本发明涉及一种采用高速逆流色谱法从大米米糠提取物中分离制备高纯度单体环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯的制备分离方法。
背景技术：
大米是世界第二大农作物，每年产量约5.83亿吨，我国是世界上最大大米生产国，每年产生稻谷2.0亿吨以上，米糠年产量可达1400万吨左右。米糠是大米加工业有价值副产品之一，已证实大米米糠等谷物加工废弃物中分布着大量甾醇阿魏酸酯（大约为2510-6860μg/g）等具有生物活性功效的组分，主要为环木菠萝醇类阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯，其中环木菠萝烯醇阿魏酸酯占32%，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯占40%，菜油甾醇阿魏酸酯占9%，谷甾醇阿魏酸酯占19%。甾醇阿魏酸酯是甾醇c3位上的羟基与阿魏酸结合，脱水形成的一种衍生物，具有较好的亲脂性，更易透过生物膜，因此比游离甾醇和阿魏酸具有更显著的降脂水平、抗氧化、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等综合生物功效。因此，分离纯化大米米糠中环木菠萝烯醇阿魏酸酯等物质对于农副产品高附加值开发利用具有重要意义。
现有文献报道采用柱层析法从大米米糠中分离得到甾醇阿魏酸酯，但是并不能获得极高纯度的单体，而逆流色谱分离制备方法可以获得高纯度单体。由于高速逆流色谱(high-speedcountercurrentchromatography,hsccc)是近些年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的各种问题-样品易被吸附、损耗和变性，hsccc保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。逆流色谱仪能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，甚至能直接与质谱仪等仪器连接，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。而环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯四种物质是非极性化合物，物质结构极为相似，很难分离纯化获得高纯度单体。
技术实现要素：
本发明的目的是以正己烷提取的大米米糠提取物为原料将含量较低的环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯经高速逆流色谱的方法得到纯度95%以上的环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯，获得纯度90%以上24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯。
本发明的方案是：大米米糠提取物通过逆流色谱法分离制备高纯度环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯。选择两相非水溶剂体系，由三个组分构成，a组分是石油醚、正构烷烃，b组分是二氯甲烷，c组分是乙腈、脂肪醇。
采用非水溶剂体系，以上相为固定相，下相为流动相，在保证上下相体积比小于1前提下，根据溶解度常数，在不破坏体系平衡的情况下，调节a:b:c三组分的体积比:10:0-3：7-12，经过一次逆流分离得到环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯。
实验条件适合室温10-25℃，室温对分离效率影响较大，最佳分离温度为15℃，如果温度过多，溶剂体系保留很差，无法达到分离要求。
首先按体积比将上述溶剂体系配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用分析型或半制备型高速逆流色谱仪，配有ns-1007泵，2ml或20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为40ml、230或240ml、500ml，8823a-uv紫外检测器，yokogawa3057便携式记录仪。将大米米糠提取物溶解于流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为500-1800rpm,以0.5-3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分。
用本方法提取的环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯其纯度可达到95%以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯纯度达到90%以上。适用于采用各种型号的逆流色谱仪分离制备环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、菜油甾醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯单体，能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到高的纯度。
具体实施方式
实施例1
选取正己烷-乙腈在半制备型逆流色谱仪gs10ab上来分离纯化大米米糠提取物,首先按1︰1体积比将上述溶剂组分配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有ns-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823a-uv紫外检测器，yokogawa3057便携式记录仪。称取200mg大米米糠提取物溶解于5ml上相与5ml下相混合溶液中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm,以1.5ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，hplc检测环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯纯度达到95%以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的纯度达到90%以上。
实施例2
选取正庚烷-二氯甲烷-乙腈在半制备型逆流色谱仪gs10a上来分离大米米糠提取物,首先按10︰2：8体积比将上述溶剂组分配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有ns-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为230ml，8823a-uv紫外检测器，yokogawa3057便携式记录仪。称取128.5mg大米米糠提取物溶解于5ml上相与5ml下相混合溶液中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm,以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，hplc检测环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯纯度达到95%以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的纯度达到90%以上。
实施例3
选取正戊烷-二氯甲烷-乙腈在半制备型逆流色谱仪emc-500上来分离纯化大米米糠提取物,首先按10︰3：7体积比将上述溶剂组分配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有ns-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为500ml，8823a-uv紫外检测器，yokogawa3057便携式记录仪。称取400.2mg大米米糠提取物溶解于5ml上相与5ml下相混合溶液中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm,以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，hplc检测环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯纯度达到95%以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的纯度达到90%以上。
实施例4
选取正己烷-乙醇在半制备型逆流色谱仪gs10ab上来分离纯化大米米糠提取物,首先按5：6体积比将上述溶剂组分配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有ns-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823a-uv紫外检测器，yokogawa3057便携式记录仪。称取133.6mg大米米糠提取物溶解于5ml上相与5ml下相混合溶液中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm,以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，hplc检测环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯纯度达到95%以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的纯度达到90%以上。
实施例5
选取正己烷-甲醇在半制备型逆流色谱仪gs10ab上来分离纯化大米米糠提取物,首先按1:1体积比将上述溶剂组分配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有ns-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823a-uv紫外检测器，yokogawa3057便携式记录仪。称取299.3mg大米米糠提取物溶解于5ml上相与5ml下相混合溶液中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm,以2.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，hplc检测环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯纯度达到95%以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的纯度达到90%以上。
实施例6
选取石油醚-正丁醇在半制备型逆流色谱仪gs10ab上来分离纯化大米米糠提取物,首先按1:1体积比将上述溶剂组分配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有ns-1007泵，20ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240ml，8823a-uv紫外检测器，yokogawa3057便携式记录仪。称取150.1mg大米米糠提取物溶解于5ml上相与5ml下相混合溶液中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm,以3.0ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，hplc检测环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯纯度达到95%以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的纯度达到90%以上。
实施例7
选取甲基叔丁基醚-正丁醇在分析型逆流色谱仪gs20上来分离纯化大米米糠提取物,首先按1:1体积比将上述溶剂组分配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用分析型逆流色谱仪，配有ns-1007泵，2ml进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为40ml，8823a-uv紫外检测器，yokogawa3057便携式记录仪。称取30.5mg大米米糠提取物溶解于1ml上相与1ml下相混合溶液中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为1800rpm,以0.5ml/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，hplc检测环木菠萝烯醇阿魏酸酯和谷甾醇阿魏酸酯纯度达到95%以上，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯和菜油甾醇阿魏酸酯的纯度达到90%以上。