本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿萜烯合成酶、其编码基因、载体、多克隆抗体及其应用。
背景技术：
紫花苜蓿medicagosativa(rosales:leguminosae)属蔷薇目豆科，素有“牧草之王”的美称，是世界上应用最广、经济价值最高和栽培面积最大的一种优质蛋白饲料作物。在田间，紫花苜蓿更是多种农作物重要害虫，如苜蓿夜蛾、蚜虫、蓟马、盲蝽、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、马铃薯叶蝉、草地蝗虫、红蜘蛛、三叶草象鼻虫、小夜蛾、粘虫等的嗜好寄主，并对这些害虫具有强烈的引诱作用。
植物的挥发物是植食性害虫识别、定位寄主植物的重要信号物质，其种类众多、功能强大。在寄主植物挥发物众多种类之中，萜烯类挥发物是重要的一类参与植物-害虫-害虫天敌互作的种类，而萜烯合酶(terpenesynthase，tps)便是植物合成代谢萜烯类化合物的关键合成酶。因此，在植物体内克隆tps基因，研究其基因所编码的蛋白表达特征与害虫发生的关系，对于明晰tps介导的萜类信号物质在植物-害虫互作过程中的作用具有重要意义。本申请在温室大棚实验明确了6-8周紫花苜蓿可以显著诱集苜蓿夜蛾(相比3-5周幼苗期对照)，并在6-8周的紫花苜蓿叶片中成功克隆了一种tps基因的全长序列mstps，揭示了此基因的代谢产物可能是紫花苜蓿引诱苜蓿夜蛾的重要物质。然而，在植物体内实际行使功能的不是酶基因而是酶蛋白。因此，急需灵敏度高，特异性好的蛋白检测技术来分析紫花苜蓿mstps酶蛋白的表达量，从而明确mstps的蛋白表达与害虫发生的相关性，进而探索诱集寄主紫花苜蓿害虫的新型防控技术。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种紫花苜蓿萜烯合成酶。
本发明还要解决的技术问题是提供了用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体及其制备方法。
技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因，其碱基序列如seqidno：1所示。seqidno：1为紫花苜蓿萜烯合成酶的完整的基因序列。
本发明内容还包括一种紫花苜蓿萜烯合成酶，其氨基酸序列如seqidno：2所示。
其中，上述的用于编码紫花苜蓿萜烯合成酶的基因的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
其中，上述的重组表达载体，将所述的基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达紫花苜蓿萜烯合成酶的重组表达载体。
其中，上述大肠杆菌表达载体为pczn1。
本发明内容还包括一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。
其中，上述大肠杆菌为arcticexpress。
本发明内容还包括一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)、紫花苜蓿萜烯合成酶基因的开放阅读框cdna双链的pcr扩增；
2)、紫花苜蓿萜烯合成酶基因的原核表达载体构建；
3)、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的表达及蛋白电泳验证；
4)、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的变性与复性；
5)、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的分离、纯化即得到紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白并进行蛋白电泳验证。
本发明内容还包括一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体，将得到的紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白免疫新西兰大白兔后制得。
本发明内容还包括一种紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)、将紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白免疫新西兰白兔；
2)、抗原亲和纯化法获得针对紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体；
3)、紫花苜蓿萜烯合成酶蛋白的多克隆抗体效价的ellsa检测。
本发明内容还包括一种紫花苜蓿mstps蛋白多克隆抗体的表达量特异性westernblot检测方法，包括以下步骤：
1)、取温室六周培养紫花苜蓿提取的总蛋白及体外重组表达纯化的mstps蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、洗膜、封闭。
2)、用封闭液稀释一抗(本发明制作的mstps蛋白多克隆抗体)，膜在一抗稀释液中反应，洗膜，封闭液稀释羊抗兔的酶标二抗，膜在二抗中反应，化学发光显影。
有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：发明人首次通过克隆获得了编码紫花苜蓿萜烯合成酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，发明人首次成功克隆了编码紫花苜蓿萜烯合成酶基因，并构建了pczn1-mstps表达载体，通过arcticexpress菌体外诱导表达大量mstps重组蛋白；将原核表达纯化的mstps重组蛋白应用于免疫新西兰大白兔后制备了多克隆抗体，在通过利用elisa法确定了该多克隆抗体的效价后，发明人采用westernblot法发现该多克隆抗体能特异性识别原核表达纯化的mstps重组蛋白，可产生特异性免疫反应。基于此，发明人还建立了一套高效、高灵敏度和准确的westernblot方法，可特异性地从紫花苜蓿叶片内检测出mstps蛋白。
应用本发明，可为萜烯合成酶类酶蛋白在紫花苜蓿叶片内的组织分布以及该蛋白的快速检测和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。本发明为进一步系统研究紫花苜蓿与其诱集的害虫之间化学通讯的分子机制提供了坚实的研究基础。
附图说明
图1：mstps基因开放阅读框克隆电泳图；泳道1：为2000bp的dnamaker；泳道2：mstps基因开放阅读框靶标1719bp克隆条带；
图2：mstps基因开放阅读框构建表达载体pczn1后的酶切验证电泳图；泳道1：mstps基因开放阅读框构建表达载体pczn1后利用ndeⅰ与xbaⅰ的酶切图谱，其中1719bp的条带为目的基因的开放阅读框条带；泳道2：为5000bp的dnamaker；
图3pczn1-mstps利用iptg诱导表达经10％sds-page分析电泳图；泳道m：为蛋白maker；泳道1：未经诱导菌株的总蛋白；泳道2：经过诱导菌株的总蛋白；泳道3：经0.5mmiptg在11℃诱导靶标载体表达的总蛋白上清液；泳道4：经0.5mmiptg在11℃诱导靶标载体表达的总蛋白包涵体；
图4：mstps蛋白诱导表达，纯化后经10％sds-page电泳分析图谱；泳道m：为蛋白maker；泳道1：未纯化的总蛋白样品；泳道2：纯化后的洗脱液；泳道3：纯化后的mstps靶标蛋白；
图5：mstps蛋白特异性抗体纯化、电泳分离后，考马斯亮蓝染色图谱；
图6：利用mstps蛋白特异性抗体western杂交图谱；m：为200kd蛋白maker；泳道1：培养六周紫花苜蓿叶片组织内mstps蛋白western杂交图谱；泳道2：培养八周紫花苜蓿叶片组织内mstps蛋白western杂交图谱；泳道3：体外重组表达mstps蛋白western杂交图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1：mstps全长基因开放阅读框cdna的获得及表达载体构建
利用比较转录组测序技术分析3-5周及6-8周紫花苜蓿叶片内各种基因的表达情况(完成于北京诺禾致源科技股份有限公司)，获得6-8周紫花苜蓿相比3-5周对照特异性表达的802bptps的cdna片段序列。采用trizol法提取绿盲蝽总rna，选择电泳图谱良好并且od260/od280值在1.8-2.0之间的总rna样品合并进行mrna的纯化，反转录合成第一链cdna，pcr反应体系为：0.5μg总rna，0.5μloligo-dt18，2μl5×反应缓冲液，2μl10mmdntp，40urnasin，200usuperscriptⅱ，加ddh2o至10μl；pcr反应参数为：42℃30min，75℃30min，4℃5min。根据紫花苜蓿已测出mstps基因序列设计适用于pcr扩增的引物mstps-1-f(5′-catgagaccgcacttcactt-3′)及mstps-1-r(5′-aactctcccacgtctttcga-3′)，获得802bpmstps基因序列，该序列参见序列表中的seqidno：4所示，pcr反应体系为：2.5μl10×反应缓冲液，2μl25mmmg2+，2μl10mmdntp，0.5μltaqplusdna聚合酶(5u/μl，购于南京诺唯赞生物科技有限公司，货号p201-d1)，1μl10μm上游引物mstps-1-f，1μl10μm下游引物mstps-1-r，cdna模板1μl，加ddh2o至25μl；pcr反应参数为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，40个循环；72℃继续延伸10min；在根据获得的mstps基因的序列设计race引物mstps-race-5′r1(5′-taggatccgtgaggcatcccaatgacc-3′)、mstps-race-5′r2(5′-tgaacagagttaactcatctagagtccca-3′)，mstps-race-5′f1(5′-caacaaggtcactttgttcccgcagagg-3′)、mstps-race-5′f2(5′-gcctcgcatctaaacctggcaggggaa-3′)，扩增方法具体参见clontech公司的cdna末端的快速扩增(race)试剂盒的方法进行，pcr反应参数为：94℃30s，70℃180s，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃180s，5个循环；94℃30s，68℃30s,72℃180s，72℃继续延伸10min。电泳结果显示pcr扩增拼接后，利用mstps开放阅读框已知序列设计pcr扩增引物mstps-2-f(5′-atggcactgcatttgca-3′)及mstps-2-r(5′-ttaaaaaactttatcataaagcaag-3′)，获得mstps基因开放阅读框cdna序列(参见序列表seqidno：3所示)，pcr反应体系为：2.5μl10×反应缓冲液，2μl25mmmg2+，2μl10mmdntp，0.5μltaqplusdna聚合酶(5u/μl，购于南京诺唯赞生物科技有限公司，货号p201-d1)，1μl10μm上游引物mstps-2-f，1μl10μm下游引物mstps-2-r，cdna模板1μl，加ddh2o至25μl；pcr反应参数为：95℃5min；95℃30s，52.0℃30s，72℃120s，40个循环；72℃继续延伸10min，得到与预期大小1719bp相符的条带，并将pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的dna(图1)。将pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的dna，测序验证并采用ta克隆法与原核表达载体pczn1进行连接(mstps蛋白体外重组表达载体pczn1购置于南京钟鼎生物技术有限公司)，转入大肠杆菌dh5α感受态细胞(感受态细胞购于takara公司)，挑选单菌落培养，经菌落pcr鉴定为阳性的菌液提取载体进行酶切验证正确(图2)及序列测定正确的进行下一步mstps蛋白体外重组表达。
含有mstps蛋白开放阅读框的原核表达载体pczn1构建及检测方法为：测序正确的mstps蛋白开放阅读框胶回收纯化产物与pczn1在t4dna连接酶催化下连接。t4dna连接酶连接体系为：pczn1载体5.0μl，mstps蛋白开放阅读框胶回收纯化产物5.0μl，t4dna连接酶1.0μl(takara公司，350u/μl)，10×buffer缓冲液2.0μl，用ddh2o补足至20μl，16℃反应12-16h；酶切验证体系为：2种限制性内切酶ndeⅰ和xbaⅰ各1.0μl，10×buffert缓冲液2.0μl，含有mstps蛋白开放阅读框的pczn1质粒6.0μl，用ddh2o补足至20μl，37℃水浴3h。连接成功后的表达载体pczn1质粒经dna测序验证，验证成功的质粒dna序列翻译后如下：
mstps蛋白开放阅读框连接到表达载体后，由于pczn1自带his-tag标签，mstps体外重组蛋白便加上以上标签。
体外重组蛋白序列如下，单下划线区域为his-tag区域
mnhkvhhhhhhmalhlqsclsslkpqivptiaqlsqnfnnlkldslhiankwsinveeerrsalikqhrdlssnnnhseklevvkhelrnvgenslkglymidamqrlnidyhfeeeiesflrrqyvasacggsnhhnlhetalhfrllrqqghfvpaevfnkftnkdekfdpklgeningmidlfeashlnlagedildeagkfsrkilkekmaqfdfheakfvrrtleypfhknlpmftarnfyghlystnawfgsmkevakmdfsllqglhhqeivqiskwwrelglanelpyarnqplkwymwslgcltdptlseerieltkpisliyiiddifdiygtldeltlftevvsrwdidtdmeqlpnymktcfrvlydltnelsskiykkhgwdpkdslrktweslckaflveakwfgsgklpnaeeylkngivssgvhivlvhiffllgkgltkenvhtmdttlsiisapatilrlwddlgnaedenqqgndgsyvkclmmdqpeyyctrrratdevmnkisnawkslnqeclfdthfhkaftkvslnlarmvplmysyddkhslpglegyvhsllydkvf*
结论：mstps基因1719碱基的orf框被完全成功连接到原核表达载体pczn1中；mstps体外重组蛋白理论分子量为66.48kda，加上his-tag标签后重组蛋白理论分子量为67.99kda，连接后的载体简称为pczn1-mstps。
实施例2：pczn1-mstps载体转化大肠杆菌及iptg诱导表达
mstps蛋白体外表达的大肠杆菌arcticexpress购置于南京钟鼎生物技术有限公司。
转化：将pczn1-mstps质粒10μl加入100μl感受态arcticexpress菌中，置冰上20min；42℃热激90s，迅速置冰中5min，加入600μllb培养液；37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/mlamp的lb平板，37℃倒置培养过夜。
iptg诱导pczn1-mstps载体融合蛋白的表达：挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mlamp的3mllb培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；次日按1：100接种于50μg/mlamp的30mllb培养液中，37℃220rpm振摇至菌体od600为0.6-0.8(约2h)；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入iptg至终浓度分别为0.5mm，11℃220rpm振摇诱导12h融合蛋白表达；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，加适量te溶液(ph8.0)，震荡悬浮后加入等体积的2×sds上样缓冲液，100℃5min，sds-page电泳检测考马斯亮蓝染色分析(图3)。
结论：经0.5mmiptg在11℃诱导12h后，mstps基因可在pczn1载体中被诱导高效表达，主要以包涵体形式存在，上清表达量相对低。mstps体外重组蛋白加上his-tag标签的重组蛋白分子量约为66.20kda。
实施例3：重组蛋白包涵体的变性、复性与纯化
变性复性：将诱导表达后的培养菌液6000g低温离心10min，加入20mlripa裂解液(强)裂解液试剂盒中ripa裂解液(含有1mmol/l的pmsf，购于碧云天生物技术有限公司)重悬菌体沉淀，超声破碎(功率400w，工作4s，间歇8s，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液于4℃在10000g条件下离心20min，收集沉淀。使用包涵体洗涤液(20mmtris，1mmedta，2m尿素，1mnacl，1％tritonx-100，ph8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mmtris，5mmdtt，8m尿素ph8.0)溶解包涵体，4度放置过夜，继而在室温15000rpm条件下离心15min；向上一步溶液滴加20mmtris-hcl5mmedtabufferph7.8缓冲液，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于pbsph7.4溶液中透析过夜。
融合蛋白的ni柱亲和纯化：利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至ni-idabinding-buffer预平衡的ni-ida-sepharosecl-6b亲和层析柱；用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线(相关试剂购置于南京钟鼎生物技术有限公司)；用ni-idawashing-buffer(20mmtris-hcl，20mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；用ni-idaelution-buffer(20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用pbs(ph7.4)进行透析过夜，进而开展12％sds-page分析，结果如图4所示。
结论：获得高质量纯化后的mstps重组蛋白，纯化后的蛋白电泳仅呈现一条主带，其分子量约为66.20kda。
实施例4：动物免疫、多克隆抗体的纯化与鉴定
动物免疫：以实施例3中纯化后的mstps重组蛋白进行bca蛋白浓度测定后，免疫2只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400μg/次，2-3周免疫一次，免疫4-5次。采血检测，通过间接elisa方法确定抗血清针对mstps的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。
抗体纯化：
1.取出与mstps抗体相对应的抗原(mstps体外原核重组表达后的纯化蛋白)免疫亲和柱，用10倍胶体积的pbs过柱，平衡亲和柱；
2.将需纯化的mstps样品上样，流出液重复上样一次(样品是抗血清时，离心去除红细胞，10000rpm离心4min，取上清直接上样)，做好相应上样记录，收集流出液，放置4℃待检测；
3.上样结束后用10倍胶体积的pbs再次平衡亲和柱，洗出未与胶结合的杂蛋白，该过程中亲和柱流出端接紫外检测仪，至紫外吸收仪a值稳定，调节紫外检测仪上的t为100，0.5a为0；
4.先用ph5.0的洗脱buffer预洗脱非特异性结合的抗体，此时紫外检测仪示数一般不会有显著变化，可不收集抗体(若示数有明显升高，此时需要收集抗体，以便后期进行检测)，待紫外仪示数稳定后用ph1.5的洗脱液进行洗脱。当紫外仪示数升高时，收集抗体(此时收集的抗体为特异性抗体)。纯化后的抗体如果没有立即透析，则需将收集抗体的ep管放置在冰浴中，并事先加入一定量的中和buffer以中和洗出的抗体，约2ml抗体加100μl中和buffer，若是立即透析纯化的抗体可省去以上步骤；
5.洗脱时记录洗脱最高峰的值，洗脱结束后用20倍胶体积pbs平衡亲和柱；
6.洗脱的抗体用至少200倍抗体体积的pbs进行透析，4℃透析过夜，换液2-3次；
注：磷酸化的抗体，在血清上样过磷酸化亲和柱，洗脱的抗体过夜透析、测浓度后再过非磷酸化亲和柱，流出液为磷酸化抗体，洗脱的抗体为非磷酸化抗体。
7.取出透析后的抗体并检测抗体浓度，做好相应记录；
8.向纯化后的抗体加入20％nan3母液，比例为1000：1，使nan3终浓度为0.02％。将抗体放-20℃保存。留约50μg抗体样品，进行纯度鉴定、elisa、western等鉴定。
抗体鉴定：通过elisa检测纯化抗体的效价，利用bca蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定，并通过sds-page电泳，考马斯亮蓝染色观察抗体的纯度(图5)。
抗体鉴定具体操作如下：
1.根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记；
2.包被：用pbs包被液将mstps蛋白抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100μl，4℃冰箱过夜。
包被抗原：mstps蛋白；包被浓度：5μg/ml，100μl/孔；
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)。
3.封闭：包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。
取出酶标板，弃去内液，洗板1次。
4.一抗反应：纯化抗体按1/500，2倍稀释，每孔100μl，37℃恒温箱1h。
5.二抗反应：取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：羊抗兔-hrp【hrpgoatanti-ratigg(h+l)，购买于南京钟鼎生物技术有限公司，货号abp122】，1/5000。37℃恒温箱1小时。
6.显色：取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μltmb显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。
7.终止反应：每孔加入100μl1mhcl溶液终止反应。即刻在酶标仪450nm上读数，将od值大于设定阴性对照od值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。
本次免疫、纯化的mstps蛋白抗体效价大于512k，具体结果如下：
包被抗原：mstps蛋白；包被浓度：5μg/ml，100μl/孔；
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)；
二抗：羊抗兔-hrp，1/5000；抗体浓度：0.75mg/ml；
体积：4.0ml；缓冲液：磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.4)。
抗体间接elisa结果如下：
起始稀释度:1:500；效价即样品od/空白od>＝2.1的最高稀释度
8.纯化后抗体进行sds-page电泳，考马斯亮蓝染色，可见抗体纯化后纯度在90％以上，如图5。
结论：获得高质量的mstps蛋白特异性抗体，其效价大于512,000，抗体的浓度0.75mg/ml，抗体纯化后纯度在90％以上。
实施例5：紫花苜蓿组织中mstps蛋白表达量western-blot检测
紫花苜蓿培养：紫花苜蓿种子提供于江苏省农科院明达种子有限公司，光照培养箱培养六周、八周，提取蛋白开展western杂交实验，苜蓿培养条件为温度(25±4)℃，相对湿度70％±5％，光周期l∶d＝14∶10。
western杂交样品使用100g六周、八周紫花苜蓿所提取的蛋白样品，总蛋白提取使用南京钟鼎生物技术有限公司的总蛋白提取试剂盒。总蛋白的浓度测定参考bicinchoninicacid(bca)法，并稍加改进。western杂交流程根据sun等人(2014)的实验方法(cellstressandchaperones,2014,19(5):725-739)。蛋白样品在10％的sds凝胶中电泳分离，在tris-hcl缓冲液，100ma的电流中转膜3h，将蛋白质转移到nc膜上。nc膜在含有5％的脱脂奶粉的tbs-t缓冲液中37℃封闭1h。本发明中纯化的mstps蛋白抗体1∶1000稀释，37℃孵育nc膜1h，tbs-t缓冲液洗3次，每次5min。羊抗兔的酶标二抗1∶5000稀释【hrpgoatanti-ratigg(h+l)，购买于南京钟鼎生物技术有限公司，货号abp122】，37℃孵育nc膜1h，tbs-t缓冲液洗3次，每次5min。最后通过化学发光试剂盒(gehealthcare)进行显色，结果见图6。
结论：mstps蛋白特异性抗体可以用于western杂交分析不同时期紫花苜蓿组织中mstps蛋白的表达情况，其在六周、八周紫花苜蓿叶片组织中只杂交出一条明亮主带，表明mstps抗体在紫花苜蓿组织中可以特异性结合mstps蛋白。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>一种紫花苜蓿萜烯合成酶、其编码基因、载体、多克隆抗体及其应用
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2117
<212>dna
<213>紫花苜蓿萜烯合成酶(medicagosativaterpenesynthases)
<400>1
gattgattcattcatctatatctatatatagaatctgtgaccactacttgacttacgtat60
attcattcctttgccatggcactgcatttgcaatcatgcctttcctctttgaaacctcaa120
atcgtcccaacaattgcacaactttctcaaaactttaataatctcaagcttgattctctt180
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