本发明涉及一种a型赛内卡病毒病毒样颗粒及其制备方法和用途，属于农业科学畜牧兽医学技术领域。
背景技术：
a型塞尼卡病毒(senecavirusa，sva)也称为塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)，属于小rna病毒科塞尼卡病毒属。sva基因组长约7.2kb，为无囊膜的单股正链rna病毒，病毒粒子呈典型的二十面体对称，直径27nm左右。2002年，美国一家公司在细胞培养物中偶然发现了sva，sva最初被认为是细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清。2007年sva被发现是引起加拿大发生的猪原发性水疱病(pivd)的致病病原。在2014年，巴西出现几次严重的感染症状，并导致巨大经济损失，该病才逐渐被重视。现有研究已证实sva感染后能引起各年龄段的猪发生水疱。2015年3月，该病首次在我国广东某猪场暴发，之后在其他省份也有该病发生的报道。尽快研发疫苗则成为防控该病大范围流行最迫切最有效的方法。
病毒样颗粒(vlps)疫苗是可以不动用活毒，但免疫原性与灭活病毒几乎相同的疫苗形式，它是不含病毒核酸的空壳结构，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，由于不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性。从安全性和免疫效力方面来讲，它是一种最有可能替代传统灭活疫苗的生物形式。
本发明利用原核表达系统获得塞内卡谷病毒的病毒样颗粒，并检测其免疫原型，为塞内卡谷病毒的防控提供首选疫苗形式。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种a型赛内卡病毒的病毒样颗粒及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
原核表达系统生产vlps，其优势是费用低廉，蛋白产率高，容易满足大规模生产。鉴于此，本发明利用原核表达系统，通过不同融合标签的组合，实现sva结构蛋白的高效可溶性表达，经纯化、切割融合肽，体外组装成vlps，结果显示，不同标签的组合提高了vlps的组装效率，所获得的vlps具有良好的反应原性和免疫原性。
具体的，本发明的一种a型赛内卡病毒病毒样颗粒，是由a型赛内卡病毒的结构蛋白vp0、结构蛋白vp1以及结构蛋白vp3组装而成，其中编码结构蛋白vp0的基因序列为seqidno.1所示，编码结构蛋白vp1的基因序列为seqidno.2所示，编码结构蛋白vp3的基因序列为seqidno.3所示。
进一步的，本发明还提出了一种制备所述的a型赛内卡病毒病毒样颗粒方法，包括以下步骤：
(1)构建含有编码a型赛内卡病毒结构蛋白vp0、结构蛋白vp1或结构蛋白vp3基因序列的重组质粒，其中编码结构蛋白vp0的基因序列为seqidno.1所示，编码结构蛋白vp1的基因序列为seqidno.2所示，编码结构蛋白vp3的基因序列为seqidno.3所示；
(2)a型赛内卡病毒结构蛋白vp0、结构蛋白vp1以及结构蛋白vp3的表达和纯化；
(3)a型赛内卡病毒病毒样颗粒的组装。
在本发明的一个具体实施例中，制备所述的a型赛内卡病毒病毒样颗粒方法，包括以下步骤：
(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体psma、psmk和psmc的构建：
1)以酿酒酵母基因组dna为模板，以smt3f与smt3r为引物扩增smt3基因，引物序列如下：
smt3f：5’gccatgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaa3’
smt3r：5’ggatccgagaccttaaggtctcaacctccaatctgttcgcggtg3’，
2)经ncoi和bamhi双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pet-28a载体中，所得载体命名为psmk，将psmk的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因或氯霉素抗性基因，所得载体分别命名为psma和psmc；
(2)sva结构蛋白基因重组表达载体的构建
根据已公布的sva序列，进行密码子优化并合成编码结构蛋白vp0、vp1和vp3的基因序列；
以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增vp0，vp1以及vp3基因片段：
vp0f：5’ggtctctaggtggcaacgttcaaaccacc3’
vp0r：5’cgcggatcctcactgttcctcatcggtacc3’
vp1f：5’ggtctctaggtagcaccgacaacgcggag3’
vp1r：5’cgcggatcctcattgcatcagcattttctg3’
vp3f：5’ggtctctaggtggtccgattccgaccgcg3’
vp3r：5’cgcggatcctcagtgaaaaacatagctcgg3’
采用聚合酶链式反应方法，分别用引物vp0f/vp0r、vp1f/vp1r和vp3f/vp4r扩增获得编码结构蛋白vp0、vp1和vp3的基因片段，其中，编码结构蛋白vp0的基因序列为seqidno.1所示，编码结构蛋白vp1的基因序列为seqidno.2所示，编码结构蛋白vp3的基因序列为seqidno.3所示；扩增获得的vp0、vp1和vp3基因片段分别经bsmbi/bamhi双酶切后插入经bsai酶切处理的psmk、psma或psmc，所构建重组表达载体分别命名为psmk/vp0、psma/vp1和psmc/vp3，以psmk/vp0、psma/vp1和psmc/vp3为模板，分别用gstf/vp0gstr、gstf/vp1gst和gstf/vp3gstr引物对扩增含有vp0、vp1或vp3的基因片段，分别经bamh/xhoi双酶切后插入经同样酶切处理的pgex4t-1载体，所得重组载体分别命名为pgstvp0、pgstvp1和pgstvp3，所用引物序列如下：
gstf:5’ggcaatggatccatgggtcatcaccatcatcatcac,
vp0gstr:5’ggtaatctcgagttactgttcctcatcggtaccgg,
vp1gstr:5’ggccgtctcgagttattgcatcagcattttctgc,
vp3gstr:5’ggccttctcgagttagtgaaaaacatagctcggg。
(3)sva重组蛋白的表达、纯化
1)重组蛋白的表达
将步骤(2)获得的重组表达载体psmk/vp0、psma/vp1、psmc/vp3、pgstvp0、pgstvp1和pgstvp3采用不同组合搭配共转化到表达菌bl21(de3)，用卡那霉素、氨苄青霉素和氯霉素结合pcr方法筛选同时含有vp0、vp1和vp3基因的阳性克隆；挑选阳性克隆菌于lb培养基中37℃220rpm过夜培养，将上述菌液以1:100接种lb培养基，于37℃220rpm培养至菌液的od600达0.8，以终浓度为0.01mmiptg、25℃过夜诱导表达，随后以5000rpm、30min离心收集菌体沉淀，-20℃储存备用；
2)表达蛋白纯化
用冰浴的缓冲液a重悬步骤1)得到的菌体沉淀，超声破碎菌体细胞；12,000×g离心30min，取上清，弃沉淀，上清与ni-ntahis·bindresins混匀，4℃结合30min；用缓冲液a洗去非特异性结合的杂蛋白，用缓冲液b洗脱目的蛋白，-70℃保存；
所述的缓冲液a含有20mmtris-hcl，500mmnacl，5mmimidazol，ph＝8.5；所述的缓冲液b含有20mmtris-hcl，500mmnacl，300mmimidazol，ph＝8.5；
(4)sva病毒样颗粒的体外组装
用小泛素化修饰蛋白酶酶切步骤2)得到的纯化后的融合蛋白，组装得到所述的a型赛内卡病毒病毒样颗粒。
其中，优选的，采用重组表达载体psmk/vp0、pgst/vp1和psmc/vp3的组合共转化到表达菌bl21(de3)，得到重组蛋白。
其中，优选的，步骤(4)中所述的sva病毒样颗粒的体外组装按照如下方法进行：20μg纯化后的融合蛋白，200μl酶切缓冲液，10μl小泛素化修饰蛋白酶，37℃孵育30min；其中，所述的酶切缓冲液中含有50mmtris-hcl，150mmnacl，1mmcacl2，ph8.0。
进一步的，本发明还提出了所述的a型赛内卡病毒病毒样颗粒在制备a型赛内卡病毒疫苗中的用途。以及
所述的a型赛内卡病毒病毒样颗粒在制备a型赛内卡病毒诊断试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明尝试将不同融合标签结合使用，以期提高目的蛋白的表达量和病毒样颗粒的组装效率，结果显示，在sumovp1基因的n端再次融合gst后所得重组载体pgst/vp1，与psmk/vp0和psmc/vp3组合共同转染的表达菌表达的蛋白可溶性最好，vlps的组装率最高。本发明的提出为进一步推进病毒样颗粒疫苗的研究和应用，加速动物疫苗由传统灭活苗向基因工程苗转化的步伐提供技术支持。
附图说明
图1为sva重组蛋白的sds-page和免疫印迹检测；
m：蛋白质分子质量标准；1、2：纯化sva重组蛋白的sds-page；3：重组蛋白的免疫印迹；
图2为svavlps透射电镜观察；
图3为svavlps免疫动物血清elisa抗体检测结果；
图4为svavlps免疫动物血清中和抗体检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1sva病毒样颗粒的制备
1.小泛素样修饰蛋白融合表达载体psma、psmk和psmc的构建：
(1)以酿酒酵母基因组dna为模板，以smt3f与smt3r为引物扩增smt3基因，引物序列如下：
smt3f：5’gccatgggtcatcaccatcatcatcacgggtcggactcagaagtcaatcaa3’
smt3r：5’ggatccgagaccttaaggtctcaacctccaatctgttcgcggtg3’，
(2)经ncoi和bamhi双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pet-28a载体中，所得载体为psmk，将psmk的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因或氯霉素抗性基因，得载体psma和psmc；
2.sva结构蛋白基因重组表达载体的构建
根据已公布的sva序列(genbank登陆号：nc_011349)，进行密码子优化并合成结构蛋白基因vp0、vp1和vp3。
以合成的基因为模板，用以下引物对分别扩增vp0，vp1以及vp3基因片段：
vp0f：5’ggtctctaggtggcaacgttcaaaccacc3’
vp0r：5’cgcggatcctcactgttcctcatcggtacc3’
vp1f：5’ggtctctaggtagcaccgacaacgcggag3’
vp1r：5’cgcggatcctcattgcatcagcattttctg3’
vp3f：5’ggtctctaggtggtccgattccgaccgcg3’
vp3r：5’cgcggatcctcagtgaaaaacatagctcgg3’
采用聚合酶链式反应(pcr)方法，分别用引物vp0f/vp0r、vp1f/vp1r和vp3f/vp4r扩增获得vp0、vp1和vp3基因片段，所述的vp0的基因序列为seqidno.1所示，vp1的基因序列为seqidno.2所示，vp3的基因序列为seqidno.3所示；扩增获得的vp0、vp1和vp3基因片段分别经bsmbi/bamhi双酶切后插入经bsai酶切处理的psmk、psma或psmc，所构建重组表达载体分别命名为psmk/vp0、psma/vp1和psmc/vp3。用以上重组载体为模板，分别用gstf/vp0gstr、gstf/vp1gst和gstf/vp3gstr引物对扩增含有vp0、vp1或vp3的基因片段，分别经bamh/xhoi双酶切后插入经同样酶切处理的pgex4t-1载体，所得重组载体分别命名为pgstvp0、pgstvp1和pgstvp3。所用引物序列如下：
gstf:5’ggcaatggatccatgggtcatcaccatcatcatcac,
vp0gstr:5’ggtaatctcgagttactgttcctcatcggtaccgg,
vp1gstr:5’ggccgtctcgagttattgcatcagcattttctgc,
vp3gstr:5’ggccttctcgagttagtgaaaaacatagctcggg。
3.sva重组蛋白的表达、纯化和免疫印迹
(1)重组蛋白的表达
将以上重组表达载体采用不同组合搭配共转化到表达菌bl21(de3)，用卡那霉素、氨苄青霉素和氯霉素结合pcr方法筛选同时含有vp0、vp1和vp3基因的阳性克隆。挑选阳性克隆菌于lb培养基中37℃220rpm过夜培养，将上述菌液以1:100接种lb培养基，于37℃220rpm培养至菌液的od600达0.8左右，以终浓度为0.01mmiptg、25℃过夜诱导表达，随后以5000rpm、30min离心收集菌体沉淀，-20℃储存备用。
(2)表达蛋白纯化
用冰浴的缓冲液a(20mmtris-hcl，500mmnacl，5mmimidazol，ph＝8.5)重悬细菌沉淀，超声破碎菌体细胞。12,000×g离心30min，取上清，弃沉淀，上清与ni-ntahis·bindresins混匀，4℃结合30min。用缓冲液a洗去非特异性结合的杂蛋白，用缓冲液b(20mmtris-hcl，500mmnacl，300mmimidazol，ph＝8.5)洗脱目的蛋白，-70℃保存。sds-page检测结果显示获得了预期大小的蛋白。结果显示，不同载体的组合对目标蛋白的表达和纯化影响很大，其中psmk/vp0、pgst/vp1和psmc/vp3组合转染的表达菌表达的蛋白可溶性最好，vp0、vp1和vp3三种蛋白的表达量的比例最接近1:1:1。
(3)免疫印迹实验
将洗脱下来的重组蛋白进行10％sds-page电泳，利用湿转将重组蛋白电转移至聚偏氟乙烯杂交膜(pvdf膜)，用封闭液(pbst，5％脱脂奶粉，ph7.0)37℃条封闭1h，用pbst1:200稀释sva阳性血清，37℃作用1小时，充分洗涤后，用pbst1:3000稀释辣根过氧化物酶标记的抗兔猪igg，在37℃条件作用1h，pbst充分洗涤；之后于暗室加入发光底物反应3min，在kozak胶片下曝光，显影及定影固定后，可见其条带与预期大小相符，说明获得的蛋白能够与sva阳性血清反应的特异性目标蛋白(图1)。
4.sva病毒样颗粒的体外组装
参照invitrogn的试剂使用说明，用小泛素化修饰蛋白酶酶切融合蛋白，组装病毒样颗粒。按照如下方法和比例进行：20μg上述纯化的融合蛋白，200μl酶切缓冲液(50mmtris-hcl，150mmnacl，ph8.0，1mmcacl2)，10μl小泛素化修饰蛋白酶(1u/μl)，37℃孵育30min。
透射电镜观察：将10μl含vlps的组装液加到200目的铜网上，室温吸附2-3min，用滤纸吸干铜网上剩余的液体后用3％的磷钨酸染色，用hitachi,h-7100fa透射电镜观察，组装的vlps电镜观察，如图2所示，在此条件下组装的病毒样颗粒直径主要分布在20-30nm之间，其形态、大小和自然的病毒粒子相似。
5.病毒样颗粒的纯化及组装率测定
用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒样颗粒：将1ml含病毒样颗粒的液体置于20％-45％浓度的蔗糖梯度上，以35000rpm、4℃离心3h,分部取样，检测od280nm吸光值并绘制曲线，计算vlps的组装效率。结果显示psmk/vp0、pgst/vp1和psmc/vp3组合转染的表达菌所表达蛋白组装vlps的组装率最高。
实施例2sva病毒样颗粒的免疫原性研究
将免疫用抗原按照说明用弗氏佐剂乳化。15只300克左右的豚鼠随机分为3组，第一组免疫vlps(实施例1制备)，第二组免疫未组装的蛋白，第三组注射pbs作为对照。在免疫后28天采血分离血清，检测抗体效价和中和抗体。
(1)抗体效价的elisa检测
将96孔酶标板用100μl0.05m碳酸钠缓冲液(ph9.6)稀释的sva高免血清4℃包被过夜。pbst清洗3次，再用sva病毒液在37℃下孵育1h，pbst清洗3次，孔板用含5％脱脂奶粉的pbst(100μl)37℃封闭1h。pbst清洗3遍后，将被捡血清分别用含1％脱脂奶粉pbst按1:100稀释后，每孔100μl加于封闭孔板中，于37℃孵育1h。pbst清洗3次后，hrp标记的兔抗豚鼠igg抗体(sigma)用含1％脱脂牛奶的pbst按1:3000稀释并每孔100μl加于封闭孔板中，于37℃孵育1h，pbst清洗3次后，50μl底物溶液(tmb,sigma)加于各孔中于37℃孵育15min。然后用50μl2nh2so4加于各孔终止颜色反应，于450nm检测光密度(od值)。
结果显示，与未组装蛋白免疫组和pbs对照组相比，vlps免疫组的血清抗体水平明显升高，差异显著(p<0.01)(图3)。
(2)血清中和抗体检测
以微量中和试验检测血清中和抗体滴度。将生理盐水稀释的血清56℃灭活30分钟后，在96孔微量细胞培养板上，用dmem营养液作2倍系列稀释，每个稀释度4孔，每孔加入50μl病毒液(100tcid50)，37℃温箱中和1h后每孔加入100μl细胞悬液(1×105个/ml)，置5％co2培养箱37℃培养，自48h观察至144h。设置阳性和阴性血清对照、病毒回归试验、血清毒性对照、正常细胞对照。按照spearman-karber方法，计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。
结果显示，vlps免疫组的血清中和抗体滴度为1:32-1：256，未组装蛋白免疫组的血清中和抗体滴度为1:16-1:45，进一步说明vlps的免疫优势(图4)。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>一种a型赛内卡病毒病毒样颗粒及其制备方法和用途
<160>3
<170>patent-in3.5
<210>1
<211>1065
<212>dna
<213>senecavirusa
<400>1
ggcaacgttcaaaccaccagcaagaacgacttcgatagccgtggcaacaacggtaacatg60
acctttaactactatgcgaacacctaccagaacagcgtggacttcagcaccagcagcagc120
gcgagcggtgcgggtccgggtaacagccgtggtggcctggcgggtctgctgaccaacttt180
agcggcatcctgaacccgctgggttatctgaaggaccacaacaccgaggaaatggagaac240
agcgcggatcgtgttatcacccaaaccgcgggcaacaccgcgattaacacccagagcagc300
ctgggtgttctgtgcgcgtacgtggaagacccgaccaaaagcgatccgccgagcagcagc360
accgaccagccgaccaccaccttcaccgcgattgatcgttggtataccggccgtctgaac420
agctggaccaaggcggttaaaaccttcagctttcaagcggtgccgctgccgggtgcgttt480
ctgagccgtcagggtggcctgaacggtggcgcgttcaccgcgaccctgcaccgtcacttt540
ctgatgaagtgcggctggcaggtgcaagttcagtgcaacctgacccaattccaccagggt600
gcgctgctggttgcgatggtgccggagaccaccctggacgttaagccggatggcaaggcg660
aaaagcctgcaagagctgaacgaggaacagtgggtggaaatgagcgacgattaccgtacc720
ggcaaaaacatgccgtttcaaagcctgggtacctactatcgtccgccgaactggacctgg780
ggtccgaacttcatcaacccgtaccaagtgaccgtttttccgcaccagattctgaacgcg840
cgtaccagcaccagcgttgacatcagcgtgccgtatattggcgagaccccgacccaaagc900
agcgaaacccagaacagctggaccctgctggtgatggttctggtgccgctggactacaaa960
gagggtgcgaccaccgatccggaaatcaccttcagcgtgcgtccgaccagcccgtatttc1020
aacggcctgcgtaaccgttttaccaccggtaccgatgaggaacag1065
<210>2
<211>792
<212>dna
<213>senecavirusa
<400>2
agcaccgacaacgcggagaccggtgtgatcgaagcgggcaacaccgacaccgatttcagc60
ggcgagctggcggcgccgggcagcaaccacaccaacgtgaagttcctgtttgaccgtagc120
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gttgcgagccgtccggcgacccgttttggtctgtacgtgaacccgagcgacagcggcgtt300
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attccgcgtccgaacgagaagaaaagcaccgcggtgaagcacgtggcggtttacgtgcgt720
tataaaaacgcgcgtgcgtggtgcccgagcatgctgccgtttcgtagctacaagcagaaa780
atgctgatgcaa792
<210>3
<211>717
<212>dna
<213>senecavirusa
<400>3
ggtccgattccgaccgcgccgcgtgagaacagcctgatgttcctgagcaccattccggac60
gataccgttccggcgtacggtaacgtgcgtaccccgccggttaactatctgccgggcgaa120
atcaccgacctgctgcaactggcgcgtattccgaccctgatggcgtttggtcgtgttagc180
gagccggaaccggcgagcgatgcgtacgttccgtatgtggcggttccggcgcagttcgac240
gataagccgctgatcagctttccgattaccctgagcgacccggtgtaccaaaacaccctg300
gttggtgcgatcagcagcaacttcgcgaactatcgtggctgcatccagattaccctgacc360
ttctgcggtccgatgatggcgcgtggcaaatttctgctgagctatagcccgccgaacggt420
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ggtgaagactacaccctgcgtctgccggtggattgcaacccgagctatgtttttcac717