本发明属于单克隆抗体领域，具体涉及一种人源化抗her2单克隆抗体。
背景技术：
：乳腺癌是在女性中发病率高的癌症，每年全世界约有140万人被诊断为乳腺癌，国内每年新发病例约27.3万。大约20-30%的乳腺癌患者存在her2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2，人表皮生长因子受体2，也叫erbb2或neu）基因丰富和her2蛋白过表达的现象。her2过表达导致mapk和pi3k/akt信号转导途径激活、上调。her2阳性乳腺癌在靶向治疗出现之前曾被认为与下降的无复发生存期和总生存期以及更差的预后相关。正常细胞的细胞膜上her2受体的表达量大约为2万个，而her2阳性乳腺癌细胞的her2受体表达量约为1～2百万个，使得her2成为一个有吸引力的靶向治疗对象（anntranslmed.2014dec;2(12):122.）。her2是由原癌基因编码的跨膜受体蛋白，属于erbb家族，该家族有4个质膜结合受体酪氨酸激酶成员，分别是her1（erbb1）、her2（erbb2）、her3（erbb3）、her4（erbb4），调控着细胞的生长、生存，以及细胞黏附、迁移、分化和其他细胞应答。该家族的大多数成员可通过egf（表皮生长因子）、tgfα（转化生长因子α）等配体激活，也可通过同源二聚体化或与家族成员发生异源二聚体化的非配体依赖途径激活。然而her2至今未发现能与其结合的配体，主要通过二聚体化来激活（cancermanagres.2016may19;8:57-65.doi:10.2147/cmar.s104447.）。此外her2还能通过蛋白酶切除胞外区的方式激活。her2分子根据剪接形式的不同有6种亚型（isoform），a亚型（isoforma，或isoform1）前体蛋白由1255个氨基酸构成，分子量185kd，自n端至c端由信号肽（第1-22氨基酸，不包含在成熟蛋白中）、胞外区（第23-652氨基酸）、跨膜区（第635-675氨基酸）、胞内区（第676-1255氨基酸）组成。her2胞外区是发生同源二聚体化或与家族其他成员发生异源二聚体化的区域，胞内区具有酪氨酸激酶活性，胞外区二聚体化可导致胞内区发生自磷酸化、酪氨酸激酶活性被激活，进而激活mapk、pi3k/akt等下游信号转导途径（breastcare2015;10:173–178.）。her2胞外区由大约630个氨基酸组成（不包括信号肽），从n端到c端可分成四个结构域：domaini（约165个氨基酸）、domainii（约145个氨基酸）、domainiii（约170个氨基酸）、domainiv（约140个氨基酸）（molcell.2003sep;12(3):541-52.）。到目前为止，获fda（美国食品药品监督管理局）批准上市的抗her2抗体药物有3个：trastuzumab（曲妥珠单抗，商品名herceptin，赫赛汀）、pertuzumab（帕妥珠单抗，商品名perjeta）和ado-trastuzumabemtansine（t-dm1，商品名kadcyla），均由roche公司（下属的genentech公司）开发。曲妥珠是一个人源化igg1κ单克隆抗体，由cho细胞（中国仓鼠卵巢细胞）重组表达，靶向目标是her2胞外近膜区的结构域iv（图1），可通过以下几种途径阻断her2的下游信号转导、抑制her2阳性肿瘤细胞增殖：（1）阻止her2二聚体化引起的不依赖于配体的信号转导；（2）通过内吞作用破坏her2受体；（3）激活免疫反应；（4）保护her2胞外区免遭蛋白酶切除（nengljmed.2007jul5;357(1):39-51.）。曲妥珠能够抑制血管发生，通过下调pi3k和mapk信号途径导致细胞死亡，与肿瘤细胞结合后还能诱导adcc（抗体介导的细胞毒性）效应。herceptin的制剂采取冻干粉的剂型，每剂含有440mg单抗、400mgα,α-海藻糖二水合物、9.9mgl-盐酸组氨酸、6.4mgl-组氨酸和1.8mg的聚山梨酯20，使用前用20ml水重溶，得到ph6左右浓度为21mg/ml的曲妥珠注射液。herceptin的的储藏方式为冷藏于2-8℃，并在重溶后28天内使用。首次给药4mg/kg，之后每周给药2mg/kg，或首次给药8mg/kg，之后每三周给药6mg/kg。帕妥珠也是重组人源化igg1单克隆抗体，分子量148kd，由cho细胞重组表达，但是结合位点与曲妥珠不同，位于her2胞外区与二聚体化相关的亚结构域ii，该位点对her2与配体诱导的her3的异源二聚化是关键的（图1）。帕妥珠主要通过阻止her2与其他her家族成员发生异源二聚化来起作用，如egfr、her3、her4等。在动物模型上帕妥珠对her2未过表达的肿瘤细胞也有抑制作用。对于her2过表达的肿瘤细胞，帕妥珠能抑制其生长并与曲妥珠有协同效应。perjeta是液体制剂，静脉输液，每剂含有420mg单抗，浓度为30mg/ml，溶解于20mml-乙酸组氨酸、120mm蔗糖和0.02%聚山梨酯20组成的溶液中，储藏方式为冷藏于2-8℃。帕妥珠目前还没有被批准单独使用，必须与曲妥珠、多西他赛一起使用，首次使用剂量为840mg，之后每三周给药一次，每次420mg。t-dm1由曲妥珠与具有细胞毒性的微管抑制剂dm1（一种美坦辛衍生物）通过偶联剂smcc（琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯）偶联构成，dm1与曲妥珠的赖氨酸残基结合，平均每个曲妥珠单抗分子结合3～3.5个dm1分子。t-dm1与曲妥珠对her2具有相同的亲和力，是具有靶向性的细胞毒性药物。kadcyla的制剂形式是冻干粉，每剂含有100mg或160mg偶联抗体，使用前加水重溶，形成浓度为20mg/ml偶联抗体、0.02%（w/v）聚山梨醇20、10mm琥珀酸钠、6%（w/v）蔗糖的溶液，ph5.0。kadcyla的储藏方式为冷藏于2-8℃。kadcyla的给药剂量是3.6mg/kg，每三周给药一次。抗her2抗体除有开发成乳腺癌治疗药物的潜力，也可用于her2的血清学检测或免疫组化检测。her2的表达及水平是乳腺癌治疗、预后的重要参考指标，her2的检测包括基因检测、血清学检测、组织学检测等。血清学检测具有方便、可重复测量、定量、客观以及可实时检测等特点，目前血清her2的检测方法有酶联免疫分析(eia)、酶联免疫吸附试验（elisa）、化学发光免疫分析法等。近来研究表明血清学与组织学her2的检测结果一致性好，约有20-30%的乳腺癌患者血清中可溶性her2蛋白水平升高，血清her2可作为反映肿瘤生长、复发或者转移的检测指标。高血清her2水平提示肿瘤的高侵袭性，与临床分期、病情进展、无瘤生存期和总生存期有关，并能监测化疗药的治疗效果，是重要的预后因素。抗体对靶向抗原的亲和力是一项重要的性能指标，常用平衡解离常数（kd）来表示，kd值越小，抗体对靶向抗原的亲和力越高。一般来说，更高的亲和力往往意味着抗体更小的ec50（半最大效应浓度），对抗体药来说意味着更小的药物使用剂量、更低的治疗成本、更小的副反应，对免疫检测试剂盒来说意味着更高的灵敏度和更稳定的检测结果。目前国内外已有多种抗her2抗体已经被批准上市或正处于临床研究阶段。由于乳腺癌细胞往往存在多重基因突变，不同乳腺癌患者的her2表型具有多样性，并且随着病程的发展癌细胞还会不断发生基因变异。临床试验表明单用一种抗her2抗体药联合化疗的客观应答率（orr）一般只有10-60%，而用2种结合表位不同的her2抗体药联合化疗的客观应答率（orr）则可上升到70%（临床试验数据来自曲妥珠、帕妥珠的药品说明书）。在对乳腺癌患者的her2临床检测中，有个别her2发生变异的患者检测结果表现为her2假阴性，这可能与免疫检测试剂盒所使用的检测抗体识别的her2位点发生变异有关。因此开发多种结合表位不同的抗her2抗体药或her2检测试剂盒对患者人群庞大的乳腺癌治疗来说具有重要的意义。抗体属于蛋白质，其生物学活性的发挥依赖于蛋白质结构的正确性，包括一级结构和高级结构。由于蛋白质结构的热不稳定性，抗体药物或制剂需要冷藏储存，并且保质期短。提高抗体蛋白的热稳定性，对于降低抗体药物或制剂的储存成本、延长储存期、降低储存损耗具有积极的意义。蛋白质结构的热不稳定性既来自于一级结构，如某些氨基酸残基容易发生氧化、异构化，也来自于高级结构，如蛋白质高级结构中空间上相近的氨基酸残基之间作用力的强弱，以及暴露于蛋白质表面的氨基酸残基与溶剂之间相互作用的情况，这些作用力包括氢键、离子键、疏水键、范德华力等。至今，蛋白质高级结构的预测虽然已经有多种模型和理论，但是仍是一个难题；氨基酸突变对蛋白质高级结构及其热稳定性的影响更是难以准确预测，仅是达到了一个中等偏上的预测准确率。抗体虽然是高级结构研究较多的一类蛋白质，但是其可变区的多样性导致其高级结构预测也带有一定的不确定性，目前抗体高级结构的相关研究以及开发热稳定性好的抗体主要通过大量的试验在多种技术方案中来筛选确定，具有很大的随机性。差示扫描热量法（dsc）是一种用于表征蛋白质和生物分子稳定性的高灵敏度、全自动、高通量的方法，可以测定样品的热跃迁中点(tm)和其它热力学参数。溶液中的生物分子在其自然（折叠）构象和变性（去折叠）构象之间保持平衡。测得的热跃迁中点（tm）可提供快速、简易的蛋白质稳定性指示，tm值越大，生物分子越稳定。由蛋白质和其他大分子形成的立体结构经历温度诱导的构象变化，如去折叠，造成非共价键重新分配，从而导致热吸收，差示扫描热量法能够测量这种热量的吸收（δh，焓变）。dsc得出的数据可为蛋白质工程、配方研究、过程开发以及最终产品配方等生物制药开发过程提供重要指导。使用dsc法对多种igg1抗体进行对比分析，发现在10～100℃范围内抗体的dsc曲线（以dsc法测得的热量和温度分别为y轴、x轴作图所获得的曲线）上一般有3个峰，对应于3个tm值：tm1、tm2、tm3。其中tm1是抗体ch2区解折叠（unfolding）的温度；tm2、tm3是抗体fab区、ch3区解折叠的温度（mabs.2014may-jun;6(3):649-58.；mabs.2015;7(1):84-95.）。对比多个报道中不同igg1抗体的tm值，在ph中性条件下igg1抗体的tm1一般在68-72℃，tm3一般在82-86℃，tm2在不同抗体之间往往差异较大（proteinsci.2013;22(11):1542–1551.；mabs.2014;6:3,649–658.；proteinsci.2011;20(9):1546–1557.）。有的抗体tm2与tm1和/或tm3接近，dsc曲线峰值部分叠加，可以表现为仅有2个峰或1个峰（图2）。由于同一亚型的抗体有相近的恒定区（ch2、ch3），因此抗体稳定性的差异主要表现为fab区稳定性的差异。fab区是抗体发挥抗原结合功能的关键结构区，并且fab区的不稳定性可影响到抗体整体的不稳定性（biochembiophysrescommun.2007;355(3):751-7.），因此提高fab区的稳定性对保持抗体的功能和整体结构十分重要。技术实现要素：本发明解决的问题是针对癌症患者基因变异造成的her2表型的多样性所导致的抗药耐药问题，提供一种与现有上市抗体药物（曲妥珠、帕妥珠）作用效果不同的新型抗her2抗体，对一些类型的her2阳性的癌症细胞具有更好的体外和体内的抑制作用；并且针对抗体药物需要冷藏保存、容易失活的问题，提供一种具有更好的热稳定性的抗体药物。本发明的技术方案如下：一种人源化抗her2单克隆抗体，其特征在于，轻链的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3具有seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3的氨基酸序列，重链的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3具有seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6的氨基酸序列。优选的，所述的人源化抗her2单克隆抗体，轻链、重链的可变区具有seqidno:7、seqidno:8的氨基酸序列。优选的，所述的人源化抗her2单克隆抗体，轻链、重链的可变区由seqidno:9、seqidno:10的核苷酸序列编码。优选的，所述的人源化抗her2单克隆抗体，重链恒定区为igg1亚型。优选的，所述的人源化抗her2单克隆抗体，轻链、重链分别具有seqidno:11、seqidno:12的氨基酸序列。优选的，所述的人源化抗her2单克隆抗体，轻链、重链分别由seqidno:13、seqidno:14的核苷酸序列编码。所述的人源化抗her2单克隆抗体在制备治疗her2阳性癌症的药物中的用途，优选的，所述的癌症是乳腺癌或消化道恶性肿瘤。所述的人源化抗her2单克隆抗体在制备her2检测试剂盒中的用途。本发明的有益效果在于：所述的人源化抗her2单克隆抗体与现有上市抗体药物（曲妥珠、帕妥珠）在体外和动物体内的作用效果均不同，由于乳腺癌患者基因变异造成的体内her2的多样性，本发明可能为一些her2突变型甚至更多数量的her2阳性癌症患者提供一种更有效的药物；此外，本发明提供的人源化抗her2单克隆抗体具有更好的热稳定性，具有常温下保存时间长、产品保质期长等特点。附图说明图1：her2结构及曲妥珠、帕妥珠结合表位示意图；图2：igg1抗体dsc曲线示意图；图3：杂交瘤分泌的抗体可变区基因克隆所使用的引物在pcr模板上的位置；图4：表面等离子共振法（spr）对hu14c5b-5抗体与rher2-ecd结合情况的测试结果图；图5：hu14c5b及其突变株使用dsc法（差示扫描热量法）测试热稳定性的实验结果；图6：hu14c5b-5对乳腺癌细胞bt-474的体外生长抑制实验结果图；图7：hu14c5b-5对乳腺癌细胞bt-474trar（曲妥珠抗性）的体外生长抑制实验结果图；图8：hu14c5b-5对乳腺癌细胞hcc-1954（曲妥珠抗性）的体外生长抑制实验结果图；图9：hu14c5b-5对小鼠体内bt-474细胞所致肿瘤的抑制实验结果图；图10：hu14c5b-5对小鼠体内bt-474trar细胞所致肿瘤的抑制实验结果图；图11：hu14c5b-5对小鼠体内hcc-1954细胞所致肿瘤的抑制实验结果图。具体实施方式实施例1、鼠源抗her2单克隆抗体的制备与筛选按文献《moleculararchitectureoftheerbb2extracellulardomainhomodimer》（oncotarget.2015jan30;6(3):1695-706.）的方法制备重组人her2蛋白的胞外区（命名为rher2-ecd），用于免疫balb/c小鼠，腹腔注射50μg/只/次，首次免疫混合弗氏完全佐剂，2-4次混合弗氏不完全佐剂。两周后眼眶取血，elisa法检测抗体滴度，选择滴度高的动物，静脉注射50μg/只。3日后取脾脏，采用聚乙二醇法进行细胞融合，hat培养基（invitrogen公司）加压筛选，融合细胞培养上清elisa法检测筛选阳性克隆，并及时克隆化。杂交瘤细胞接种balb/c小鼠腹腔，定期抽取腹水，rproteing亲和层析纯化抗her2单克隆抗体，然后用biacore3000生物大分子相互作用仪（购自ge公司）通过spr（表面等离子共振法）进行亲和力测定，测定方法如下：将rher2-ecd偶联到固定有羧甲基葡聚糖的cm5传感器芯片（购自gehealthcare公司，货号br100012）上，将待检测的抗体用运行缓冲液（即hbs-epbuffer，购自gehealthcare公司，货号br100188）在1nmol/l～3000nmol/l范围内进行梯度稀释，然后分别注射进样，实验整个过程流速设定为30μl/min，在25℃下进行，用仪器测定流动相中的蛋白与芯片表面偶联的蛋白结合所引起的折光率变化，通过仪器的配套软件计算获得ka、kd、kd值等动力学参数。每次测定后，注射20μl60μmol/l氢氧化钠溶液除去芯片表面的结合蛋白,以便进行下一个样品的试验。亲和力测试结果见下表：序号杂交瘤编号解离常数kd（m）1m3a6c7.549e-082m5c10c5.426e-093m8d2b9.881e-104m10a14d4.563e-075m11b8a2.934e-086m14c5b2.952e-107m15a3d3.428e-098对照——曲妥珠3.324e-109对照——帕妥珠5.847e-10编号为m14c5b的杂交瘤细胞克隆亲和力最好，进行下一步的研究和改进。实施例2、抗体可变区基因的克隆（5’race）trizol法（trizol试剂购自thermofisher公司，货号15596026）提取实施例1筛选获得的编号为m14c5b的杂交瘤细胞总rna。选择抗体（igg1，κ）重链和轻链恒定区的适当位置分别设计3条基因特异性引物：gsp1-h～gsp3-h和gsp1-l～gsp3-l，引物序列如下：gsp1-h：gtagaggtcagactgcaggac；gsp2-h：ctcagggaaatagcccttgac；gsp3-h：agatccaggggccagtggatagac；gsp1-l：ttgctgtcctgatcagtccaact；gsp2-l：tgtcgttcactgccatcaatctt；gsp3-l：ttgttcaagaagcacacgactga。其中gsp1距离可变区基因最远，用于逆转录反应，gsp2用于首轮pcr扩增，gsp3用于巢式扩增。通用引物采用5'racecdna末端快速扩增系统（购自thermofisher公司，货号18374058）中的aap引物和auap引物。各引物在pcr模板上的相对位置见图3。以gsp1为引物将总rna逆转录成cdna，然后给第一链cdna的3’末端加上poly（c）尾，加尾后用gsp2和aap为引物pcr扩增，扩增产物稀释100倍，以auap和gsp3为引物进行巢式pcr扩增。两次pcr反应均采用热启动，反应条件：94℃2分钟；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7分钟。巢式pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段并克隆到pgem-teasy载体（购自promega公司）中，筛选阳性克隆进行dna测序，dna测序结果用软件翻译成氨基酸，表明m14c5b杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的轻、重链可变区分别为seqidno:15、seqidno:16的氨基酸序列，经抗体同源对比分析确定其轻链的cdr1、cdr2、cdr3分别为seqidno:15的第24-34，50-56，89-97位氨基酸，重链的cdr1、cdr2、cdr3分别为seqidno:16的第26-35，50-66，99-110位氨基酸。实施例3、鼠源单抗的人源化设计分别选择人免疫球蛋白重链iii亚组和igκ链i亚组的一致序列作为抗体轻重链的人源化模板，可变区氨基酸序列分别如下：重链iii亚组：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsvisgdggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycargfdywgqgtlvtvsκ链i亚组：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisnylawyqqkpgkapklliyaasslesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqynslpwtfgqgtkveikr然后将鼠源抗体m14c5b的重链和轻链cdr区分别移植到人源模板重链iii亚组和igκ链i亚组，即以轻链的cdr1、cdr2、cdr3分别替代κ链i亚组的第24-34、50-56、89-97位氨基酸，以重链的cdr1、cdr2、cdr3分别替代重链iii亚组的第31-35，50-66，99-102位氨基酸，构成cdr移植抗体，获得的cdr移植抗体可变区分别具有以下氨基酸序列：轻链可变区：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrtsqdisnylhwyqqkpgkapklliyststghsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsytlaytfgqgtkveikr重链可变区：evqlvesggglvqpggslrlscaasgysftmyninwvrqapgkglewvsnldayyggsnynpkfkdrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarilwsrdfytmdywgqgtlvtvs利用insightii程序包（购自accelrys公司）模拟鼠源单抗可变区的三维结构，确定在cdr区周围5å的空间范围内可能影响鼠源抗体cdr构象而又与人源模板中相应位置不同的fr区（框架区）残基为重链（seqidno:16）的k38、i48、g49、k67、a68、l70、a79、t97以及轻链（seqidno:15）的v4、f87。将这些鼠源氨基酸残基保留在构建的cdr移植抗体中，即对可能影响抗体亲和力的fr区重要残基进行回复突变，从而获得高亲和力的人源化抗体，命名为hu14c5b，其轻链和重链可变区分别具有seqidno:17、seqidno:18的序列。实施例4、提高人源化抗体hu4f11的亲和力和热稳定性为了提高人源化抗体的亲和力和热稳定性，设计了几种不同的氨基酸替换方案（l-表示轻链，h-表示重链）：方案1（hu14c5b-1）：l-g54a、a95l，h-y27f、s28t、t30s、m31a、a53p、f105y；方案2（hu14c5b-2）：l-g54a、a95l，h-y27f、s28t、t30s、m31l、a53p、f105y；方案3（hu14c5b-3）：l-g54a、a95l，h-y27f、s28t、t30s、m31a、a53g、f105y；方案4（hu14c5b-4）：l-g54a、a95l，h-y27f、s28t、t30s、m31l、a53g、f105y；方案5（hu14c5b-5）：l-g54l、a95p，h-y27f、s28t、t30s、m31a、a53p、f105y；方案6（hu14c5b-6）：l-g54l、a95p，h-y27f、s28t、t30s、m31l、a53p、f105y；方案7（hu14c5b-7）：l-g54l、a95p，h-y27f、s28t、t30s、m31a、a53g、f105y；方案8（hu14c5b-8）：l-g54l、a95p，h-y27f、s28t、t30s、m31l、a53g、f105y。将hu14c5b及上述突变体的可变区序列与人源化抗体轻重链恒定区序列（seqidno:19、seqidno:20）连接，按照cho细胞（中国仓鼠卵巢细胞）偏爱密码子逆翻译，获得轻链、重链的dna编码序列，其中hu14c5b-5的dna编码序列见seqidno:13（轻链）、seqidno:14（重链）；通过化学合成dna序列，将轻链、重链的dna编码序列分别插入pcdna3.1真核表达载体，转染cho-k1细胞（atcc编号ccl-61），在含10%胎牛血清（fbs）的dmem/f12培养基（购自thermofisher公司，货号11320082）中37℃、5%co2条件下表达，采用重组蛋白a亲和层析介质纯化获得抗体蛋白，分别用spr法和dsc法（差示扫描热量法）测定抗体突变体对靶向抗原的亲和力和热稳定性，并与母本hu14c5b和商业化的抗体药曲妥珠单抗、帕妥珠单抗比较。spr法的测定流程同实施例1，测定结果如下：序号人源化抗体名称解离常数kd（m）1hu14c5b2.418e-102hu14c5b-18.527e-093hu14c5b-23.153e-084hu14c5b-37.436e-085hu14c5b-41.054e-086hu14c5b-51.857e-107hu14c5b-64.615e-098hu14c5b-71.977e-109hu14c5b-83.275e-0910对照——曲妥珠3.205e-1011对照——帕妥珠5.582e-10从图中解离常数kd值可以看出，hu14c5b及hu14c5b-5、hu14c5b-7两个突变株较好的保留了对靶向抗原的亲和力，其中hu14c5b-5的spr测试图谱见图4。dsc的测定流程如下：将待测抗体以1.0mg/ml的浓度溶解于ph7.4的磷酸盐缓冲液（每升含氯化钠8.0g，磷酸二氢钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，氯化钾0.2g）中，以不含有蛋白的相应空白缓冲液作为背景对照，在vp-dsc设备（购自microcal公司）上样测试，扫描范围为10-120℃，速率100℃/小时，起始阶段在10℃平衡10分钟。以16秒作为过滤周期（filteringperiod），采用统计分析软件对测得的曲线进行分析获得tm值和δh值。dsc的测定结果见图5，从中可以看出，hu14c5b-5的fab区与其他测试抗体及参考品相比具有更高的tm值（约90℃）和δh值，具有更好的热稳定性。实施例5制剂的稳定性比较将hu14c5b-5抗体分别按以下配方制成无菌的冻干粉剂和液体制剂：冻干粉剂：每剂含有440mg单抗、400mgα,α-海藻糖二水合物、9.9mgl-盐酸组氨酸、6.4mgl-组氨酸和1.8mg的聚山梨酯20；液体制剂：每剂含有420mg单抗，浓度为30mg/ml，溶解于20mml-乙酸组氨酸、120mm蔗糖（41mg/ml，4.1%）和0.02%聚山梨酯20组成的溶液中；然后分别装于适合的无菌玻璃药瓶中密封，分别于4℃、30℃、37℃、50℃储存3个月，然后按1mg/ml的抗体浓度重悬于水中，elisa测定抗体的效价，elisa方法如下：用实施例1制备的rher2-ecd蛋白包被96孔板，加入稀释1000倍后的待测抗体样品，反应1小时，再加入辣根过氧化酶标记的抗人igg抗体，反应1小时，加入tmb底物进行显色反应，酶标仪读取od值，每个样品做2个重复孔，取平均值。以储存于4℃的样品测定值为基准，计算抗体效价的下降幅度（百分比），并以经同样处理的曲妥珠和帕妥珠单抗为参比品进行对比，结果见下表：从表中可以看出，hu14c5b-5比曲妥珠和帕妥珠在30℃～50℃有更好的稳定性。实施例6乳腺癌细胞的体外生长抑制实验采用celltiter96aqueousnon-radioactivecellproliferationassay试剂盒（购自promega公司，目录号g5421）检测，将hu14c5b-5与对照抗体曲妥珠、帕妥珠用细胞培养液从100nm（约合1.5ug/ml）的初始浓度以3x的倍数逐级稀释8次，以不加抗体的培养液为空白对照，各取100ul，加入已接种bt-474（高表达her2的乳腺癌细胞，atcc编号htb-20）、bt-474trar（由海思太科药业赠送，系按专利cn201310416146.x实验例2的方法制备的曲妥珠耐药细胞）、hcc-1954（对曲妥珠天然耐药的her2阳性乳腺癌细胞，atcc编号crl-2338）的96孔板中，在含10%胎牛血清的rpmi1640细胞培养基中37℃、5%co2条件下培养24h，弃上清，每孔加入100ulpbs和20ulmts溶液，37℃、5%co2条件下孵育3h，用酶标仪读取490nm吸光度值。以不加抗体的空白对照读数为细胞增殖率100%，其他孔读数与空白对照读数的比值为该孔对应的细胞增殖率。以细胞增殖率、抗体浓度为y轴、x轴作图，结果见图6-图8，从中可以看出hu14c5b-5对bt-474、hcc-1954细胞的增殖均具有明显的抑制作用，而对bt-474trar细胞的增殖抑制不明显，说明hu14c5b-5具有独特的药效动力学，可能与其独特的her2结合表位有关。实施例7抗her2抗体的体内抗肿瘤研究给scid小鼠分别皮下接种bt-474细胞、bt-474trar细胞、hcc-1954细胞，待肿瘤长至100mm3时将荷瘤小鼠分组，每组分别尾静脉注射5mg/kg的hu14c5b-5、曲妥珠、帕妥珠及生理盐水对照，每周2次，连续治疗3周，定期观测各组小鼠体重和肿瘤大小的变化。治疗及观察期内各组裸鼠右腋部接种乳腺癌癌细胞均有增长，以测得的肿瘤体积对首次给药后天数作图，结果见图9-图11，说明hu14c5b-5在小鼠体内对bt-474细胞、hcc-1954细胞所形成的肿瘤亦有抑制作用，而对bt-474trar细胞无抑瘤效果，与曲妥珠、帕妥珠的抑制效果均不同，作用机制具有特殊性。sequencelisting<110>上海张江生物技术有限公司<120>一种人源化抗her2单克隆抗体<130><160>20<170>patentinversion3.3<210>1<211>11<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5轻链cdr1<400>1argthrserglnaspileserasntyrleuhis1510<210>2<211>7<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5轻链cdr2<400>2serthrserthrleuhisser15<210>3<211>9<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5轻链cdr3<400>3glnglnsertyrthrleuprotyrthr15<210>4<211>10<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5重链cdr1<400>4glyphethrpheseralatyrasnileasn1510<210>5<211>17<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5重链cdr2<400>5asnleuaspprotyrtyrglyglyserasntyrasnprolysphelys151015asp<210>6<211>12<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5重链cdr3<400>6ileleutrpserargasptyrtyrthrmetasptyr1510<210>7<211>108<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5轻链可变区<400>7aspileglnvalthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargthrserglnaspileserasntyr202530leuhistrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrserthrserthrleuhisserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrphecysglnglnsertyrthrleuprotyr859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg100105<210>8<211>123<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5重链可变区<400>8gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheseralatyr202530asnileasntrpvallysglnalaproglylysglyleuglutrpile354045glyasnleuaspprotyrtyrglyglyserasntyrasnprolysphe505560lysasplysalathrleuserargaspasnserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095thrargileleutrpserargasptyrtyrthrmetasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserseralaser115120<210>9<211>324<212>dna<213>artificial<220><223>hu14c5b-5轻链可变区dna<400>9gatatccaggtgacccagtctccgtcttctctgtctgcgtctgtgggtgatcgtgtgacc60atcacctgccgtacctctcaggatatctctaactatctgcattggtatcagcagaaaccg120ggtaaagcgccgaaactgctgatctattctacctctaccctgcattctggtgtgccgtct180cgtttctctggttctggttctggtaccgatttcaccctgaccatctcttctctgcagccg240gaagatttcgcgacctatttctgccagcagtcttataccctgccgtataccttcggtcag300ggtaccaaagtggaaatcaaacgt324<210>10<211>369<212>dna<213>artificial<220><223>hu14c5b-5重链可变区dna<400>10gaagtgcagctggtggaatctggtggtggtctggtgcagccgggtggttctctgcgtctg60tcttgcgcggcgtctggtttcaccttctctgcgtataacatcaactgggtgaaacaggcg120ccgggtaaaggtctggaatggatcggtaacctggatccgtattatggtggttctaactat180aacccgaaattcaaagataaagcgaccctgtctcgtgataactctaaaaacaccgcgtat240ctgcagatgaactctctgcgtgcggaagataccgcggtgtattattgcacccgtatcctg300tggtctcgtgattattataccatggattattggggtcagggtaccctggtgaccgtgtct360tctgctagc369<210>11<211>214<212>prt<213>artificial<220><223>hu14c5b-5轻链<400>11aspileglnvalthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargthrserglnaspileserasntyr202530leuhistrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrserthrserthrleuhisserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrphecysglnglnsertyrthrleuprotyr859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala100105110proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly115120125thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala130135140lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln145150155160gluservalthr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