一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株及其制备方法与流程

文档序号：15655023发布日期：2018-10-12 23:44阅读：288来源：国知局

本发明属于动物疫苗技术领域，涉及重组狂犬病口服疫苗毒株，尤其是一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株，本发明还涉及该毒株的制备方法。

背景技术：

狂犬病是最古老的传染病之一，是由狂犬病毒(rabiesvirus，rv)引起的一种人畜共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率几乎达100％。据世界卫生组织报告，全世界每年有约55000人死于狂犬病，其中绝大多数分布在非洲和亚洲。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，多数是由于被动物咬伤而被感染。疫苗免疫是预防和控制狂犬病的最有效途径，当前广泛应用的狂犬病疫苗主要是原代细胞培养疫苗和传代细胞纯化疫苗等灭活疫苗，这些疫苗虽然免疫效果较好，但价格昂贵，而且主要采用的免疫方式为肌注免疫，这样对于一些流浪动物及野生动物的免疫接种则很难实现。在我国，街头的流浪狗、猫等动物为当前主要的传染源，因此，将流浪的动物进行有效的免疫是狂犬病防控的关键。

口服免疫是一种公认的易于实施的免疫方式，欧美许多国家已经将口服疫苗应用于野生动物的狂犬病防控。目前应用的口服疫苗主要有sad-b19(schneiderlg,coxjh,mullerwwetal.currentoralrabiesvaccinationineurope:aninterimbalance.revinfectdis1988,10suppl4:s654-659.wandelerai,capts,kappeleraetal.oralimmunizationofwildlifeagainstrabies:conceptandfirstfieldexperiments.revinfectdis.1988,10suppl4:s649-653.)、vr-g(kienymp,lather,drillienretal.expressionofrabiesvirusglycoproteinfromarecombinantvacciniavirus.nature.1984,312:163-166.brochierb,kienymp,costyfetal.large-scaleeradicationofrabiesusingrecombinantvaccinia-rabiesvaccine.nature.1991,354:520-522.fearneyhoughmg,wilsonpj,clarkkaetal.resultsofanoralrabiesvaccinationprogramforcoyotes.jamvetmedassoc.1998,212:498-502.hanlonca,niezgodam,hamiranetal.firstnorthamericanfieldreleaseofavaccinia-rabiesglycoproteinrecombinantvirus.jwildldis.1998,34:228-239)，和sag-2(flamanda,coulonp,lafayfetal.avirulentmutantsofrabiesvirusandtheiruseaslivevaccine.trendsmicrobiol.1993,1:317-320.cliquetf,robardete,mustketal.eliminatingrabiesinestonia.plosnegltropdis.2012,6:e1535.cliquetf,aubertm.eliminationofterrestrialrabiesinwesterneuropeancountries.devbiol(basel).2004,119:185-204.niine,barratj,kristianmetal.firstoralvaccinationofwildlifeagainstrabiesinestonia.devbiol(basel).2006,125:145-147.)等。但这些口服疫苗均存在许多不足，例如，sad虽然在欧美一些国家消灭了狂犬病在狐狸中的传播，但有研究表明sad对小鼠及本土动物具有致病性(winklerwg,shaddockjh,williamslw.oralrabiesvaccine:evaluationofitsinfectivityinthreespeciesofrodents.amjepidemiol.1976,104:294-298.)。sag-2为从sad株发展而来，是在sad株中突变2个氨基酸位点而使其致病性大大降低，但sag-2所产生的中和抗体水平较低(hanlonca,niezgodam,morrillpetal.oralefficacyofanattenuatedrabiesvirusvaccineinskunksandraccoons.jwildldis.2002,38:420-427.)。vr-g为痘病毒表达狂犬病g蛋白的重组毒株，虽然vr-g帮助欧美许多国家阻止了狂犬病在浣熊和狐狸等野生动物中的传播，但有研究表明，vr-g暴露给人可导致严重的皮肤炎症发应和全身的痘病毒感染(mempelm,isag,klugbauernetal.laboratoryacquiredinfectionwithrecombinantvacciniaviruscontaininganimmunomodulatingconstruct.jinvestdermatol.2003,120:356-358.rupprechtce,blassl,smithketal.humaninfectionduetorecombinantvaccinia-rabiesglycoproteinvirus.nengljmed.2001,345:582-586.centersfordiseasec,prevention.humanvacciniainfectionaftercontactwitharaccoonrabiesvaccinebait-pennsylvania,2009.mmwrmorbmortalwklyrep.2009,58:1204-1207.)。

此外，当前的狂犬病口服疫苗的免疫起始部位多为口腔，不能引起胃肠道的免疫反应(orciarila,niezgodam,hanloncaetal.rapidclearanceofsag-2rabiesvirusfromdogsafteroralvaccination.vaccine.2001aug14；19(31):4511-8.zhoum,zhangg,rengetal.recombinantrabiesvirusesexpressinggm-csforflagellinareeffectivevaccinesforbothintramuscularandoralimmunizations.plosone.2013may20；8(5):e63384.zhoum,wangl,zhousetal.recombinantrabiesvirusexpressingdoggm-csfisanefficaciousoralrabiesvaccinefordogs.oncotarget.2015nov17；6(36):38504-16.)。因此，研发一种安全有效价格便宜且可以增强胃肠道免疫反应的狂犬病口服疫苗将对狂犬病的防控起到重要作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株重组狂犬病口服疫苗毒株，该疫苗株不仅具有较高的复制滴度，较低的致病性，较好的免疫原性，而且口服免疫后可以降低胃肠道酸性环境和蛋白酶对病毒的降解，从而提高其在胃肠道的抗原递呈，诱导产生高水的中和抗体。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

所用的母本毒株lbnse来源于用于欧洲野生动物口服免疫用的疫苗株sad-b19，但在sad-b19毒株的g蛋白上将194位的天冬氨酸(aat)突变为丝氨酸(tcc)，将333位的精氨酸(aga)突变为谷氨酸(gaa)，从而大大减弱了病毒的致病性(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.rasalingamp,rossiterjp,mebatsiont,jacksonac.comparativepathogenesisofthesad-l16strainofrabiesvirusandamutantmodifyingthedyneinlightchainbindingsiteoftherabiesvirusphosphoproteininyoungmice.virusres.2005,111:55-60.conzelmannkk,coxjh,schneiderlg,thielhj.molecularcloningandcompletenucleotidesequenceoftheattenuatedrabiesvirussadb19.virology.1990,175:485-499.)。另外，还将基因组中g基因和l基因之间的假基因敲出，在g基因和l基因之间加入两个酶切位点bsiwi和nhei作为插入外源基因的位点。

合成u-omp19基因后插入到lbnse母本毒株基因组的g基因和l基因之间，构建出表达u-omp19的感染性克隆lbnse-u-omp19。

seqidno：1是母本毒株sad-b19的基因核苷酸序列；seqidno：2是u-omp19基因核苷酸序列；seqidno：3是本发明重组狂犬病口服疫苗毒株lbnse-u-omp19的基因核苷酸序列。

感染性克隆lbnse-u-omp19与分别表达狂犬病毒n、p、g和l四个蛋白的辅助质粒共同转染bsr细胞后，经免疫荧光证明拯救了可以表达u-omp19的重组狂犬病病毒。为了验证是否u-omp19已经插入到狂犬病毒基因组中，将拯救的病毒lbnse-u-omp19感染bsr细胞，然后提取病毒rna，用反转录pcr进行验证，证明了u-omp19已插入到狂犬病毒基因组中。

本发明中的重组病毒lbnse-u-omp19在bsr细胞及na细胞上的生长曲线与母本病毒lbnse相似，表明外源基因u-omp19的插入并没有影响到病毒的生长和增殖。另外，重组病毒lbnse-u-omp19在bsr和na细胞上的滴度分别可以达到10^8.25ffu/ml和10^7.75ffu/ml，达到了口服免疫滴度的要求。

将重组病毒lbnse-u-omp19以最高剂量脑内接种小鼠，小鼠未出现任何发病症状，表明该重组病毒无致病性，安全性高。

将表达u-omp19的重组狂犬病毒lbnse-u-omp19口服免疫可以诱导较高水平的中和抗体，显著高于母本毒株lbnse。

为了研究lbnse-u-omp19是否具有较强的耐酸和耐蛋白酶消化作用，我们利用灌胃方式直接将病毒送入胃肠道中，并检测其以此种极端方式免疫后的效果，结果表明lbnse-u-omp19灌胃免疫小鼠后可以使4只小鼠产生高水平的抗体，而lbnse灌胃后只有3只小鼠产生了低水平的中和抗体，二者存在显著差异，这表明u-omp19的表达具有一定的抗酸抗胃肠蛋白酶消化的能力。

此外，很多研究表明u-omp19可以作为布鲁氏菌病的亚单位疫苗，因此，本发明中的lbnse-u-omp19也具有开发为狂犬病、布鲁氏菌病二价疫苗的潜力。

总之，本发明提供的重组狂犬病口服疫苗毒株具有良好的复制性，安全性，并且通过u-omp19的插入增强了免疫原性，提高了耐酸和耐蛋白酶消化的作用，在口服免疫后可以诱导高水平的中和抗体，显著优于母本病毒lbnse，因此，lbnse-u-omp19可以作为狂犬病口服疫苗的候选株，也同时具有开发为狂犬病、布鲁氏菌病二价疫苗的潜力。

附图说明

图1重组病毒lbnse-u-omp19的感染性克隆构建策略示意图。

图2重组病毒lbnse-u-omp19的免疫荧光检测结果。

图3重组病毒lbnse-u-omp19的反转录pcr检测结果。

图4重组病毒lbnse-u-omp19在不同细胞系上的生长曲线。

图5重组病毒lbnse-u-omp19脑内感染小鼠后的体重变化(致病性)曲线。

图6重组病毒lbnse-u-omp19口服免疫icr小鼠后的中和抗体滴度。

图7重组病毒lbnse-u-omp19口服免疫攻毒后的保护率。

图8重组病毒lbnse-u-omp19灌胃免疫后的中和抗体滴度。

图9重组病毒lbnse-u-omp19灌胃免疫后的中和抗体滴度高于0.5iu/ml的比较分析。

图10重组病毒lbnse-u-omp19灌胃免疫攻毒后的保护率。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。

实施例1重组病毒lbnse-u-omp19的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒

母本毒株lbnse由华中农业大学农业微生物国家重点实验室保存，该病毒的具体信息和构建方法可参考有关文献(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.)。

1.1.2质粒

用于拯救母本毒株lbnse的感染性克隆plbnse的构建策略及具体方法可参考有关文献(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.)。

1.1.3细胞和单克隆抗体

bsr细胞(bhk-21细胞的一个克隆细胞系)，生长于含10％胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)(gibco,grandisland,ny)的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium,dmem)(mediatech,herndon,va)培养液。鼠神经瘤细胞(mouseneuroblastomacells,na)，生长于含10％fbs的rmpi1640培养液(mediatech)。异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,fitc)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体购自fujirebio(melvin,pa)公司。

1.1.4实验动物

6-8周龄的icr小鼠、balb/c小鼠，购于华中农业大学实验动物中心。

1.1.5主要试剂

胶回收试剂盒、质粒小提和大提试剂盒、rneasymini-kitrna提取试剂盒及superfect转染试剂盒均购于qiagen公司，各种限制性内切酶购于newenglandbiolabs,beverly,ma公司。superscript^tmrt-pcr试剂盒购于invitrogen公司。

1.2引物的设计与合成

用于扩增u-omp19的引物见表1，由上海金斯瑞公司合成

注：斜体加粗部分为限制性内切酶位点序列：u-omp19扩增上游引物加粗斜体序列为bsiwi，下游引物加粗斜体序列为nhei。

1.3重组病毒lbnse-u-omp19的拯救

参照实验室以前构建好的系统进行拯救，参见相关文献(weny,wangh,wuh,yangf,trippra,etal.(2011)rabiesvirusexpressingdendriticcell-activatingmoleculesenhancestheinnateandadaptiveimmuneresponsetovaccination.jvirol85:1634-1.)。具体如下：转染前一天将bsr细胞接种于六孔板，使细胞于第二天使用时达到80％的覆盖度，按照转染试剂superfect(qiagen公司)的产品说明说进行操作，将2ug的全长感染性克隆，0.5ugn辅助质粒，0.25ugp辅助质粒，0.15ugg辅助质粒以及0.1ugl辅助质粒共同转染bsr细胞，转染后的细胞放入37℃培养箱，co2浓度为5％，孵育4小时，然后将上清倒掉，用含10％fbs的dmem培养基洗一次，再加入新鲜培养基培养4天，把上清液转移到bsr单层细胞上，在34℃含5％co2的培养箱培养3天，收集上清，分装保存-80℃。

1.4拯救病毒的鉴定

1.4.1免疫荧光检测

将拯救的病毒与bsr细胞于96孔细胞板共培养48小时后，将上清弃掉，用预冷的80％丙酮于4℃固定30分钟，然后用pbs洗2遍，将异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,fitc)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体(购于fujirebio公司)进行1:70稀释，每孔加入50ul，放入37℃孵育1小时后用pbs洗三遍，在荧光显微镜(leicadmires)进行观察。

1.4.2反转录(rt)pcr检测

将拯救的病毒与bsr细胞共培养48小时后，将细胞刮下提取总rna，按照superscript^tmrt-pcr试剂盒说明(购于invitrogen公司)进行操作。

1.5病毒滴定

取96孔细胞培养板，以4行×9列为一个样品区，每板两个分区，将每个孔内加入90μl的含10％fbs的rpmi1640细胞培养液，每个样品设4个重复，将10μl的病毒原液加入到96孔细胞板的第一列，充分混合后吸取10μl混合液到第二列，充分混匀，再吸出10ul混合液到下一列，依次连续进行10倍的倍比稀释，至第9列孔后弃掉10μl的混合液。每孔加入5×10⁴的na细胞后于37℃，5％co2感作48h，然后弃细胞上清液，用80％冷丙酮(80％ice-coldacetone)固定感染细胞。以抗狂犬病毒n蛋白荧光抗体(fitc-conjugatedanti-rvnantibodies)染色后，通过荧光显微镜观察并记录抗原阳性区域(antigen-positivefoci)。根据reed-muench法进行病毒毒力的计算并记录为ffu/ml(fluorescentfocusunitspermilliliter)。

1.6重组病毒lbnse-u-omp19在bsr和na细胞上的生长特性

将病毒以感染复数为0.01(moi＝0.01)分别感染bsr与na细胞，分别在感染后第1天，第2天，第3天，第4天及第5天取50μl的上清液，进行病毒滴定，记录病毒在不同时间点的滴度，并绘制出生长曲线。

1.7动物实验

1.7.1重组病毒lbnse-u-omp19致病性实验

将6-8周龄的icr小鼠，每组10只，分别用40μl的dmem或者1×10⁷ffu的重组病毒lbnse，以脑内注射(i.c.)的方式进行感染，观察每天观察两次，记录小鼠的临床发病及死亡情况。

1.7.2lbnse-u-omp19口服和灌胃免疫后中和抗体测定实验

将icr小鼠分为6组，每组10只，用10⁷ffu的lbnse、lbnse-u-omp19分别进行口服和灌胃免疫，同时用相同剂量的dmem作为阴性对照，每周定期采血，持续5周，使用荧光抗体中和病毒试验(favn)测定狂犬病毒中和抗体滴度。

1.7.3lbnse-u-omp19口服和灌胃免疫后保护率实验

将icr小鼠分为6组，每组10只，分别用100μl的dmem、1×10⁷ffu的lbnse、1×10⁷ffu的lbnse-u-omp19以口服和灌胃两种方式进行免疫。在免疫后的第5周，脑内注射50×micld50的强毒株cvs-24进行攻毒，并在攻毒后记录小鼠的临床症状及死亡数量。

2.实验结果

2.1感染性克隆lbnse-u-omp19的构建及拯救病毒检测

如图1所示，重组病毒lbnse-u-omp19是在母本病毒lbnse的基础上，将u-omp19基因扩增并测序正确后插入到g基因和l基因之间，利用反向遗传技术拯救病毒，拯救的病毒用免疫荧光实验进行检测，如图2左图所示，可以看到绿色的荧光灶，即为拯救出的重组狂犬病病毒lbnse-u-omp19，而细胞对照(图2右图)则观察不到荧光灶。另外，为了检测u-omp19是否已插入到拯救的病毒中，将拯救的病毒感染bsr细胞后，提取rna进行反转录pcr检测，上游引物设计在u-omp19插入的位点bsiwi上游，下游引物设计在另一插入位点nhei的下游，具体引物序列见表1。如图3所示，可以看到1016bp的目的条带，说明u-omp19已经插入到狂犬病病毒的基因组。

2.2病毒的体外生长特性

为了研究u-omp19的插入是否影响狂犬病毒自身的复制及增殖，将母本病毒lbnse和lbnse-u-omp19同时感染bsr和na细胞，并且于不同时间点测定其病毒的滴度，绘制出病毒的生长曲线。如图4，可以观察到重组病毒lbnse-u-omp19和母本病毒lbnse具有相似的生长曲线，这表明外源基因u-omp19的插入并未影响病毒的复制和增殖，并且最高滴度与母本病毒也相差不大。重组病毒lbnse-u-omp19在bsr细胞和na细胞上达到的最高滴度分别为1×10^8.25ffu/ml和1×10^7.75ffu/ml，均在感染后第4天达到滴度最高值。

2.3重组病毒致病性

重组病毒lbnse-u-omp19脑内注射6-8周龄的icr小鼠中，观察3周，期间并未出现任何发病症状，且其体重变化要明显好于母本株lbnse，表明其对小鼠无致病性，且可以在一定程度降低病毒致病性，安全性高(图5)。

2.4重组病毒口服免疫效果评价

将重组病毒lbnse-u-omp19和母本毒株lbnse(欧洲用于野生动物免疫疫苗株)口服免疫6-8周龄icr小鼠，分别于免疫后2周，3周，4周，5周进行采血测定中和抗体滴度。诱导高的中和抗体水平是预防狂犬病的有效手段，因此中和抗体的测定作为狂犬病疫苗效果评价的方法。如图6所示，重组病毒lbnse-u-omp19诱导的中和抗体水平要显著高于母本毒株lbnse，在免疫后第3周中和抗体水平最高，可以达到6.98iu/ml，母本毒株lbnse的中和抗体水平在第3周最高，也只有1.15iu/ml。值得一提的是，在免疫后第2周时，lbnse诱导的中和抗体水平平均只有0.4iu/ml，低于狂犬病免疫保护最低要求滴度0.5iu/ml，而lbnse-u-omp19则可以诱导平均4.0iu/ml中和抗体。在免疫后第5周我们进行了攻毒实验，如图7所示，结果表明lbnse-u-omp19免疫的小鼠保护率为90％，而母亲病毒lbnse免疫小鼠保护率仅为56％，表明u-omp19的表达可以显著提高口服免疫保护率。

为了进一步验证lbnse-u-omp19的耐胃肠酸性环境和蛋白酶降解的能力，我们采取直接灌胃免疫的方式，使病毒直接进入胃肠道。如图8所示，lbnse-u-omp19灌胃免疫小鼠产生的中和抗体滴度要高于lbnse灌胃免疫的小鼠。此外，如图9所示，lbnse-u-omp19灌胃免疫后有4只小鼠的滴度高于0.5iu/ml(最高平均滴度为5.4iu/ml)，而lbnse灌胃小鼠产生的中和抗体滴度高于0.5iu/ml的只有3只，且最高平均滴度为1.6iu/ml，显著低于lbnse-u-omp19灌胃免疫组。在免疫后第5周进行攻毒实验，如图10所示，lbnse-u-omp19灌胃免疫组的保护率为60％，高于lbnse灌胃免疫组的40％，这表明u-omp19的表达具有一定的抗胃肠道环境和蛋白酶消化的作用。

总之，本发明中的重组狂犬病口服疫苗毒株lbnse-u-omp19对小鼠无致病性且一定程度降低病毒致病性，安全性高，在口服免疫效果上，与母本株lbnse相比，lbnse-u-omp19可以诱导产生显著高的中和抗体水平，最高可以达到.986iu/ml。同时，通过灌胃免疫表明lbnse-u-omp19还具有一定的耐胃肠道酸性环境和蛋白酶降解的能力，提高了胃肠道的免疫反应，从而提高了免疫保护率。因此，本发明重组病毒lbnse-u-omp19具备了作为疫苗株的高效、低毒的特点，可以作为一种耐胃肠道酸性环境和蛋白酶降解的狂犬病口服疫苗的候选株。

本发明的保护范围不局限于实施例，例如，实施例中采用lbnse为母本毒株，该毒株与其它狂犬病口服疫苗相比具有致病性低等优点，当然也可以采用其它的狂犬病口服疫苗毒株为母本，同样也能实现本发明增强免疫原性，提高耐酸和耐蛋白酶消化能力等目的。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株及其制备方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>11928

<212>dna

<213>狂犬病病毒sad-b19株(rabiesvirus)

<400>1

acgcttaacaaccagatcaaagaaaaaacagacattgtcaattgcaaagcaaaaatgtaa60

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