氨基酸组成的th2表位p2，在其n端连接一段由10个氨基酸残基组成的连接肽，就组成lp1。10个氨基酸残基组成的连接肽的氨基酸序列为：gfeyqdsgti，所述氨基酸序列见seqidno.2，命名为l1，其中含一个来源于人胰岛细胞特异性抗原-胰岛素瘤相关蛋白-2(ia-2)近膜区jm2的一个b细胞表位，其氨基酸序列为：feyqd，命名为ia2(5)，在其n端加氨基酸gly，在c端加4个氨基酸序列的肽sgti，就构成l1。
本发明的目的之三在于提供23肽能和不同b细胞表位共价连接构成免疫调节肽的制备技术。
本发明所述的23肽分子lp1共价连接不同的单个b细胞表位，如dpp4的一个b细胞表位d1和黄嘌呤氧化酶的一个b细胞表位o1，其氨基酸序列分别见seqidno.3和4，构成免疫调节肽，如cpu-pdlp1和cpu-polp1，其氨基酸序列分别见seqidno.5和6，免疫调节肽免疫动物，均能产生高滴度的能和含此b细胞表位的蛋白特异结合的抗体，免疫调节肽免疫的动物通过杂交瘤技术或抗体库和单细胞及结合基因工程等技术可制备th2单克隆抗体及单链抗体等各种抗体。
本发明的目的之四在于提供基于23肽制备的免疫调节肽和抗体均显著增强偏向th2的免疫调节，抑制含b细胞表位的蛋白的酶活或其功能，改善相关病症，可用于开发药物治疗th1偏高疾病和开发检测试剂检测含b细胞表位的蛋白。
本发明的目的之五在于提供23肽分子及其常规偶联蛋白和融合蛋白也可以用于重组微生物和转基因动物或植物及其细胞，使它们作为生产工厂，能够生产含23肽的肽和蛋白免疫原及其融合蛋白、偶联蛋白或串、并联物或聚合物或制作口服疫苗药物及基于上述肽或蛋白生产特异的抗体。
进一步，还包含药学上可接受的载体和佐剂或者药学上可接受的辅料。所述的疫苗与药物活性物质或药物载体制成融合蛋白、偶联蛋白、聚合物、组合物和重组微生物和转基因动物或植物及其细胞的应用。
所述的药学上可接受的药物活性物质，包括但不限于：glp-1、胰岛素、双胍类、磺脲类；其中双胍类包括苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍；磺脲类药物包括列苯脲、米克胰、格列齐特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖适平、美吡达、糖肾平等等。
进一步，药学上可接受的载体，包括但不限于：热休克蛋白hsp60/65、门冬酰胺酶、门冬酰胺酶-ttp、门冬酰胺酶-ttp-cetpc，fc，牛血清白蛋白(bsa)，钥孔血蓝蛋白(klh)，聚乙二醇等。
进一步，所述药学上可接受的辅料：为填充剂、稀释剂、赋形剂、佐剂等。例如包括但不限于：弗氏佐剂、铝佐剂、乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水，甘露醇加lipofundin力保肪宁和各类免疫原或抗原的佐剂等。
所述的辅料为填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水等。
本发明的有益效果在于：
含有本发明23肽的免疫调节肽可以显著改善和23肽连接的b细胞表位或合成半抗原的免疫原性，其没有动物后显著提高抗体特别是th2亚型抗体的量，含有该23肽的免疫调节肽可以用于制备特异的与含b细胞表位或肽半抗原的目标抗原蛋白结合的特异抗体，可以抑制目标蛋白的酶活性或蛋白功能，显著调节cd4+/cd8+和th1/th2平衡失调，由th1偏向th2转移，增加cd4+，减低cd8+t细胞，显著改善疾病的发病症状。含有23肽及其偶联蛋白和融合蛋白及其免疫产生或制备的特异抗体的药物制剂，以及用重组微生物和转基因动物或植物及其细胞，使它们作为生产工厂，生产含23肽的免疫调节肽和其融合蛋白和偶联蛋白、组合物或制作口服疫苗或生产特异抗体及其衍生物和类似物的药物制剂，在预防和治疗cd4+减低和cd8+t细胞增加及th1占优势诱导的疾病风湿病，多发硬化症、糖尿病、肾病、动脉粥样硬化、高血脂、高尿酸、老年痴呆、眼病、足病、心血管等方面及cd8+t细胞增多疾病如1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎等方面具有重要应用价值，免疫调节肽免疫的动物通过杂交瘤技术或抗体库和单细胞及结合基因工程等技术可制备th2单克隆抗体及单链抗体等各种抗体。免疫调节肽和抗体均显著增强偏向th2的免疫调节，抑制含b细胞表位的蛋白的酶活或其功能，改善相关病症，可用于开发药物治疗th1偏高疾病和开发检测试剂检测含b细胞表位的蛋白。23肽具有重要理论价值和广阔应用前景，有重要社会和经济效益。
进一步，当b细胞表位或合成半抗原选择为人二肽基肽酶4(dipeptidylpeptidase4，dpp4)的b细胞d1时，将其与23肽的n端连接形成免疫调节肽cpu-pdlp1，其免疫小鼠后能产生高水平与dpp4特异结合的抗体(属于th2亚型)，抑制酶活或相关蛋白功能，可以用于检测特异抗原，抗体效价大于1∶20000，升高th2类细胞因子，调节th1/th2平衡，升高th2和glp-1量，升高胰岛素量，保护胰岛细胞，降低胰高血糖素、降低血糖，尿酸肌酐，改善氧化应激，增加cd4+，减低cd8+t细胞，能为治疗与dpp4异常、血糖异常、血糖代谢紊乱及th1/th2失衡引起的糖尿病、肾病、动脉粥样硬化、老年痴呆、眼病、足病、心血管等疾病提供新途径；开发防治糖尿病，包括1型糖尿病，2型糖尿病，妊娠期糖尿病等类型糖尿病。含23肽的免疫调节肽cpu-pdlp1可用于制备抗体如通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，其属于th2亚型抗体igg1和igg2b，给药预防和治疗糖尿病模型鼠，控制和降低动物血糖，可以特异性的与dpp4酶结合，升高th2类细胞因子，调节th1/th2平衡，降低dpp4酶活性、降低血清尿酸和肌酐量，增加cd4+，减低cd8+t细胞，保护胰腺和肾脏等组织。抗体测序后通过基因工程等技术可制备多种抗体治疗相关疾病或检测用。
进一步，当b细胞表位或合成半抗原为人黄嘌呤氧化还原酶(xanhtineoxidoreductase，xod)的一个b细胞抗原表位o1时，将其与该23肽的n端连接形成免疫调节肽cpu-polp1，在免疫小鼠后同样能产生特异性的与黄嘌呤氧化酶结合的抗体(属于th2亚型)，升高th2类细胞因子，调节th1/th2平衡，升高胰岛素量，保护胰岛细胞，降低血糖，降低黄嘌呤氧化酶活性，降低尿酸肌酐，增显著增强抗氧化能力。可以开发治疗高尿酸和糖尿病并发症的疫苗和抗体。以含该23肽的免疫调节肽免疫动物，可以用于制备抗体如通过单克隆抗体和基因工程等技术制备th2抗体igg1(小鼠)供治疗cd4+/cd8+和th1/th2平衡失调相关疾病或检测用，增加cd4+，减低cd8+t细胞，提高th2并减低th1类t细胞和抗体，显著改善疾病的发病症状。给药治疗高尿酸模型鼠，不降低动物血糖，可以特异性的与黄嘌呤氧化酶结合，升高th2类细胞因子，调节th1/th2平衡，降低黄嘌呤氧化酶活性、降低血清尿酸和肌酐量，增加尿酸和肌酐排泄，增加cd4+，减低cd8+t细胞，保护肾脏。抗体测序后通过基因工程等技术可制备多种抗体治疗相关疾病或检测用。
进一步，当b细胞表位或合成半抗原选择为人尿酸转运蛋白1(urat1)的一个b细胞抗原表位u1时，将其与该23肽的n端连接形成免疫调节肽cpu-pulp1，在免疫小鼠后能产生特异性的与urat1结合的抗体igg1和igg2b(属于th2亚型)，提高th2并减低th1类t细胞和抗体，升高th2类细胞因子，调节th1/th2平衡，升高胰岛素量，保护胰岛细胞，降低血糖，降低血清尿酸和肌酐，提高抗氧化应激能力，保护胰腺和肾脏。同样免疫生物可以用于制备抗体如通过单克隆抗体和基因工程等技术制备th2抗体igg1(小鼠)供治疗cd4+/cd8+和th1/th2平衡失调相关疾病或检测用，增加cd4+，减低cd8+t细胞，提高th2并减低th1类t细胞和抗体，显著改善疾病的发病症状。抗体测序后通过基因工程等技术可制备多种抗体治疗相关疾病或检测用。
附图说明
为了使本发明目的，技术方案和优点清楚，结合附图对本发明进行进一步详细描述，其中：
图1为含本发明23肽的免疫调节肽免疫c57bl/6j雄鼠后血清产生抗体分别与人dpp4(图1a，lane1：marker；lane2：重组人dpp4全酶；lane3：d41-bsa；lane4：bsa；lane5：l-asp无关蛋白质)和牛黄嘌呤氧化酶片段(图1c，1：marker；lane2：牛黄嘌呤氧化酶片段；lane3：bsa；lane4：l-asp无关蛋白质)和尿酸转运蛋白1(图1c，1：marker；lane2：尿酸转运蛋白1；lane3：bsa；lane4：l-asp无关蛋白质)特异结合的westernblot实验结果图；
图2为含本发明23肽的免疫调节肽免疫正常balb/c小鼠后，获得免疫的脾b淋巴细胞，通过杂交瘤技术制备获得的单克隆抗体cpu-kd4(cpu-pdlp1免疫后制备的单克隆抗体)、cpu-ko1(cpu-pdlp1免疫后制备的单克隆抗体)、cpu-ku1(cpu-plup1免疫后制备的单克隆抗体)分别与人dpp4(图2a，lane1：marker；lane2：重组人dpp4酶；lane3：d41-bsa；lane4：bsa；lane5：l-asp无关蛋白质)和牛黄嘌呤氧化酶片段(图2b，1：marker；lane2：牛黄嘌呤氧化酶片段；lane3：o-bsa；lane4：bsa；lane5：l-asp无关蛋白质)和尿酸转运蛋白1(图2c，1：marker；lane2：u-bsa；lane3：bsa；lane4：l-asp无关蛋白质；lane5：尿酸转运蛋白1)特异结合的westernblot实验结果图；
具体实施方式
实施例1：含t辅助细胞表位(th表位)的23肽lp1的制备。
23肽命名为lp1，所述氨基酸序列见seqidno.1。lp1由1个th2细胞表位改造而来，此th2细胞表位来源于人热休克蛋白hsp60上437～460位的1个p277肽，p277肽的n端有1个由13个氨基酸组成的th2表位p2，在其n端添加一段由10个氨基酸残基组成的连接肽，就组成lp1。10个氨基酸残基组成的连接肽的氨基酸序列见seqidno.2，命名为l1，其中含一个来源于人胰岛细胞特异性抗原-胰岛素瘤相关蛋白-2(ia-2)近膜区jm2的一个b细胞表位，其氨基酸序列为：feyqd，命名为ia2(5)，在其n端加氨基酸gly，在c端加4个氨基酸序列的肽sgti，就构成l1。
实施例2：b细胞表位或合成肽半抗原的制备。
运用多种b细胞抗原表位分析软件以及在线分析工具，以单参数为基础，结合二级结构预测及空间结构特点，分别从一个目标抗原蛋白质(如：人dpp4或人xod或人尿酸转运蛋白1)的100多个表位中选出多个优势b细胞抗原表位或肽半抗原，通过与23肽连接，经过免疫动物实验筛选和再改造及再筛选的过程，获得免疫原性高的b细胞抗原表位或合成肽半抗原。
实施例2-1：制备人二肽基肽酶4(dipeptidylpeptidase4，dpp4)的优势b细胞抗原表位，制备方法是从其100多个表位中选出多个预测优势b细胞抗原表位或肽半抗原，通过与23肽连接形成免疫调节肽，经过免疫动物实验筛选获得免疫原性高的b细胞抗原表位或肽半抗原如d1。d41是dpp4的一段多肽序列88vflenstfde97，共10个氨基酸残基，氨基酸序列见seqidno.3。
实施例2-2：制备人黄嘌呤氧化还原酶(xanhtineoxidoreductase，xod)的b细胞抗原表位，从其100多个表位中选出多个预测优势b细胞抗原表位或肽半抗原b，通过与23肽连接形成免疫调节肽，经过免疫动物实验筛选和再改造及再筛选的过程，获得免疫原性高的b细胞抗原表位或肽半抗原如o1。o1是黄嘌呤氧化还原酶的一段多肽序列1101rlepykkknps1111，共11个氨基酸残基，氨基酸序列见seqidno.4。
实施例2-3；制备人尿酸转运蛋白1(urat1)的b细胞抗原表位，从其100多个表位中选出多个优势b细胞抗原表位或肽半抗原，通过与23肽连接，经过免疫动物实验筛选获得免疫原性高的b细胞抗原表位或肽半抗原如u1。
实施例3：含23肽的免疫调节肽的制备和合成。
将获得的人dpp4、黄嘌呤氧化酶的b细胞表位或合成肽半抗原的c端分别和23的n端共价连接构成免疫调节肽33肽cpu-pdlp1、34肽cpu-polp1、其所示氨基酸序列分别见seqidno.5、seqidno.6。
上述的肽均采用fmoc固相合成法合成，hplc检测纯度＞90％。分析用b细胞表位或合成肽半抗原采用fmoc固相合成法合成，hplc检测纯度＞95％，
实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。所用试剂盒均按照制造产品厂商所建议的条件进行。
实施例4：含本发明23肽的免疫调节肽免疫stz诱导的糖尿病模型鼠和正常balb/c小鼠的的免疫原性和药效学评价。
实施例4-1.stz诱导的糖尿病模型鼠的的建立
采用小剂量连续多次腹腔注射链脲佐菌素(stz)诱导小鼠糖尿病(dm)模型。4周龄雄性c57bl/6j小鼠(购自扬州大学比较医学中心，许可证号：scxr(苏)2014-0004。)用0.1mph4.4柠檬酸盐缓冲液配置stz浓度为7.5mg/ml，按50mg/kg剂量腹腔注射，每日1次，连续注射5次，于造模后第3、7、14天测定血糖值，以空腹血糖连续两次≥11.1mmol/l为成模标准。
实施例4-2.动物免疫实验
实施例4-2-1.造模成功的c57bl/6j小鼠的免疫实验
60只糖尿病模型小鼠随机分成6组，每组10只，分别为：placebo组(溶剂对照组，阴性对照组)、p277、lp1对照组、cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1给药组。给药组药物浓度均为1mg/ml，给药量为100μg/只/次，即100μl药液；阴性对照组：100μl油剂/只/次。药物配置方法按1mg+40mg甘露醇溶于1ml20％lipofundin的比例临时配置油剂在模型成功(以血糖≥11.1mmol/l为准)后第2周开始进行动物免疫。每周给药1次，连续5次，再分别于7、9、11周免疫三次，共计8次。
实施例4-2-2.正常balb/c小鼠的免疫实验
4周龄正常balb/c雌性小鼠(购自扬州大学比较医学中心，许可证号：scxr(苏)2014-0004。)适应性饲养至7周龄，将分装好的免疫调节肽粉末溶于注射用生理盐水中，配成1mg/ml溶液；将上述溶液与免疫佐剂(quickantibody-mouse5w，北京博奥龙)等量混合，置于旋涡混合仪上震荡均匀，用于肌肉注射给药(0.1ml/只)，间隔两周后用同样方法进行第二次免疫，再间隔两周取血测定小鼠血清抗体效价。
实施例4-3.含本发明23肽的免疫调节肽cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1分别免疫c57bl/6j雄鼠和正常balb/c雌性小鼠后血清产生的特异性抗体的elisa和抗体效价检测结果：
包被稀释液(0.05m碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，ph9.6)稀释d41-bsa，配成终浓度为0.5mg/ml的溶液，96孔酶标板中每孔加入0.1ml，4℃包被过夜；弃去包被液，每孔加入5％脱脂奶粉(ph7.4pbs配制)封闭液，4℃满孔封闭过夜；弃去封闭液，每孔加入1∶100(c57bl/6j)或1∶500(balb/c)，5％脱脂奶粉稀释的肽免疫原免疫的小鼠血清0.1ml，37℃孵育1h；弃去血清，每孔用pbst(含0.5％吐温-20的pbs溶液)和蒸馏水间隔洗涤，每次3min，共洗涤6次；洗涤后，每孔加入5％脱脂奶粉稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠igg二抗0.1ml，稀释倍数1∶5000，37℃孵育1h；弃去二抗液，每孔用pbst和蒸馏水间隔洗涤，每次3min，共洗涤6次；洗涤后，每孔加入0.1mltmb显色液，37℃反应30min后，加入2mol/l的h2so40.1ml终止反应；双蒸水调零，酶标仪450nm波长下测定各孔的od值。实验结果如表1所示，小鼠在给予cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1免疫后，血清elisa结果见表1显示，血清中分别产生针对人dpp4或xod或尿酸转运蛋白1的高水平特异性抗体，与对照组比较有显著性差异(p＜0.05)、显著性差异(p＜0.01)或极显著差异(p＜0.001)，效价达到8000到20000，免疫调节肽免疫动物可以用于制备治疗性和检测用多抗、单克隆抗体和需要免疫原免疫才能制备的基因工程抗体。cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1免疫正常balb/c小鼠也产生高水平的特异性抗体，效价与对照组比较有极显著差异(p＜0.001)，
表1免疫调节肽免疫小鼠血清抗体elisa和效价检测结果
pcomparedwithip***，p＜0.001；**，p＜0.01；*p＜0.05；
实施例4-4.含本发明23肽的免疫调节肽分别免疫c57bl/6j雄鼠后血清产生抗体与抗原特异结合的westernblot实验：
血清与人dpp4westernblot实验依据westernblot标准操作规程进行，将dpp4转移到pvdf膜上，转移条件为100v，5h；转移后的pvdf膜至于25ml封闭缓冲液中室温下摇动1h。15mltbst洗3次(5min/次)；然后将pvdf膜浸泡于1∶10稀释的抗原肽免疫小鼠血清中，室温孵育1-2h或4℃过夜，缓慢摇动，15mltbst洗3次(5min/次)。再加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，37℃孵育1h。pbst洗膜3次，每次10min。加入dab显色液进行显色。充分显色后将膜转移至去离子水中终止显色反应。抗原经sds-page电泳后，直接电转化到pvdf膜上，封闭后，以免疫调节肽cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1免疫鼠得到的血清为一抗，羊抗鼠igg为二抗分别对不同抗原4进行免疫吸附，实验结果如图1所示，膜上出现特异性血清和人dpp4(或人黄嘌呤氧化酶或尿酸转运蛋白1)结合的目的条带，而和其他无关蛋白没有结合，可用于检测特异抗原蛋白。
实施例4-5.含本发明23肽的免疫调节肽分别免疫balb/c小鼠后血清抗体亚型的检测：
特异性抗体亚型的测定试剂盒购自酶免生物公司，实验方法按照说明书进行。大致的实验流程如下：1、每孔加入50ul标准品，或者5倍稀释的血清。2、每孔加入100ul酶标二抗，保鲜膜缠绕后37℃孵育60min。3、washsolution满孔洗板5次。4、每孔加入50ul底物a和50ul底物b，轻轻混匀，37℃避光孵育15min。5、每孔加入50ul终止液(2mh2so4)(颜色由蓝变黄)。6、15min内在450nm波长处测定od值。7、以标准品od值为横坐标，浓度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算样品浓度。实验结果如表3所示，结果表明cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1免疫balb/c小鼠后血清中产生的特异性th2型抗体igg1，显著高于lp1和溶剂组，具有统计学差异(p＜0.01)。igg2b也显著升高。肽表位及肽免疫原免疫动物连接不同载体均可以用于制备多抗、单克隆抗体和基因工程抗体，但是治疗th1偏高疾病需要本发明的免疫调节肽，制备的抗体也可用于治疗和检测含表位肽的抗原蛋白。
表3免疫调节肽免疫小鼠后血清抗体亚型的检测结果
pcomparedwithip*p＜0.05，**p＜0.01；#p＜0.05，##p＜0.01；
&p＜0.01，&&p＜0.01
实施例4-6.含本发明23肽的免疫调节肽分别免疫c57bl/6j雄鼠后降血糖实验：
在模型成功(以血糖≥11.1mmol/l为准)后每周给药1次，连续5次，再分别于7、9、11周免疫三次，共计8次。每次免疫前将糖尿病小鼠断尾取血，取血时用血糖监测仪检测小鼠血糖水平。结果如表4所示，实验结果表明，cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1免疫糖尿病小鼠后可显著性降低小鼠血糖，具有统计学差异。可以开发用于治疗糖尿病。
表4免疫调节肽治疗stz诱导的糖尿病小鼠的血糖检测结果
pcomparedwithip**，.p＜0.001；**，p＜0.01；*p＜0.05
实施例4-7.含本发明23肽的免疫调节肽免疫治疗stz诱导的糖尿病c57bl/6j雄鼠模型后产生的血清抑制dpp4酶活性、黄嘌呤氧化酶活性的抑制率检测实验：
cpu-pdlp1免疫血清抑制dpp4酶活性的抑制率检测实验原理为发色底物法。dpp4水解gly-pro-pna，生成pna(黄色)，pna在405nm处有特征性吸收峰，通过酶标仪在405nm处测得吸光度值，来反应酶活性的高低(即各组血清中抗体对dpp4抑制程度的大小)。具体实验步骤为：1.将血清，缓冲液，酶于37摄氏度下分别孵育30分钟；2.按照酶，缓冲液，底物的顺序加入96孔板。总反应体系为100ul，分为空白对照组(0.26mmol/l底物5ul；tris-hcl缓冲液95ul)，阴性对照组(0.5u/ldpp410ul；0.26mmol/l底物5ul；tris-hcl缓冲液85ul)，阳性对照组(0.5u/ldpp410ul；0.26mmol/l底物5ul；5倍稀释的各组血清10ul；tris-hcl缓冲液75ul)，阳性空白组(0.26mmol/l底物5ul；5倍稀释的各组血清10ul；tris-hcl缓冲液85ul)。3.37℃恒温培养箱反应60min，测定405nm处的吸光度。4.比较各组od405的值，或计算抑制率。
抑制率的计算公式如下：抑制率(％)＝(od阴性对照-od空白对照)-(od抑制剂-od抑制剂空白对照)/(od阴性对照-od空白对照)×100％。
cpu-polp1免疫血清抑制黄嘌呤氧化酶活性的抑制率检测实验所用黄嘌呤氧化酶购于上海宝曼生物公司(roche进口分装)。反应体系为：
按表中所示加样，并保持在25℃下进行反应，酶液与血清混合20min后加入反应体系后立即混匀，倒入比色皿中，在294nm波长下测定吸光值，反应1min记录od值。
黄嘌呤氧化酶抑制率的计算根据酶反应活性的定义，在抑制剂存在条件下，酶反应活性表示为acti，在无抑制剂存在时酶反应活性表示为acto，则血清对黄嘌呤氧化酶的相对抑制率(i)可以定义为：
酶抑制率实验结果如表5所示，结果显示d41-ip、d41-4-ip、o-ip、a2-ip组能显著地抑制血清dpp4活性，与溶剂组相比具有显著性差异。
表5免疫调节肽免疫小鼠血清抑制酶活性的抑制率检测结果
pcomparedwithip***，p＜0.001；**，p＜0.01；*p＜0.05
实施例4-8.含本发明23肽的免疫调节肽分别免疫治疗stz诱导的糖尿病c57bl/6j雄鼠模型后血清尿酸、肌酐和抗氧化应激指标的检测；
小鼠血清尿酸、肌酐和抗氧化应激的检测试剂由建成公司提供，按照试剂盒说明进行检测和计算。实验结果如表6和7所示，结果表明cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1免疫小鼠后，血清肌酐和尿酸和水平显著下降，与溶剂组和ip相比具有显著性差异。抗氧化作用显著增强，具有统计学差异。故可以缓解糖尿病并发症，保护肾脏。
表6.肽免疫stz糖尿病模型小鼠后血清尿酸、肌酐的检测结果
pcomparedwithip*p＜0.05，**p＜0.01；#p＜0.05，##p＜0.01；
表7.免疫调节肽免疫stz糖尿病模型小鼠后血清氧化应激指标的检测结果
pcomparedwithia(5)-p2-1**p＜0.01*p＜0.05
@p＜0.05#p＜0.05&p＜0.05
实施例4-9.含本发明23肽的免疫调节肽分别免疫balb/c小鼠，通过单克隆抗体杂交瘤技术制备单克隆抗体的应用：：
用cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1分别免疫blbc/c小鼠，免疫方法见实施例4-2-2.2周后检测效价(检测方法见实施例4-3.)分别达1∶20000(cpu-pdlp1)，1∶10000-12000(cpu-polp1)，1∶12000(cpu-pulp1)。然后按照常规杂交瘤技术制备单克隆抗体。
杂交瘤技术制备单克隆抗体，细胞融合过程：(1)选取状态良好的sp2/0细胞，离心机设置转速1000rpm时间5min，离心，弃上清，用不完全培养液重悬，计数，用不完全培养基洗涤后，取所需的细胞数备用。(2)balb/c小鼠处死后，制备脾细胞悬液，根据sp2/0细胞密度选取合适数量的脾细胞。(3)将sp2/0细胞与脾细胞按1∶5的比例混合，加入至50ml离心管中，离心机设置转速1200rpm时间8min，离心。(4)将培养基倒掉，不要有残留的培养基，防止融合时peg浓度受到影响。(5)用手轻轻震荡离心管底部细胞沉淀处，使细胞沉淀略变疏松。(6)30s内加入1ml37℃预热的peg溶液，滴加时均匀转动离心管，使细胞与peg充分接触，摇30s。90s内加入预热的培养基，终止融合作用，分三个阶段，前30s加3ml，中间30s加10ml，最后30s加17ml，静置2min，培养8min。(7)设置离心机转速1000rpm时间6min，离心。(8)保留细胞沉淀，用适量hat培养基轻轻重悬，不能用移液枪用力吹打，防止融合的细胞散开。(9)根据饲养细胞铺板的情况，补加hat培养基，达到所需要的体积。(10)铺板，100μl/孔，培养箱中静置培养，尽量减少晃动。(11)观察细胞状态，融合后第4天，hat半量换液，第8天ht半量换液，第12天ht全量换液，第16天用完全dmem培养基培养。
杂交瘤细胞筛选与克隆，将上述方法筛选到的阳性克隆孔采用有限稀释法，进行3次亚克隆，获得可分泌抗xod的b细胞表位单抗的杂交瘤细胞株。有限稀释法如下：(1)用前面同样的方法制备饲养细胞悬液并铺板；(2)选取长势良好的杂交瘤细胞，计数，控制细胞数范围为1-5×103/ml；(3)取一定体积的细胞悬液，细胞用完全培养基稀释至10个/ml，即每毫升1个细胞；(4)每孔100μl细胞悬液加入到96孔培养板中；(4)培养4-5d，出现细胞克隆后，200μl/孔补加培养基；(5)培养8-9d时，有明显的细胞克隆时进行细胞上清抗体检测，重复检测1-2次；(6)选择单克隆生长的阳性孔，转移至24孔板中扩大培养。
抗体腹水的收集。将8-10周龄balb/c小鼠进行预处理，腹腔注射液体石蜡，500μl/只；7天后注射杂交瘤细胞，5×106个/只；7-10天时观察小鼠腹腔膨胀情况，采集腹水，先用手指触及小鼠腹部，使小鼠腹面朝下，触之有波动感的即为腹水较多处，腹部用酒精棉球消毒后以针刺入最底方，进针不要太深，针口刚进入完即可，2-3天后可再次进行采集。最后一次抽取腹水可以采取将小鼠脱颈椎处死后抽取，将小鼠腹部朝上用酒精棉消毒腹部毛发后，用镊子将下腹皮肤提起，剪开1cm左右的小口，用镊子撕开上层皮肤，腹部暴露，保持腹膜完整。在腹侧较低点进针，针孔面朝下，抽取腹水，然后用针头挑起腹膜再抽取腹水以防止腹腔脏器将针孔堵住。采集腹水，离心机设置转速5000rpm时间15min，离心，收集上清腹水并于-70℃冷冻保存，备用，一只小鼠可收集2-3次腹水。
抗体制备与纯化过程.(1)辛酸-硫酸铵沉淀法初步纯化，腹水中常含有较多杂质(红细胞、破碎细胞残留物、纤维蛋白凝块等)。一般先低速离心将杂质细胞除掉，再高速离心将破碎细胞残留物等除掉，过0.22μm滤膜去掉纤维蛋白凝块等。腹水去除杂质后用辛酸-硫酸铵沉淀法初步提取抗体，elisa检测抗体效价。
实施例4-10.elisa检测肽cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1分别免疫balb/c小鼠后通过单克隆抗体杂交瘤技术制备的单克隆抗体的效价：
单克隆抗体抗体的效价检测方法同上，结果如表8显示：cpu-pdlp1、免疫balb/c小鼠后通过单克隆抗体杂交瘤技术制备的单克隆抗体抗体的效价cpu-kd4为1∶32000，cpu-polp1免疫balb/c小鼠后通过单克隆抗体杂交瘤技术制备的单克隆抗体抗体的效价cpu-ko1为1∶32000，cpu-pulp1免疫balb/c小鼠后通过单克隆抗体杂交瘤技术制备的单克隆抗体抗体的效价cpu-ku1为1∶32000。
表8免疫调节肽免疫小鼠后制备的单克隆抗体的效价检测结果
实施例4-11.单克隆抗体与抗原特异结合的westernblot实验：
获得的能分泌抗体的杂交瘤细胞，保存在武汉大学，株号见表7.。用westernblot实验检测抗体的特异性，检测方法见实施例4-4。结果见图2显示：用杂交瘤细胞制备的单克隆抗体cpu-kd4能和dpp4特异结合，用杂交瘤细胞制备的单克隆抗体cpu-ko1能和黄嘌呤氧化酶特异结合，用杂交瘤细胞制备的单克隆抗体cpu-ku1能和尿酸转运蛋白1特异结合。抗体可以用于开发检测试剂。
实施例4-12.单克隆抗体亚型的检测实验：
购买酶免公司试剂盒，检测方法同实施例4-5。检测结果见表9显示抗体为igg1，在小鼠为th2抗体。
表9含23肽的免疫调节肽免疫小鼠后制备的单克隆抗体亚型检测结果
实施例4-13.单克隆抗体降血糖实验：
用stz诱导c57bl/6j雄鼠糖尿病模型(方法见实施例4-1)和nod小鼠1型糖尿病模型(15周龄)，单克隆抗体cpu-kd4静脉给药500ug/只小鼠，每周静脉给药1次。溶剂组为pbs缓冲液，每周用血糖试纸检测血糖。
血糖监测结果如表10显示：500ug/只给药cpu-kd4，能显著降低血糖，有极显著差异，有统计学意义(***，p＜0.001)。说明此单克隆抗体可以用于治疗糖尿病。
表10.含23肽的免疫调节肽免疫小鼠后制备的单克隆抗体治疗stz诱导的糖尿病小鼠和nod小鼠1型糖尿病模型的血糖检测结果
pcomparedwithia(5)-p2-1***，p＜0.001；**，p＜0.01；*p＜0.05
#p＜0.05&p＜0.05
实施例4-14.单克隆抗体降尿酸实验：
用250mg/kg氧嗪酸钾每周皮下诱导6周龄昆明鼠高尿酸模型，单克隆抗体cpu-ko1，cpu-ku1静脉给药300ug/只小鼠，每周静脉给药1次。溶剂组为pbs缓冲液，每周用南京建成提供尿酸试剂盒检测尿酸。
尿酸监测结果如表11显示：300ug/只给药cpu-ko1，cpu-ku1，能显著降低尿酸，有显著差异，有统计学意义(**，p＜0.01)。说明此单克隆抗体cpu-ko1和cpu-ku1可以用于治疗高尿酸血症和并发症。
表11.含23肽的免疫调节肽免疫小鼠后制备的单克隆抗体治疗氧嗪酸钾诱导的高尿酸小鼠的尿酸检测结果
pcomparedwithia(5)-p2-1***，p＜0.001；**，p＜0.01；*p＜0.05
实施例4-15.单克隆抗体分别抑制dpp4酶活性、黄嘌呤氧化酶活性活性的抑制率检测实验：
单克隆抗体抑制dpp4酶活性、黄嘌呤氧化酶活性实验方法见实施例4-7：
酶抑制率实验结果如表12所示，结果显示cpu-kd4组能显著地抑制dpp4活性，cpu-ko1显著地抑制黄嘌呤氧化酶活性，与溶剂组相比具有显著性差异。可以通过抑制酶治疗相关疾病。
表12含23肽的免疫调节肽免疫小鼠后制备的单克隆抗体抑制酶活性的抑制率检测结果
pcomparedwithip***，p＜0.001；**，p＜0.01；*p＜0.05
用cpu-pdlp1、cpu-polp1、cpu-pulp1等肽免疫blbc/c小鼠或免疫五特征小鼠2次，最后一次免疫2周后检测效价在8000-20000，取脾脏细胞，提取基因组或总rna，按照单克隆抗体技术或噬菌体抗体库技术方法或其他需要免疫原免疫制备抗体的方法，可以制备各种单克隆抗体或基因工程抗体包括人源化单链抗体，fab抗体或大分子抗体等。送公司测定上述抗体的可变区序列，用相关软件分析获得3对cdr区，可以在此基础上制备小分子抗体，供防治与肽表位相关的疾病和并发症和开发检测试剂用。
结论：本发明23肽和目标抗原蛋白如人dpp-4或黄嘌呤氧化酶或尿酸转运蛋白1的b细胞抗原表位或半抗原肽连接可以诱导特异地靶向目标抗原蛋白及其b细胞表位或半抗原肽的th2抗体(小鼠体内th2型则会产生igg1亚型抗体，人类体内特异亚型抗体)。当b细胞抗原表位或半抗原肽和本发明的常用载体bsa或klh连接时，免疫生物产生高价特异抗体，可以制备抗体或th1和th2单克隆抗体和各类基因工程抗体；当b细胞抗原表位或半抗原肽和本发明的23肽连接时，免疫生物可以产生高价特异抗体，可以制备抗体或th2单克隆抗体和各类基因工程抗体，th2亚型抗体可以增加th2类细胞因子的产生并控制th1偏高疾病，缓解症状)，并产生较高水平的能和目标抗原特异性结合的抗体，抑制酶活或相关蛋白功能，免疫调节肽可以显著降低血糖，基于免疫调节肽制备的单克隆抗体也能显著降低血糖，如含dpp4的b细胞抗原表位的免疫调节肽原免疫动物后效价达到1∶20000，可以用于制备抗dpp4的特异抗体，制备的抗体也抑制dpp4活性，能显著降低血糖，调节代谢，可以开发防治和检测试剂；此外，如含黄嘌呤氧化酶的b细胞抗原表位的免疫调节肽免疫动物后效价达到1∶10000，抑制黄嘌呤氧化酶活性，也可以用于制备抗黄嘌呤氧化酶的特异抗体，制备的抗体也抑制黄嘌呤氧化酶活性且能显著降低尿酸；在此肽免疫原基础上制备的特异抗体能和目标抗原结合，也可以开发检测试剂使用。如含尿酸转运蛋白1的b细胞抗原表位或其改造表位肽的肽免疫原免疫动物后效价达到1∶12000左右，也可以用于制备抗尿酸转运蛋白1的特异th2抗体，制备的th2抗体能显著降低尿酸和抗氧化应激。可以开发治疗和检测用试剂，上述实例说明，本发明的23肽及含此23肽的免疫调节肽在医药和免疫学的有重要和广泛用途。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的某些优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。