本发明涉及兽用生物制品
技术领域：
，具体涉及一种防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法。
背景技术：
：星状病毒(astv)是一类无囊膜、呈球形、直径为28-30nm的单股正链rna病毒，基因组具有感染性，长6.4-7.9kb，该病毒的感染具有一定的流行性，可引起人或动物的肠炎、腹泻，有的伴有呕吐和腹痛。星状病毒科根据感染宿主的不同可分为哺乳动物星状病毒属和禽星状病毒属，禽星状病毒可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。鹅星状病毒(gooseastrovirus，gastv)，主要侵害幼龄雏鹅，该病已经在多个省份流行发生，使鹅的死亡率上升，极大危害我国养鹅业的健康发展。2017年2～12月，我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群爆发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于5～20日龄的雏鹅，死亡率可达50％以上。患病雏鹅体腔及关节发生严重尿酸盐沉积，卧地倦动，采食困难，造成雏鹅生长缓慢，料肉比升高，肉鹅出栏合格率显著降低，对肉鹅养殖业造成严重经济损失。经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鹅星状病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有igg类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白igg(eggyolkimmunoglobulins)，简称为igy。与血清抗体相比，卵黄抗体具有很多独特的优点：(1)无需采血，只需采集免疫高免鸡蛋卵黄纯化即可纯化得到卵黄抗体；(2)有良好的稳定性，耐热耐酸，且常温下仍能保持一定的活性；(3)治疗效果明显，特异性强，且可适应大规模生产；(4)安全、高效、无残留、温和环保。但由于该病在我国属于首次报道，目前尚无商品化的疫苗及抗体上市，用于该新型鹅星状病毒的紧急预防和早期感染治疗的卵黄抗体更是未见报道；而且由于卵黄中含有大量的脂质，给使用带来许多不便，这也制约了防治该新型鹅星状病毒的卵黄抗体的研制与应用。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体，用于预防和治疗鹅群爆发的新型鹅星状病毒感染，从而弥补该疾病造成的严重经济损失。本发明的另一目的是提供该防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体的制备方法。该制备方法易于操作，适合大规模生产；而且制备的卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性强，无药物残留，温和环保，对新型鹅星状病毒感染的预防及治疗极具应用价值。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明是基于从具有痛风症状的患鹅体内分离得到的一株新型鹅星状病毒，保藏编号为cctccno：v201808，在该分离株的基础上，研制了能够防治该新型鹅星状病毒的灭活疫苗，利用该灭活疫苗高强度免疫健康蛋鸡，然后分离免疫后鸡蛋卵黄，提取制备卵黄抗体。具体的：本发明的第一方面，提供一种防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体，所述卵黄抗体含有抗鹅星状病毒株抗体；所述鹅星状病毒株的保藏编号为cctccno：v201808。本发明的第二方面，提供上述卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)用保藏编号为cctccno：v201808的鹅星状病毒作为疫苗生产毒株，制成灭活疫苗；(2)用制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；(3)由高免蛋收集卵黄，经一次灭活、酸化萃取、二次灭活、粗滤、除菌过滤、浓缩和三次灭活后，制备成防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体。优选的，步骤(1)中，所述灭活疫苗由如下方法制备而成：将保藏编号为cctccno：v201808的鹅星状病毒接种spf鸡胚，收集24-120h内死亡鸡胚尿囊液，获得病毒液；将病毒液浓缩至病毒含量≥105.0eld50，浓缩后的病毒液经甲醛灭活，加入tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和span-80混合作为油相，将水相和油相按体积比1:1混合，乳化，制得灭活疫苗。优选的，步骤(2)中，用制备的灭活疫苗分4次对产蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周。免疫途径为颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗。优选的，步骤(3)中，所述一次灭活具体为：将卵黄液与水按体积比1:(0.5～1.5)混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min。优选的，步骤(3)中，所述酸化萃取具体为：向卵黄稀释液中加入所述卵黄稀释液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后过滤收集滤液。进一步优选的，所述醋酸盐缓冲液的ph值为4.8-5.2；更优选为5.0。优选的，步骤(3)中，所述二次灭活具体为：向酸化萃取后的滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％，搅拌30-120min，搅拌后于2～8℃放置4～8小时。优选的，步骤(3)中，所述粗滤具体为：先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清。进一步优选的，所述滤布是丙纶750b滤布。优选的，步骤(3)中，所述除菌过滤具体为：用0.22μm滤膜过滤除菌。优选的，步骤(3)中，所述浓缩具体为：利用30～50kd的pes中空纤维超滤膜在2～8℃条件下进行浓缩，至抗体效价不低于1:512。优选的，步骤(3)中，所述三次灭活具体为：加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.1％，37℃灭活16h。本发明的第三方面，提供上述卵黄抗体在制备用于预防和/或治疗鹅星状病毒感染的制品中的应用。所述鹅星状病毒的保藏编号为cctccno：v201808。本发明的有益效果：(1)本发明利用从发病雏鹅体内分离得到的一株新型鹅星状病毒，该新型鹅星状病毒株具有优异的免疫原性，能够在鸡胚中稳定的传代，针对当前地方流行的以痛风为主要症状的新型鹅星状病毒感染具有更好的保护性。(2)用保藏编号为cctccno：v201808的鹅星状病毒作为疫苗生产毒株制备灭活疫苗来免疫蛋鸡，可以高效的获得卵黄抗体，该卵黄抗体的安全性好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应；而且能够有效的预防和治疗新型鹅星状病毒的感染，具有很好的商品化开发前景。(3)本发明对卵黄抗体的制备工艺进行了优化，收集高免鸡蛋卵黄后先进行初步灭活，而后以醋酸盐缓冲液进行酸化萃提，再以辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后以甲醛进行三次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。以上通过酸化水-辛酸方法有效降低了终产物中脂类的含量，降低了不良反应的风险，同时超滤浓缩步骤有助于保证溶液中抗体效价，提高保护率；较高的抗体效价在未来临床应用时需要较高的稀释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。附图说明图1：本发明的病毒分离株n-astv-sdpy接种鹅胚病变：a正常生长状态下的鹅胚；b为sdpy分离株导致的鹅胚病变。图2：pcr鉴定结果；图中，m为2000bpmarker，泳道1为空白对照，泳道2为astv，泳道3为astv，泳道4为aiv，泳道5为ndv，泳道6为arv，泳道7为gpv，泳道8为gpov，泳道9为gocv。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
背景技术：
所介绍的，2017年起，我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群爆发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。该病的症状不同于以往的星状病毒感染，首次在鹅群中出现了痛风的症状，由此推知，该传染性疾病可能是由新型星状病毒所引起的。目前尚无能够有效控制该新型星状病毒感染的药物和方法。采用星状病毒灭活疫苗接种是防治该病感染与爆发的有效措施，但前提是需要分离获得免疫原性优异的鹅星状病毒毒株。由于星状病毒为rna病毒，有多个分段，不同毒株间在抗原结构、致病性、细胞培养特性以及宿主特异性上存在一定的差异，在遗传进化时，容易发生变异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的以痛风为主要症状的鹅星状病毒感染。本申请发明人从病死雏鹅的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离出一株新型病毒n-astv-sdpy，经鉴定该新型病毒n-astv-sdpy为鹅星状病毒。本发明对毒株n-astv-sdpy进行了全基因组测序，并与现有报道的星状病毒进行了同源性分析和遗传进化分析，结果发现，毒株n-astv-sdpy各基因片段的同源性均小于70％；遗传进化分析表明，毒株n-astv-sdpy处于一个变异分支；以上结果说明：毒株n-astv-sdpy不同于其他的星状病毒，为禽星状病毒属的一个新的种。并将该新型鹅星状病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201808。由于疫苗免疫是以预防为主，免疫后产生抗体所需时间长，在鹅群发病时难以进行及时、快速治疗。基于此，本发明通过分离的新型鹅星状病毒来制备疫苗免疫蛋鸡，采集高免鸡蛋制备卵黄抗体，以用于新型鹅星状病毒的紧急预防和早期感染治疗。在本发明的一个实施方案中，给出的防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体由如下方法制备而成：(1)取新型鹅星状病毒高免鸡蛋卵黄，搅拌均匀得到卵黄液；(2)将步骤(1)所述卵黄液与水按1:(0.5～1.5)(v/v)比例混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min；(3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后滤布过滤收集滤液；(4)向步骤(3)所述滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％(v/v)，搅拌后于2～8℃放置4～8小时；(5)取步骤(4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；(6)取步骤(5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醛至终浓度0.1％(v/v)，于35～37℃灭活12～20小时。作为优选，步骤(1)所述的新型鹅星状病毒高免鸡蛋是利用新型鹅星状病毒灭活疫苗分4次免疫母鸡后所产鸡蛋，每次免疫间隔2周；进一步优选，所述免疫途径为颈部皮下或肌肉注射新型鹅星状病毒灭活疫苗。作为优选，步骤(1)所述新型鹅星状病毒高免卵黄液中，新型鹅星状病毒抗体效价不低于1:1024。作为优选，步骤(1)中先对所述高免鸡蛋进行蛋壳消毒，而后收集卵黄；进一步优选的，所述消毒方法为先以1％新洁尔灭溶液浸泡消毒15min，蛋壳干燥后再喷洒75％酒精至蛋壳表面。作为优选，步骤(1)中所述的水，是先于80℃保持30min，而后冷却至65℃以下的注射水。作为优选，步骤(2)所述的醋酸盐缓冲液ph值为4.8～5.2，更优的是5.0。作为优选，步骤(3)所述的搅拌，其持续是30～120min，更优的是90min。作为优选，步骤(3)所述的滤布是丙纶750b滤布。作为优选，步骤(4)所说的搅拌，其持续时间是30～120min，更优的是90min。作为优选，步骤(5)所述的过滤是先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清；进一步优选的，所述滤布是丙纶750b滤布。作为优选，步骤(6)中用于过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。作为优选，步骤(6)除菌后的澄清滤液中新型鹅星状病毒抗体效价不低于1:512。作为优选，步骤(6)中除菌后先进行超滤浓缩，而后再加入甲醛灭活；进一步优选的，所述超滤浓缩是利用30～50kd的pes中空纤维超滤膜实现的；进一步优选的，所述浓缩是在2～8℃条件下进行的。在以上技术方案中，收集高免鸡蛋卵黄后先进行初步灭活，而后以醋酸盐缓冲液进行酸化萃提，再以辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后以甲醛进行三次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。以上通过酸化水-辛酸方法有效降低了终产物中脂类的含量，降低了不良反应的风险，同时超滤浓缩步骤有助于保证溶液中抗体效价，提高保护率；较高的抗体效价在未来临床应用时需要较高的稀释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；d.l.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。本发明实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；本发明实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1：新型鹅星状病毒的发现和鉴定1.材料与方法1.1病料采集与处理：取病死雏鹅肝脏、脾脏和肾脏等组织，按照1:4的比例加入无菌的生理盐水进行匀浆处理，将匀浆液置于冰箱反复冻融3次，6000r/min离心15min后取上清液，经0.22μm滤器过滤细菌后-20℃保存备用。1.2主要试剂：鹅胚购于山东聊城某鹅场，rna提取试剂盒购于北京康为世纪有限公司，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京全式金公司，反转录试剂盒购于宝生物(大连)有限公司，2×estaqmastermix购于北京康为世纪有限公司，dl2000marker购于宝生物(大连)有限公司。1.3引物设计：根据美国国家生物技术信息中心建立的基因序列数据库genbank上所有星状病毒基因序列设计扩增601bp片段的特异性引物一对，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。上游引物：5′-tggtggtgyttyctcaara-3′；下游引物：5′-gyckgtcatcmccrtarca-3′。注：y、k、m、r为简并碱基。其中y代表c/t；k代表g/t；m代表a/c；r代表a/g。1.4病毒分离：将获取的组织样品处理液经绒毛尿囊腔途径无菌接种13日龄鹅胚，0.2ml/枚；并用无菌生理盐水设置阴性对照，37℃孵育。每天照胚两次，弃掉24h内死亡鹅胚，连续观察6天。将死亡鹅胚置4℃过夜处理后无菌收取尿囊液，并观察胚体变化。组织处理液盲传三代进行后续检测。1.5pcr鉴定：1.5.1rna提取：将1.4中收获的病毒液按照rna提取试剂盒说明书要求，提取病毒rna，置于-20℃保存备用。1.5.2反转录获得cdna：所用反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的货号为rr036a的primescripttmrtmastermix，在200μlpcr反应管中依次加入5×primescriptrtmastermix×2μl，步骤1.5.1中提取的待测样品totalrna～2μl，使用rnasefreedh2o补充至10μl体系。置于pcr仪中进行反应，反应条件为37℃15min；85℃5s之后，4℃保存。1.5.3pcr扩增：采用20μl体系进行扩增：模板cdna×2μl，上、下游引物各×1μl，2×estaqmastermix×10μl，采用ddh2o补充至20μl体系。混匀并瞬离后置于pcr仪进行反应，反应条件为95℃，5min，之后95℃，45s，68℃，30s，72℃，45s进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。2.结果：2.1病毒分离：采集的阳性肝脏、肾脏混合组织匀浆经过处理，经绒毛尿囊腔途径无菌接种13日龄鹅胚，0.2ml/枚；并用无菌生理盐水设置阴性对照，37℃孵育。在接种鹅胚2-5天出现了鹅胚死亡(见图1)，同批次空白对照鹅胚正常。2.2pcr鉴定结果：用引物进行pcr扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值601bp大小相符的特异性条带(图2)。表明分离株的细胞培养物中存在新型星状病毒(astv)。另外对分离株进行的常规鹅源病毒检测，包括：禽流感病毒(aiv)、新城疫病毒(ndv)、呼肠孤病毒(arv)、鹅细小病毒(gpv)、鹅多瘤病毒(gpov)及鹅圆环病毒(gocv)，并未检测到其他病毒污染(图2)。最终分离得到一株稳定的毒株，将该毒株命名为n-astv-sdpy。采用二代测序技术对毒株n-astv-sdpy进行全基因组序列测定，该毒株的全基因组序列如seqidno.1所示。然后与现有技术中已公布的星状病毒进行同源性比对和遗传进化分析。结果表明，毒株n-astv-sdpy各基因片段的同源性均小于70％；遗传进化分析表明，毒株n-astv-sdpy处于一个变异分支；以上结果说明：毒株n-astv-sdpy不同于其他的星状病毒，为禽星状病毒属的一个新的种。将该病毒进行保藏，保藏编号为cctccno：v201808。实施例2：灭活疫苗的制备(1)病毒增殖程序：将实施例1分离的新型鹅星状病毒株按照0.2ml/枚的剂量接种9日龄健康spf鸡胚，弃去24h内死胚，收集24～120h内死亡鸡胚尿囊液，获得病毒液，-20℃保存。(2)病毒液浓缩：将收获的病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩至原体积的1/3，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无菌生长，并留样备测毒价。病毒液每0.1ml病毒含量应≥105.0eld50，浓缩后的尿囊液随即进行灭活。(3)灭活：将浓缩后的病毒液导入灭活罐中，加入10％甲醛溶液使其终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃密封灭活24小时(以罐内温度达到37℃开始计)，其间每隔4～6小时搅拌一次，灭活后，置于2～8℃保存备用。(4)灭活疫苗制备：1)油相制备：取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加span-806份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。2)水相制备：将灭活后检验合格的病毒液96份加入4份灭菌tween-80，开动匀浆机搅拌20～30min，使tween-80完全溶解。3)乳化：油相与水相比例为1:1(v/v)，先将油相导入胶体磨，2500转/分钟搅拌，缓慢加入水相，加完后10000转/分钟乳化5分钟。在终止乳化前按疫苗总量0.01％加入硫柳汞，充分振荡混匀。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底无水相析出。无菌分装后，轧盖贮存于2～8℃。对制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度和无菌的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(w/o)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。实施例3：新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备1.采用灭活疫苗免疫产蛋鸡：将实施例2制备的新型鹅星状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，二免后14天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，三免后14天进行加强免疫,每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，加强免疫之后14天，采集卵黄测定新型鹅星状病毒中和抗体效价应≥1:1024。2.卵黄抗体制造：(1)蛋壳消毒：收集高免鸡蛋浸泡于1％新洁尔灭溶液中15min。取出后自然晾干或吹干后，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒备用。(2)卵黄分离：采取机械打蛋方式，打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。(3)灭活ⅰ：将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水(注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下)，搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。(4)酸化萃提：先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的ph值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机，充分拌搅30分钟。(5)灭活ⅱ：卵黄液液中加入终浓度(v/v)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90min，2～8℃放置4～8小时。(6)粗滤：用丙纶750b滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。(7)除菌过滤：用0.22μm滤膜过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测新型鹅星状病毒的中和抗体效价。(8)浓缩：如检测的新型鹅星状病毒的中和抗体效价低于1:512，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50kd的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩后的新型鹅星状病毒中和抗体效价应均不低于1:512。(9)灭活ⅲ：将浓缩后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(v/v)为0.1％，37℃灭活16小时。(10)分装贮存：在无菌条件下将灭活好的滤液分装于无菌玻璃瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，保存备用，保存温度为-20℃。实施例4：卵黄抗体质量检验1.安全性检验：用1-3日龄易感雏鹅(新型鹅星状病毒母源抗体均＜1:4)10只，各肌肉分点注射本发明实施例3制备的卵黄抗体2.0ml，观察14日，易感雏鹅全部健康存活，说明本发明的卵黄抗体的安全性好。2.无菌检验：按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)进行，结果为：无细菌、支原体和外源病毒污染。3.效力检验(免疫攻毒法)：5日龄易感雏鹅(新型鹅星状病毒母源抗体均＜1:4)20只，随机分为a、b四组，每组10只。其中，a为免疫组，颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只0.5ml；b为攻毒对照组，皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.5ml。隔离饲养。16小时后，a、b两组雏鹅分别肌肉注射用生理盐水做10倍稀释的新型鹅星状病毒(保藏编号为cctccno：v201808)，每只0.5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鹅发病、死亡情况。结果：a组攻毒后10/10保护；b组攻毒12小时后开始发病，10日内死亡9只。实施例5：卵黄抗体的应用1.在对新型鹅星状病毒预防中的应用以3-5日龄易感雏鹅(新型鹅星状病毒母源抗体均＜1:4)30只为试验对象，随机分为三组，每组10只。其中：试验组：颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只0.5ml；对照组：以目前市售的禽星状病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，并按实施例3的方法制备得到卵黄抗体，颈部皮下或肌肉注射该卵黄抗体，每只0.5ml；空白对照组：皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.5ml。将上述三组雏鹅隔离饲养，16小时后，分别肌肉注射用生理盐水做10倍稀释的新型鹅星状病毒，每只0.5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鹅发病、死亡情况。结果见表1。表1：组别攻毒毒株预防保护试验组新型鹅星状病毒10/10对照组新型鹅星状病毒5/10空白对照组新型鹅星状病毒1/10注：预防保护为攻毒后健康存活雏鹅数/雏鹅总数。由表1可以看出，本发明的卵黄抗体具有极佳的预防保护效力，对于该新型鹅星状病毒能够提供100％的预防保护，保护效力优于采用现有的灭活疫苗制备的卵黄抗体。2.在对新型鹅星状病毒治疗中的应用在新型鹅星状病毒感染发病区，症状为肾炎、痛风，以病程相近的30只雏鹅为试验对象，随机分为3组，每组10只，全部隔离饲养，其中：试验组：颈部皮下或肌肉注射实施例3制备的卵黄抗体，每只1.0ml；对照组：以目前市售的禽星状病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，并按实施例3的方法制备得到卵黄抗体，颈部皮下或肌肉注射该卵黄抗体，每只1.0ml；空白对照组：皮下或肌肉注射生理盐水，每只1.0ml。观察10日，记录每组雏鹅病情、死亡情况。结果为：试验组注射卵黄抗体2天后，患病雏鹅的采食量开始增加，精神状态明显好转，10日内未有雏鹅死亡；10日后将其中1/2的雏鹅扑杀并解剖，结果发现患病雏鹅体腔及关节内尿酸盐沉积已基本消失。对照组注射卵黄抗体后，患病雏鹅的采食量和精神状态未有显著好转，从注射卵黄抗体第5日开始有患病雏鹅死亡，10日内患病雏鹅的死亡率为60％；10日后将存活的雏鹅的1/2扑杀并解剖，结果发现患病雏鹅体腔及关节内尿酸盐沉积仍少量存在。空白对照组的患病雏鹅10日内的死亡率达90％。以上试验结果表明，本发明的卵黄抗体安全性好、预防效果好、治愈率高，可以用于新型鹅星状病毒感染的防治，具有重大的经济和社会效益。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。sequencelisting<110>山东农业大学<120>一种防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法<130>2018<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>7252<212>dna<213>鹅星状病毒（gooseastrovirus）<400>1tgtagcctctgtgttttcgcttcctgcgcatcaaggcacgccttctcacccaaattcata60aggtttgcaccaatatcgggtgaccatgttggtttggtgacatcatcggcgaaaaagaga120ccatacctcccattgtcaaccccttttcctcacttgacactcgtgaggaaaggaagactg180atgagattcagtcaggccttgagaaggtcttccacttcaatggtgttaatgaattataca240ccaagatgaaaggcttttatggtcgcactccagcctggagtgctctcatgaagtgtaatg300ccatctatcttaaagattggaaaacagctataggggttgacaatgggaggtatggtctct360ttttcgccgatgatgtcaccaaaccaacatggtcacccgatattggtgcaaaccttatga420atttgggtgagaaggcgtgccttgatgcgcaggaagcgaaaacacagaggctacaatgct480cgctgaaacgatgtggagctcttgtccaacaagttcttgagaagagcaaacaagcaaagg540aacaaatgcaaaaagccgaggaattacagaagaagattgatcaaattaatgaaagcaaca600aggttctacatcgcaaaatgcaggagagaaatgttgagtattctcagaaggtcataactc660gtattcatgagctgcaaaaagacagagacctgtggatgtcgcgtgctgctcattacgagc720aggagaacgtgcggctacgtattcaactggggacatatgatccgaacaggtctaagctga780tgactttcctagcatggatgtgtgttgcgatcattgctttcagcttgattcaattggcgg840atgctagtgagattaaggataacagaacagaaaattgtttcccaacatctggctgtgttc900tctcagacgttccttggactaagtcgtacacctttatggagctaatggacaagtgtgtga960ccggtactgccatcatacctaaaaacacatttaatggtgaagggcttgagctggagtgta1020ttaagaattttggcaagaaatggtgcaaaggaagggttgagaagctcataccgcattatt1080gtgatagagataatacttttgatgccctctatcagtattatgttgaaacagtagcaattg1140ctgttgacttctttaaagttgcggtgcagtatcggattgacaattggattgtggctctct1200ttagtctagtattgactgggaagatggagaagtttcttaagacgctaccctttgtaattt1260tggcatggtggtttaagttgcccatctttgttatgagcattgccacgacaatctttcctg1320tgcatgctctgccattcttgttcttccaggtgtgctttccaaactttgtcatcatcactg1380gttttctcttgtggatgacctctatattagtggctttttattggtttgatgggactgcaa1440ttttggttgaggtttcttatgcggtattctatactattatcttctttgtgtggtctacag1500cattgacaattatttcaactttgtcattgacagtccctgtacagattttattattctgtg1560tttcattaaccatttattgtggcacaaagtttgcgtgttccactattacagtcactaatc1620ctgacggtactgtgtcgaaatactcaagagttgccaaaatgaaggatactgttgccatac1680agtgcaaaaagatggtgagctttgggcaggcccgtggtgtgataccagcaactccagtga1740aggtgaattccattgtcgttgttgaaggaaaaaaaggttcaggggttggcttccggttca1800tgaattatataattacagcaggacacgtcacattaggctctgactgggtaacagtaaaac1860atgctggcacagtagccaaaacaaaagtcctgaagcagattgaggtgtttgagtgcgtcg1920atacaatagcggttataaagctgccccccgaattacagaatttgaaacccataaaactcg1980caaaacgtgttgagtccacatacttaacattgacagcttttgatcctaattttcaaaatg2040ttgtgtcatacactggctggtgtattattgatggaaattggatcagtaatgcatttaata2100ctcaatttggaaacagtggtggcccatacgttgatgcagagggtaaattggttgggattc2160atcttggaactcagggagttatgtcccaaggtattgttgtggtggatgcccttaaaacgc2220atttcacgctcgcagaccagtgcaaggattttgattatgatggcttcctggagaaagtta2280ttgcaggaacaaagacatcacatgaagcaattctcaaaggtattgaggaattgcgagagg2340acgtcgacacgctcaagaacaagtgcaagaattatgatgagtactggcttgttcaaacta2400tttttggccagaagaaaaagggcaaaacaaagaaaacagcccgggggaataaacatcttg2460taacaaagagattcctgagtaaaggccacttcatgaaactcaaaatgctcaccgatgagg2520aatataatcatatgattgagcaaggtttcaccgctgatgagatacgtgaggcagtcaatg2580agctgagagaacaagcatggctcaactactgcattgataatgatattgatgaagaaggtg2640cggaagagtggtatgaagatatgattgaagatgaccaaattaatgaaaagattgatgaag2700ccattgagaaagcaatggaagaaaggggcgagttttatcaagtcaaaaaaaggaaa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