本发明属于肿瘤治疗、分子免疫学领域，涉及一种抑制pd-1/pd-l1信号通路的结合分子，具体涉及一种特异性结合pd-1的单克隆抗体。
背景技术：
：双信号理论是调控免疫反应的重要理论。t细胞的激活除了依靠t细胞受体刺激信号以外还需要通过cd28受体家族提供的第二信号来促进或者下调t细胞反应。cd28受体家族包括：cd28，ctla-4，icos，pd-1，和btla等分子。其中cd28和icos这两种受体是用来传递共刺激信号来激活免疫反应，ctla-4，pd-1和btla分子用来传递共抑制信号来抑制免疫反应。pd-1(programmedcelldeath1)程序性死亡受体1，cd279，在活化的t细胞而不是静息状态下的t细胞中表达。pd-1分子有两个配体：pd-l1和pd-l2。在其和配体结合时能够给t细胞传递抑制信号，从而抑制细胞的增殖并减少细胞因子的分泌例如il-2和ifnγ等。pd-l1分子能够与t细胞表面的pd-1分子或者b7-1(cd80)分子结合并抑制t细胞的激活。从而抑制免疫反应，进而促进肿瘤细胞的逃逸。pd-1/pd-l1抑制剂可以封闭pd-1/pd-l1信号传导通路，已成为肿瘤免疫治疗的一个重要策略。pd-1/pd-l1抑制剂主要包括抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体。国外很多大公司正在角逐抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体，目前国外已上市的抗pd-1抗体药物是百时美施宝贵的nivolumab、默沙东的keytruda。但是由于进口大分子药物对于病人来说需要花费高昂的费用，因此，研发新的抗pd-l1单克隆抗体，减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种针对pd-1的结合分子，该结合分子对pd-1蛋白具有显著的亲和作用。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明提供了一种分离的结合分子，所述结合分子包括：(1)seqidno:1所示的重链cdr1、seqidno:2所示的重链cdr2、seqidno:3所示的重链cdr3；和/或(2)seqidno:4所示的轻链cdr1、seqidno:5所示的轻链cdr2、seqidno:6所示的轻链cdr3。作为本发明的一个方面，本发明的结合分子包括：(1)重链可变区，所述重链可变区具有seqidno:7所示的氨基酸序列；和/或(2)轻链可变区，所述轻链可变区具有seqidno:8所示的氨基酸序列。本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，还可以是抗原结合片段，包括但不限于fab、f(ab’)、f(ab’)2、fv、dab、fd、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与pd-1结合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。本发明的结合分子也可以特异性结合pd-1蛋白的一个或多个片段。作为本发明的另一方面，本发明的结合分子还包括前面所述的结合分子的功能变体。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合pd-1或其蛋白片段，则认为该变体分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合pd-1蛋白或其蛋白片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酰化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机pcr介导的诱变，并且可包含天然以及非天然氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。此外，功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合pd-1蛋白或其片段。所述功能变体还包含对高变区的修饰，高变区包含来自cdr的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如gap或者bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错pcr、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。本发明的功能变体对于pd-1具有亲和活性。所述亲和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，当使用术语“结合分子”时，其也涵盖所述结合分子的功能变体。本发明还提供了前面所述的结合分子的核酸分子。本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。一旦获得了有关的序列信息，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合分子(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合分子的序列中。本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的表达载体，除了前面所述的核酸分子之外，表达载体还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。这些表达载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho,cos,293细胞、或bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是293细胞。用重组dna转化、转染宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。一些采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，以表达本发明的结合分子。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。本发明的结合分子优选的是采用哺乳动物细胞来生产，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养。需要对细胞进行无血清的适应过程后，方可让细胞在无血清培养基中正常的生长。本发明还提供了一种包括前面所述的结合分子的药物组合物。进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。本发明还提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文所述至少一个结合分子以及进一步包含至少一个标记物可检测的部分/物质的分子。本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否己经患有pd-1过表达诱导的疾病或者作为临床实验程序的一部分监测pd-1过表达诱导的疾病的发生或进展以例如确定指定治疗方案的功效。然而，它们也可以用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记结合分子的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。除了通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物之外，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的结合分子及合适的标记。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码结合分子的核苷酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。本发明还提供了一种包含前面所述的结合分子或前面所述的免疫缀合物的检测产品。所述检测产品可以检测pd-1蛋白的表达。进一步，所述检测产品或所述诊断产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述结合分子的能够检测出pd-1蛋白表达水平的检测产品或诊断产品均包括在本发明的范围之内。本发明还提供了一种非诊断目的的检测pd-1蛋白水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取含有pd-1的样品；(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的结合分子接触；(3)检测样品与结合分子的免疫反应。本发明还提供给了一种利用前面所述的宿主细胞产生本发明的结合分子的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的宿主细胞并回收所述结合分子。本发明还提供了一种通过上述方法产生的结合分子。所述结合分子是抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了前面所述的结合分子在制备检测产品中的应用；所述检测产品是检测pd-1蛋白的产品。所述检测产品或诊断产品包括前面所述的结合分子；所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括前面所述的结合分子能够检测出pd-1蛋白表达水平的检测产品或诊断产品均包括在本发明的范围之内。本发明还提供了前面所述的结合分子在制备治疗免疫障碍的药物中的应用。可通过给受试者施用pd-1特异性抗体来治疗的免疫障碍的非限定性实例包括但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、克罗恩病、全身性红斑狼疮、i型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、过度增生性免疫障碍、肿瘤和感染性疾病。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗的肿瘤种类没有特别限制，任何实体的、非实体的、恶性的或良性的肿瘤均包括在本发明的范围之内。肿瘤的实例包括但不限于：皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经系统肿瘤，宫颈癌，肠癌，肛门癌，子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾癌，喉癌，唇癌，口腔癌，口咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，阴茎癌，嗜络细胞瘤，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，阴道癌，外阴癌。本发明的公开的抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。本发明的抗体可以被设计为在fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。本发明的抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(peg)集团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与peg反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的peg分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。本发明的结合分子可以单独应用或者于包含本发明的结合分子的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。本发明的结合分子还可以与其他具有相同或者互补功能的药物联合应用，联合应用的效果可以是结合分子与其他药物功能之和，还可以远远大于结合分子与其他药物功能之和，这种情况表明该结合分子与其他药物之间产生了协同作用。可以和本发明的结合分子联合应用的药物包括抗肿瘤药，所述的抗肿瘤药物包括目前经过fda批准的所有抗肿瘤药。所述的抗肿瘤药包括经fda批准的药物或未批准的药物。所述的抗肿瘤药包括已知靶向抗肿瘤药与未知靶向抗肿瘤药。所述的抗肿瘤药还包括任意的化疗药或化合物。靶向抗肿瘤药包括(但不限于)17-aag、2-deoxyglucose、阿比特龙(abiraterone)、abt-263、ac-220、at-406、azd4547、azd5363、azd7762、bi-2536、birinapant、bms-754807、硼替佐米(bortezomib)、bx-795、卡博替尼(cabozantinib)、cal-101、卡非佐米(carfilzomib)、克唑替尼(crizotinib)、danusertib、达沙替尼(dasatinib)、dovitinib、elesclomol、embelin、恩替诺特(entinostat)(ms-275)、enzastaurin、依维莫司(everolimus)、foretinib、氟维司群(fulvestrant)、ganetespib、gdc0941、gsk429286a、jq1、ku-55933、kx2-391、lenvatinib、linifanib、linsitinib、ly2157299、masitinib、mk-1775、mk-2206、mln-4924、neratinib、nu7441、nutlin-3、nvp-bez235、nvp-bkm120、orantinib、pci-32765、pd-0325901、pd-0332991、pd-173074、ph-797804、prt062607、r-406、refametinib、瑞戈非尼(regorafenib)、sch900776、sgi-1776、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、tae684、替西莫司(temsirolimus)、tg-101348、tideglusib、tipifarnib、tivantinib、toremifene、tozasertib、曲美替尼(trametinib)、维甲酸(tretinoin)、triptolide、伐地考昔(valdecoxib)、维莫德吉(vismodegib)、volasertib、伏立诺他(vorinostat)、ym-155、chir-99021、nvp-bgj398、ly2090314。所述的化疗药包括(但不限于)六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体获得的抗体，除少数可能存在的天然发生的突变外，该群体中包含的单个抗体是相同的。修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与依赖于抗体的细胞毒性。如本文中所用，“pd-1”和“pd-1蛋白”可互换地使用。如本文所用，术语“载体”是指表达载体和非表达载体，并包括病毒和非病毒载体，其包括染色体外载体(如，多拷贝质粒)和整合载体(其设计为可并入宿主染色体)。本文所述的“样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖了得自任何物种的各种临床样品，也包括培养的细胞、细胞上清和细胞溶解产物。如本文所用，术语“分离的”是指从其天然环境中分离出的蛋白质(即，从至少一种其天然伴随的其它组分中分离)。本发明的优点和有益效果：本发明制备了一种新的高效价、高特异性及高亲和力的抗pd-1的单克隆抗体。由于该抗体效价高、特异性好、亲和力强，可直接作为抗pd-1类药物用于预防和治疗免疫障碍。附图说明图1显示pcdnatm5/frt的物理图谱；图2显示利用琼脂糖电泳检测pcr产物和酶切产物的电泳图，其中：a：kappa-bghpolya片段pcr产物，泳道1代表dl2000，泳道2代表pcr产物，b：kappa-bghpolya片段xbai，bamhi酶切，泳道1代表dl2000，泳道2代表酶切片段，c：pcmv/t7片段pcr产物，泳道1代表dl2000，泳道2代表pcr产物，d：pcmv/t7片段bamhi，noti酶切，泳道1代表dl2000，泳道2代表酶切片段，e：重链恒定区片段pcr产物，泳道1代表dl2000，泳道2代表pcr产物，f：重链恒定区片段noti，pmei酶切，泳道1代表dl2000，泳道2代表酶切产物。图3显示利用显示利用琼脂糖电泳检测构建载体的酶切产物电泳图，其中泳道1代表dl2000，泳道2代表ecori酶切片段，泳道3代表hindiii酶切片段，泳道4代表bsiwl酶切片段，泳道5代表clai酶切片段，泳道6代表nhei酶切片段，泳道7代表xbai酶切片段，泳道8代表bamhi+noti酶切片段，泳道9代表noti+pmei酶切片段；图4显示prt/kiggl载体的结构示意图；图5显示利用双夹心elisa检测抗体表达量的统计图；图6显示利用间接elisa检测抗体结合能力的曲线图；图7显示利用间接elisa检测抗体结合特异性的统计图；图8显示利用biacore检测抗体亲和能力的曲线图；图9显示利用elisa检测抗体竞争结合抗原的结合曲线图；图10显示利用elisa检测抗体对t细胞ifn-γ表达的影响的统计图；图11显示利用elisa检测抗体对cd4+t细胞ifn-γ表达的影响的统计图。具体实施方式下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1抗pd-1抗体制备1、prt/kigg1全长抗体表达载体构建构建全长抗体表达载体需要在pcdnatm5/frt载体骨架(图1)的基础上依次引入轻链可变区克隆位点、ck基因、bghpolya、pcmv/t7启动子基因序列、抗体重链可变区克隆位点、抗体重链恒定区基因等。采用overlappcr、定点克隆等分子生物学手段构建全长抗体表达载体，所用引物如下：kappa-bghpolya基因序列引物p-kappa-ty：5’-cctctagagaattcaagctttagcgtacggtggctgcaccatc-3’kappa-bgh3：5’-gtcgaggctgatcagcggctaacactctcccctgttg-3’kappa-bgh5：5’-caacaggggagagtgttagccgctgatcagcctcgac-3’kappa3：5’-ccggatccacattccacaggggccatcc-3’pcmv/t7基因序列引物pcmv/t7-up:5’-ggggatcctagttattaatagtaatcaa-3’pcmv/t7-down:5’-gcggccgcttgggtctccctatagtgag-3’heavy链恒定区基因引物：p-igg1h-ty：5’-atcggcggccgcgaattcatcgattaggctagcaccaagggcccatc-3’heavy-3：5’-gtttaaactcatttacccggagacagggagaggctcttctgcgtgta-3’。借助overlappcr将轻链可变区克隆位点(酶a、酶b)、kappa链恒定区、bghpolya序列进行拼接，获得大小为650bp目标片段，并构建t载体，酶切测序正确(图2a，b)，通过xbai，bamhi酶切位点克隆入pcdnatm5/frt载体。在此基础上，通过bamhi，noti酶切位点，将测序正确的pcmv/t7启动子基因序列(图2c，d)克隆入载体中。pcr拼接重链可变区克隆位点(酶c，酶d)，iggl重链恒定区基因序列(ch1，ch2，ch3获得大小约1000bp的目标片段，克隆t载体，测序正确(图2e，f)，并通过noti，pmei酶切位点定向克隆入前述载体中。根据载体构建过程，以及载体自身的酶切位点特征，选择ecori，hiniii，bsiwi，c1ai，nhei，xbai对目标载体进行酶切鉴定(图3)。理论上，该载体中一共含有3个ecori酶切位点，ecori单酶切将载体切成三条线性片段，结果与预期相符；hiniii，bsiwi，c1ai，nhei，xbai均为载体中单一酶切位点，将载体切成单一的线性片段，结果与预期相符。进一步分别用酶bamhi+noti以及noti+pmei进行酶切(图3泳道8,9)，分别获得载体大片段与pcmv/t7(约650bp)以及heavy表达盒(约1000bp)小片段，与预期一致。上述结果表明，目标载体构建成功，命名为prt/kiggl，其结构示意图见图4。理论而言，该载体适用于各种全长抗体的表达。2、抗pd-1抗体表达量测定(1)利用基因合成的方法合成抗体重链可变区序列(序列如seqidno.7所示)、轻链可变区序列(序列如seqidno.8所示)，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入prt/kiggl中。(2)瞬时转染将处于对数生长期的293t细胞以5*105个/孔密度接种于6孔板中，12h后弃换新鲜培养基。4μg抗体表达质粒加入250μlmem培养基中，充分混匀后往里加8μllipofectaminetm2000脂质体，混匀室温放置20min，将混合物加入对应的6孔板中，培养48h后收获上清，同时以prt/kiggl-mil75载体(mil75的重链可变区序列为：qvqlvesgggvvqpgrslrldckasgitfsnsgmhwvrqapgkglewvaviwydgskryyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycatnddywgqgtlvtvss；轻链可变区序列为：eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik)作为对照。(3)双夹心elisa测定瞬时表达上清中抗体表达量用包被液稀释gah-igg抗体至2μg/ml，100μl每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μl，湿盒37℃封闭lh。1xpbs稀释herceptin至0.5μg/ml，在此基础上进行2倍稀释获得8个浓度梯度，同时用1xpbs稀释瞬时表达上清至625倍、3125倍、15625倍。将herceptin与瞬时表达上清按照100μl/每孔加入酶联板中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人酶标二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μltmb底物显色，反应3min并用100μl2nh2so4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以标准品浓度ln值为横坐标，相应的od值为纵坐标，绘制一条标准曲线并添加线性回归曲线及其相关系数r2(r2>0.95)，并用y＝kx+b直线方程计算样品中抗体浓度。(4)结果结果如图5所示，利用上述方法能够表达出抗pd-1抗体。实施例2抗pd-1抗体结合能力测定1、抗体大量表达与纯化鉴定将抗体表达质粒按照以上的转染方法大量转染293t细胞并利用proteina纯化获得抗体的纯化样品。2、间接elisa检测抗体抗原结合能力2.1步骤包被液稀释pd-1/fc抗原至1μg/ml，100μl每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μl，湿盒37℃封闭1h。用1xpbs稀释抗体至3μg/ml，并以100μl每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(fab')2-hrp二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μltmb底物显色，反应3min并用100μl2nh2so4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体浓度为横坐标，od值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。利graphpad分析软件拟合四参数方程曲线，方程为y＝(a-d)/(1+(x/c)^b)+d，其中b代表斜率，c代表ec50。2.2结果结果如图6所示，本发明制备的抗pd-1抗体结合活性与mil75相近，能够特异性识别固相载体上的pd-1抗原分子，且随着抗体浓度的增加抗原一抗体之间结合具有良好的剂量依赖性。3、抗体结合抗原特异性检测3.1步骤包被液稀释pd-1/fc，cd28/fc，ctla4/fc，btla/fc，icos/fc抗原至1μg/ml，100μl每孔加入酶联板中，以平行孔作为复孔。置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μl，湿盒中37℃封闭1h。用1xpbs稀释抗体至1μg/ml，并以100μl每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(fab')a-hrp二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μltmb底物显色，反应5min并用100μl2nh2so4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体名称为横坐标，od值为纵坐标绘制柱形图。3.2结果结果如图7所示，本发明制备的抗pd-1抗体只特异性识别pd-1分子，而与其他分子不存在交叉识别现象。4、抗pd-1抗体亲和力测定4.1步骤将抗人fab抗体偶联到cm5芯片上，将抗体样品稀释到1-2μg/ml并以30ml/min流速进样60-150秒。将pd-1/fc融合蛋白进行梯度稀释至浓度为3.125，6.25，12.5，25，50，100nm并以30μl/min流速进样抗原结合120秒，解离1200s。实验结束后用10mmglycine-hclph2.1进行再生60秒。利用biacoret200分析软件分析结果。4.2结果结果如表1所示，本发明制备的抗pd-1抗体与mil75的亲和力相当，图8是抗体的亲和力动力学曲线(选择3.125nm、6.25nm、12.5nm、25nm、50nm五个浓度进行拟合)。表1抗体亲和力测定结果ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)mil755.594e+57.900e-51.412e-10本发明制备抗体2.733e+52.251e-48.237e-10实施例3抗pd-1抗体阻断pd-1/pd-l1作用1、elisa检测pd-l1/fc-biotin与pd-1结合活性1.1步骤包被液稀释pd-1/fc抗原至1μg/ml，100μl每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μl，湿盒37℃封闭1h。用1xpbs稀释pd-l1/fc-biotin至48μg/ml，进行3倍稀释共获得12个浓度点。以100μl每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入peroxidase-labeledstreptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μltmb底物显色，反应3min并用100μl2nh2so4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以pd-l1/fc-biotin浓度为横坐标，od值为纵坐标绘制pd-1/pd-l1结合曲线，选取pd-l1结合pd-1最低饱和浓度进行抗体阻断实验。1.2结果摸索出pd-l1/fc-biotin参与结合固相抗原pd-1分子最低饱和浓度为5μg/ml。2、抗体阻断pd-1/pd-l1相互作用2.1步骤包被液稀释pd-1/fc抗原至1μg/ml，100μl每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μl，湿盒37℃封闭lh。用1xpbs稀释pd-l1/fc-biotin至5μg/ml，以上述溶液作为稀释液稀释抗体至抗体浓度500μg/ml，并进行5倍稀释共获得12个浓度梯度。100μl每孔加入酶联板中湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入peroxidase-labeledstreptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μltmb底物显色，反应3min并用100μl2nh2so4终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以抗体浓度为横坐标，od值为纵坐标绘制结合曲线。2.2结果结果如图9所示，结果表明本发明制备的抗体可以有效阻断pd-1/pd-l1相互作用。实施例4抗pd-1抗体的体外活性检测1、外周血单个核细胞活性实验取1名健康志愿者全血10-15ml，利用人淋巴细胞分离液分离人pbmc细胞，生理盐水洗细胞2遍，10％fbs1640培养基重悬细胞并计数，以1*105/孔接种于96孔板中，每孔接种50μl。将梯度的cd3抗体以及cd28抗体以25μl/孔加入对应的培养孔中至二者的终浓度均为1μg/ml，0.8μg/ml，0.6μg/ml，0.4μg/ml，0.2μg/ml，0.1μg/ml。同时在培养体系中以25μl/孔加入梯度pd-l1/fc融合蛋白至终浓度为0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml。置于37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人ifn-γelisa检测试剂盒测定上清中ifn-γ的表达情况。基于上述方法测定刺激pbmc活化的最适cd3，cd28浓度以及pd-l1抑制浓度。同样的方法分离人pbmc细胞并以同样的细胞密度接种于96孔板中。配置最适抗体刺激浓度以及pd-l1抑制浓度加入相应的孔中。10％fbs1640培养基稀释抗体至终浓度为0μg/ml、2.5μg/ml、10μg/ml、40μg/ml加入对应的反应体系，37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人ifn-γelisa检测试剂盒测定上清中ifn-γ的表达情况。结果：结果如图10所示，cd3/cd28抗体能够有效激活t细胞，pd-l1的加入则在一定程度抑制t细胞活性，本发明制备的抗体的加入能够有效逆转t细胞被抑制的状态，进而上调ifn-γ的表达，而且抗体的逆转效果具有剂量依赖性。2、混合淋巴细胞活性实验混合淋巴细胞活性实验是将分离的单核细胞诱导为成熟的dc细胞与异源cd4+t进行混合培养，抗pd-1抗体的加入能够有效激活t细胞的活性，通过检测上清中ifn-γ的表达水平间接反映抗体的细胞活性。实验不同时间点所用人全血来源于2名健康志愿者。首先，利用人淋巴细胞分离液分离1名健康志愿者全血中pbmc细胞，并利用单核细胞磁珠分选试剂盒分选单核细胞。10％fbs1640培养基重悬细胞并记数，以2*104/孔接种于96孔板，利用50ng/mlil-4以及25ng/mlgm-csf刺激单核细胞向dc细胞分化，置于37℃细胞培养箱培养7天，期间每三天换一次液。培养第7天，同样的方法分离另一名健康志愿者全血中的pbmc细胞，用cd4十t细胞磁珠分选试剂盒分选cd4十t阳性的细胞，10％fbs1640培养基重悬细胞并记数，以2*105/孔接种于96孔板，同时用10％fbs1640培养基稀释抗pd-1抗体至合适浓度，吸尽96孔板中培养上清，将梯度抗体随cd4十t细胞一同加入96孔板中使得抗体的终浓度分别为50μg/ml，10μg/ml，2μg/ml，0.4μg/ml，0.08μg/ml，0.016μg/ml，设置无关抗体对照(本实验室制备的抗蓖麻毒素人源化抗体mil50)和阴性对照(不加抗体)。继续置于37℃细胞培养箱培养5天收获上清，并利用人ifn-γelisa检测试剂盒测定上清中ifn-γ的表达情况。结果如图11所示，本发明制备的抗体能够有效激活cd4十t细胞释放ifn-γ，且抗体的激活效应随着抗体浓度增加具有良好的剂量依赖性。虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。序列表<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院<120>抑制pd-1/pd-l1信号通路的结合分子<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1glyilethrpheserasnser15<210>2<211>6<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2trptyraspglyserlys15<210>3<211>4<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aspserasptyr1<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4argalaserglnservalsersertyrleuala1510<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5asnserserasnargalathr15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6glnglnasnserasntrpproargthr15<210>7<211>113<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg151015serleuargleuasncyslysalaserglyilethrpheserasnser202530glymethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alavaliletrptyraspglyserlysleutyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleuphe65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alathraspserasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser100105110ser<210>8<211>107<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr202530leualatrptyrglnglnargproglyglnalaproargleuleuile354045tyrasnserserasnargalathrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnasnserasntrpproarg859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105当前第1页12