本发明涉及甘草次酸的衍生物，具体涉及一种含哌嗪结构的甘草次酸衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的用途。
背景技术：
甘草次酸(glycyrrhetinicacid，简写ga)是一种从传统中草药甘草的根茎提取出来的五环三萜类化合物，主要以18-β-甘草次酸为主。通过不断的研究发现甘草次酸及其衍生物具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、降血脂、促进胰岛素吸收等多方面的作用。但是甘草次酸本身对肿瘤的抑制作用非常微弱，因此，如何对其结构进行改进增强活性是值得解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种含有哌嗪结构的甘草次酸衍生物，对癌细胞具有明显的抑制作用；本发明同时提供了含哌嗪结构的甘草次酸衍生物的制备方法，并且提供的方法科学合理、简单易行，反应步骤少，产率高，适合工业化生产。
本发明的技术方案如下：
本发明所述的含哌嗪结构的甘草次酸衍生物，其结构如式(i)所示：
式(i)中，r为：
其中，r1选自未被取代的c1-c3烷基、被1～2个苯或卤代苯取代的c1-c3烷基、苯、邻位或对位被下组取代基取代的苯：c1-c3烷基、卤素、硝基、三氟甲基；
r2选自未被取代的c1-c3烷基。
进一步的，r1选自未被取代的c1-c2烷基、被2个苯或卤代苯取代的c1-c2烷基、对位被下组取代基取代的苯：c1-c2烷基、卤素、硝基、三氟甲基；r2选自未被取代的c1-c2烷基。
进一步的，卤素为氯、氟或溴；卤代苯中的卤素为氯、氟或溴。
具体的，甘草次酸衍生物结构中的r选自以下取代基：
本发明还提供了所述的含哌嗪结构的甘草次酸衍生物的制备方法，包括：
(1)将甘草次酸分散于甲醇中，加入浓硫酸进行反应，制得产物a；
(2)将产物a分散于二氯甲烷中，加入溴乙酰溴进行反应，制得产物b；
(3)碱存在下，产物b和不同取代基的哌嗪分散于有机溶剂中进行反应，制得所述的甘草次酸衍生物。
步骤(1)中，所述反应的时间为8～16h，进一步为12h，反应温度为65～90℃，进一步为75℃。
步骤(2)中，所述反应的时间为1～5h，进一步为1～2h，反应在冰浴条件下进行；产物a甘草次酸甲酯与溴乙酰溴的摩尔比为1:1～2，进一步为1:1.2。
步骤(3)中，碱为碳酸钾或三乙胺；所述反应的时间为6～10h，反应温度为80～90℃；有机溶剂选自乙腈、乙醇，产物b与不同取代基的哌嗪的摩尔比为1:1～1.5。
所述不同取代基的哌嗪选自n-甲基哌嗪、苯基哌嗪、4-甲基苯基哌嗪、2,4-二甲基苯基哌嗪、2-甲氧基苯基哌嗪、4-甲氧基苯基哌嗪、3-甲氧基苯基哌嗪、对三氟甲基苯基哌嗪、2-氟苯基哌嗪、3-氯苯基哌嗪、3,4-二氯苯基哌嗪、4-硝基苯基哌嗪、二苯基甲基哌嗪或4-氯二苯基甲基哌嗪。
本发明的含有哌嗪结构的甘草次酸衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，因此本发明的含有哌嗪结构的甘草次酸衍生物可以用于制备抗癌(如肝癌、乳腺癌)药物。
本发明还提供了一种药物，含有所述的甘草次酸衍生物。药物还含有药学上可添加的辅料，制成相适应的剂型。
本发明抗肿瘤甘草次酸衍生物是pparγ的激动剂，将哌嗪环引入甘草次酸的c3位，可以增强甘草次酸的各类生物活性，本发明甘草次酸衍生物的苯基哌嗪取代基能够有效地和pparγ的h12螺旋形成的活性口袋约束腔结合，起到类似于“船锚”的作用，把分子锚定在pparγ上；甘草次酸的主体骨架则位于约束腔的开口附近，可以形成强有力的氢键来增强小分子与pparγ结合的稳定性；甘草次酸30位羧基被甲酯取代后能够延伸到pparγ的h12螺旋约束腔的后侧，进一步增强与pparγ的亲和性，起到良好的抗肿瘤作用。本发明挑选出抗肿瘤活性最优的化合物(实施例1)做了pparγ在mcf-7细胞中的western-blot实验，我们对western-blot实验数据(图1)进行整理，做成柱状图(图2)，从图中我们可以很清晰的看出，药物作用浓度越大，pparγ的表达量越高，说明实施例1可以增强pparγ蛋白的表达量，从而起到很好的抗肿瘤活性。
有益效果：
本发明的含有哌嗪结构的甘草次酸衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，所用原料便宜，简单易得，反应步骤少，产率高，适合工业化生产，是一类具有巨大潜力的药品。
附图说明
图1为化合物1的western-blot实验；
图2为化合物1对pparγ的表达量影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1：化合物1的制备
(1)将1g甘草次酸溶于50ml甲醇中，然后添加0.5ml浓硫酸，回流反应12小时(反应温度为75℃)后将反应液减压蒸干，使用乙酸乙酯与水萃取(两者体积比为1:3)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到粗产物用乙醇重结晶得到纯的产物a。
(2)将产物a(加入量为1mmol)溶于二氯甲烷(加入量为20ml)中，然后加入溴乙酰溴(加入量为1.2mmol)，冰浴反应1-2个小时，反应完成后将反应液减压蒸干，用乙酸乙酯与nahco3饱和水溶液(两者体积比为1:3)萃取，收集有机层，无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到粗产物用丙酮重结晶得到纯的产物b。
其中，
产物a
产品为白色粉末，产率65％。m.p.210.5-214.1℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.67(s,1h),3.70(s,3h),3.23(m,1h),2.80(dt,j＝13.6,4.5hz,1h),2.37(s,1h),1.37(s,3h),1.15(s,3h),1.14(s,3h),1.13(s,3h),1.01(s,3h),0.81(s,6h).
产物b
产品为白色粉末，产率75％。m.p.165-167℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.67(s,1h),4.58(d,j＝10.9hz,1h),3.83(q,j＝12.2hz,2h),3.69(s,5h),2.35(d,j＝8.3hz,1h),2.29–2.20(m,1h),1.80(d,j＝13.0hz,4h),1.70–1.53(m,8h),1.35(d,j＝8.4hz,5h),1.25(s,2h),1.17–1.10(m,9h),0.92(s,5h),0.81(s,5h).
(3)将1mmol产物b和1mmol的n-甲基哌嗪溶于乙腈中，然后加入3mmol的碳酸钾，回流反应6-10个小时(反应温度为82℃)，反应完成后将反应液减压蒸干，用乙酸乙酯与水萃取(两者体积比为1:3)，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到上述结构的化合物1。
产品为白色粉末，产率70％。m.p.219-222℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.66(s,1h),4.58(dt,j＝17.6,7.0hz,1h),3.69(s,3h),3.28–3.16(m,2h),3.21(d,j＝2.6hz,2h),2.80(dt,j＝13.4,3.3hz,1h),2.58(d,j＝43.9hz,8h),2.36(s,1h),2.31(s,3h),2.11–1.56(m,13h),1.43(s,1h),1.36(s,3h),1.34–1.29(m,2h),1.15(d,j＝3.6hz,6h),1.12(s,3h),0.88(s,7h),0.80(s,3h).
实施例2：化合物2的制备
(1)将1g甘草次酸溶于50ml甲醇中，然后添加0.5ml浓硫酸，75℃回流反应12小时后将反应液减压蒸干，使用乙酸乙酯与水萃取(两者体积比为1:3)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到粗产物用乙醇重结晶得到纯的产物a。
(2)将产物1mmola溶于20ml二氯甲烷中，然后加入1.2mmol溴乙酰溴，冰浴反应1-2个小时，反应完成后将反应液减压蒸干，用乙酸乙酯与nahco3饱和水溶液萃取(两者体积比为1:3)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到粗产物用丙酮重结晶得到纯的产物b。
(3)将1mmol产物b和1mmol的二苯基甲基哌嗪溶于乙腈中，然后加入3mmol的碳酸钾，回流反应6-10个小时(反应温度为90℃)，反应完成后将反应液减压蒸干，用乙酸乙酯与水萃取(两者体积比为1:3)，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到上述结构的化合物2。
产品为白色粉末，产率73％。m.p.133-135℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ5.66(s,1h),4.58(dt,j＝17.6,7.0hz,1h),3.69(s,3h),3.28–3.16(m,2h),3.21(d,j＝2.6hz,2h),2.80(dt,j＝13.4,3.3hz,1h),2.58(d,j＝43.9hz,8h),2.36(s,1h),2.31(s,3h),2.11–1.56(m,13h),1.43(s,1h),1.36(s,3h),1.34–1.29(m,2h),1.15(d,j＝3.6hz,6h),1.12(s,3h),0.88(s,7h),0.80(s,3h).
实施例3：化合物3的制备
(1)将1g甘草次酸溶于50ml甲醇中，然后添加0.5ml浓硫酸，75℃回流反应12小时后将反应液减压蒸干，使用乙酸乙酯与水萃取(两者体积比为1:3)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到粗产物用乙醇重结晶得到纯的产物a。
(2)将1mmol产物a溶于20ml二氯甲烷中，然后加入1.2mmol溴乙酰溴，冰浴反应1-2个小时，反应完成后将反应液减压蒸干，用乙酸乙酯与nahco3饱和水溶液萃取(两者体积比为1:3)，收集有机层，无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到粗产物用丙酮重结晶得到纯的产物b。
(3)将1mmol产物b和1mmol的4-甲基苯基哌嗪(cas号为39593-08-3)溶于乙腈中，然后加入3mmol的碳酸钾，回流反应6-10个小时(反应温度为90℃)，反应完成后将反应液减压蒸干，用乙酸乙酯与水萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干，得到的粗产物用丙酮重结晶得到上述结构的化合物3。
产品为白色粉末，产率72％。m.p.172-174℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.32(d,j＝5.9hz,4h),5.66(s,1h),4.61–4.52(m,1h),3.68(d,j＝3.2hz,4h),3.54(s,2h),3.21(d,j＝2.3hz,2h),2.80(dd,j＝10.2,3.6hz,1h),2.62(dt,j＝53.5,12.1hz,11h),2.35(d,j＝8.7hz,1h),2.11–1.91(m,3h),1.68–1.54(m,7h),1.38–1.32(m,5h),1.30(s,1h),1.22(d,j＝2.4hz,3h),1.16(t,j＝4.5hz,5h),1.13(d,j＝3.2hz,3h),0.88–0.85(m,7h),0.80(d,j＝4.0hz,3h).
实施例4：化合物4的制备
制备方法同实施例1。以1-4-硝基苯基哌嗪代替n-甲基哌嗪，得目标化合物4。
产品为黄色粉末，产率79％。m.p.250-251℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.16–8.08(m,2h),6.86–6.79(m,2h),5.67(s,1h),4.61(dt,j＝11.7,4.1hz,1h),3.69(d,j＝3.3hz,4h),3.50(s,5h),3.32(s,2h),2.80(d,j＝3.8hz,6h),2.36(s,1h),2.12–1.88(m,4h),1.81–1.53(m,8h),1.39–1.29(m,6h),1.16(d,j＝5.0hz,6h),1.13(d,j＝3.2hz,3h),0.88(d,j＝1.8hz,7h),0.81(s,3h).
实施例5：化合物5的制备
制备方法同实施例1。以1-4-氯-二苯基甲基哌嗪代替n-甲基哌嗪，得目标化合物5。
产品为白色粉末，产率75％。m.p.144-145℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.35(d,j＝7.5hz,5h),7.26(s,2h),7.22(s,1h),7.18(t,j＝7.0hz,1h),5.66(s,1h),4.58(d,j＝10.1hz,1h),4.21(s,1h),3.73–3.65(m,5h),3.21(s,2h),2.80(d,j＝14.3hz,1h),2.62(s,4h),2.44(s,4h),2.35(s,1h),2.12–1.87(m,4h),1.76–1.52(m,8h),1.34(dd,j＝22.9,13.1hz,7h),1.14(d,j＝11.3hz,9h),0.86(d,j＝6.0hz,7h),0.80(s,3h).
实施例6：化合物6的制备
制备方法同实施例1。以1-4-氯苯基哌嗪代替n-甲基哌嗪，得目标化合物6。
产品为白色粉末，产率69％。m.p.249-250℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.20(d,j＝9.0hz,2h),6.84(d,j＝9.0hz,2h),5.67(s,1h),4.61(dt,j＝11.7,4.1hz,1h),3.69(d,j＝3.3hz,4h),3.29(d,j＝3.1hz,2h),3.22(t,j＝4.8hz,5h),2.85–2.69(m,6h),2.37(s,1h),2.13–1.90(m,4h),1.77–1.54(m,8h),1.33(dd,j＝16.5,9.2hz,6h),1.16(d,j＝5.8hz,6h),1.13(d,j＝3.2hz,3h),0.89(s,7h),0.81(s,3h).
实施例7：化合物7的制备
制备方法同实施例1。以1-3-三氟甲基苯基哌嗪代替n-甲基哌嗪，得目标化合物7。
产品为白色粉末，产率73％。m.p.261-263℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.48(d,j＝8.7hz,2h),6.92(d,j＝8.7hz,2h),5.67(s,1h),4.61(dt,j＝11.7,4.1hz,1h),3.69(d,j＝3.3hz,4h),3.34(d,j＝18.1hz,7h),2.89–2.66(m,6h),2.37(s,1h),2.12–1.89(m,4h),1.81–1.54(m,8h),1.34(dd,j＝16.7,9.2hz,6h),1.16(d,j＝5.7hz,6h),1.13(d,j＝3.2hz,3h),0.88(s,7h),0.81(s,3h).
实施例8：化合物8的制备
制备方法同实施例1。以1-氨基-4甲基哌嗪代替n-甲基哌嗪，得目标化合物8。
产品为白色粉末，产率67％。m.p.261-263℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.44(s,1h),5.67(s,1h),5.58–5.43(m,1h),4.86(d,j＝15.3hz,1h),4.67(s,1h),4.24(d,j＝55.6hz,2h),3.69(s,6h),3.06(d,j＝8.5hz,2h),2.91–2.63(m,3h),2.38(s,4h),2.16–1.73(m,7h),1.72–1.54(m,5h),1.34(d,j＝25.6hz,6h),1.19(dd,j＝38.4,12.0hz,11h),0.92(d,j＝11.9hz,7h),0.81(s,3h).
实施例9：化合物9的制备
制备方法同实施例9。以吡啶基哌嗪(cas号为34803-66-2)代替n-甲基哌嗪，得目标化合物9。
产品为白色粉末，产率78％。m.p.248-250℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.19(dd,j＝5.0,1.3hz,1h),7.49(t,j＝7.2hz,1h),6.69–6.59(m,2h),5.67(s,1h),4.68–4.55(m,1h),3.69(d,j＝3.3hz,4h),3.62(s,5h),3.28(d,j＝4.0hz,2h),2.87–2.64(m,6h),2.36(s,1h),2.11–1.93(m,4h),1.81–1.53(m,8h),1.38–1.30(m,6h),1.16(d,j＝4.5hz,6h),1.13(d,j＝3.1hz,3h),0.88(d,j＝1.9hz,7h),0.81(s,3h).
下面是实施例1-9的含哌嗪环的甘草次酸衍生物抗癌活性的检测研究。
实验材料
1.1细胞株
人肝癌细胞株hepg2；人乳腺癌细胞株mcf-7。
1.2试剂
dmem培养基(gibco)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料)，胰蛋白酶(sigma)，10000单位的双抗(gibcousa)，pbs缓冲液(上海源培生物科技股份有限公司)。其它常用化学试剂均为国产分析纯。
实验方法
2.1培养基的配制
90mldmem培养基(gibciousa)培养基加灭活新生牛血清(杭州四季青生物工程材料)10ml以及1ml10000单位的双抗(gibcousa)即为完全培养液，做好标记，于4℃保存备用。胰蛋白酶用pbs缓冲液配成0.25％溶液，过滤除菌后4℃保存备用。
2.2药液的配制
准确称取被测样品1.0mg。加到灭菌的1.5ml离心管中，加入dmso1ml，配成1mg/ml原液，-40℃冷冻保存。临用前融化后用适量pbs冲液稀释成相应浓度应用。
2.3细胞培养及传代
细胞菌贴壁培养于含10ml完全培养液细胞培养瓶中，于37℃、5％co2、饱和湿度下培养。细胞长满瓶底后用灭菌的pbs缓冲液洗两次，加入0.25％胰蛋白酶消化细胞1min，倒掉胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液30ml后，用移液管吹散细胞，分装于3个新的细胞培养瓶中，继续培养。
2.4抗癌活性测试
取刚刚长成完整单层的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液锥虫蓝(trypanblue)染色，与显微镜下计数活细胞数目至1×104个细胞/ml.向96孔培养板中每孔加入90μl细胞悬液，将培养板置于co2培养箱中培养24h，取出培养板后于每孔中加10μl含不同浓度被测样品的溶液，使得药物终浓度分别为50，25，12.5，6.25，3.125μm，每个浓度设3个平行孔，另设6孔细胞作正常对照孔和阳性对照孔。加完药后培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于co2培养箱中继续培养24h。取出培养板，每孔加入10μl5mg/ml的mtt液，振荡混匀，继续培养4h。加入每孔150μldmso后震荡15min。酶标仪测定各孔光吸收(od值)，测定波长570nm。根据各孔od值通过spss软件计算药物对两种细胞增殖的抑制率，即ic50值，实验结果见表1。
表1
表1显示，本发明提供的甘草次酸衍生物对两种细胞增殖的抑制具有显著作用，具有广阔的抗癌应用前景。