本发明涉及一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法，并用于蛋白质结晶的方法。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成，生命科学的核心从测序转向功能基因组研究。蛋白质是生命活动的主要参与者，其三维结构是功能研究的前提和基础。目前，蛋白质结构测定的方法包括x射线衍射技术、核磁共振技术和冷冻电镜技术等。x射线衍射技术是目前最成熟且精度最高的技术，超过89％蛋白质结构都是由x射线衍射技术测定的。获得蛋白质晶体是x射线衍射技术的前提和基础，然而结晶成功率低严重阻碍了蛋白质结构的解析，是亟待解决的问题。
蛋白质结晶包括形核和晶体生长，其中形核是蛋白质结晶的第一步，也是最关键的一步。通常，只有蛋白质溶液浓度达到过饱和才能逾越形核势垒，发生形核，继而晶体才能生长。对于一些比较珍贵的蛋白质样品，浓度很难达到过饱和，直接导致了其结晶成功率低。添加异相核是提高蛋白质结晶成功率的重要方法之一，包括直接添加异相形核剂和改造结晶板界面。异相核包括凝胶玻璃珠、交联葡聚糖珠、碳粉、马毛、干枯的海草、沸石等。但是，这些异相核需要逐一添加到结晶体系中，不利于自动化结晶的实现。直接对结晶基底表面进行修饰是一种提高自动化筛选效率的有效手段，目前已经广泛应用的结晶基底包括云母、矿物、磷脂双分子层修饰的玻璃、多聚赖氨酸修饰的聚合物膜等，这些方法都被证明显著提高了蛋白质结晶成功率，但是由于基底成本高、处理工艺复杂等问题制约其在蛋白质结晶中的应用。
蛋白质属于两性分子，在不同的ph条件下电荷和电性不同，在外源电场的作用下蛋白质分子可以定向的泳动，以此增加了局部区域蛋白质溶液的浓度，有效的提高了结晶成功率。文献“talebm,didierjeanc,jelschc,etal.,crystallizationofproteinsunderanexternalelectricfield[j].journalofcrystalgrowth,1999,200(3-4):575-582”中报道，将结晶液滴置于外加电场中，使蛋白质分子在局部区域达到过饱和，进而达到促进结晶的目的。但是，这种方法需要施加外源的电场，装置复杂，很难用目前的商业结晶板来实现。通过化学处理使其在表面接枝官能团使其带电，使蛋白质分子在结晶液滴内形成定向泳动从而达到促进结晶的目的，是最简单和有效的方法。
技术实现要素：
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法，通过对结晶板表面进行官能团接枝，使其表面带有不同电性的电荷，并将其用于蛋白质的结晶，能有效提高蛋白质的结晶成功率，解决现有技术中蛋白质结晶率低的问题。
技术方案
一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法，其特征在于步骤如下：步骤1、表面带有电荷的结晶板的制备：
a：在结晶板表面接枝磺酸基团得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯乙烯结晶板；
b：在结晶板表面接枝羧基基团得到表面带有负电性的羧基基团的聚苯乙烯结晶板；
c：结晶板表面接枝季氨基团得到表面带有正电性的季氨基团的结晶板；
步骤2：将结晶试剂与蛋白溶液按照体积比为(0.01～50)︰1混合后滴加在步骤1处理后的带有电荷的结晶板中，建立蛋白质结晶体系用于结晶；
所述结晶试剂为：所有用于蛋白质结晶的试剂；
所述蛋白溶液：将蛋白溶于溶解蛋白质的缓冲液中，使溶液的ph值在3～10，浓度范围为0.001～1m，溶解蛋白质后得到终浓度为1～100mg/ml蛋白溶液；
步骤3：将蛋白质结晶体系在0～60℃环境下静置1～720h结晶。
在反应中晃动结晶板使液体分布均匀。
所述步骤1的a：在结晶板表面接枝磺酸基团得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯乙烯结晶板的过程为：在结晶板表面接枝磺酸基团：在聚苯乙烯结晶板的小孔中加入98％硫酸，在20～200℃下处理1～20h，倒出并使用去离子水冲洗，再用1％～15％的氢氧化钠溶液中和，得到表面有负电性的磺酸基团的聚苯乙烯结晶板。
所述步骤1的b：在结晶板表面接枝羧基基团得到表面带有负电性的羧基基团的聚苯乙烯结晶板的过程为：1、在结晶板表面接枝羧基基团：将处理后的聚苯乙烯结晶板在20～200℃条件下，浸入浓硫酸和浓硝酸的处理液中浸泡1～20h，再用去离子水冲洗干净；2、称取氯化锡固体溶解于浓盐酸，使其终浓度为0.2～1g/ml，滴加到结晶板孔中，于0℃～100℃反应1～100h，倒出反应液，再使用1％～20％的氢氧化钠溶液洗涤，然后用去离子水冲洗；3、在结晶板孔中加入浓度为1％～20％马来酸酐的乙醇溶液，10～100℃保温1～24h，倒出该溶液，用无水乙醇、1％～20％的氢氧化钠的去离子水溶液依次冲洗，得到表面带有负电性的羧基基团的聚苯乙烯结晶板。
所述步骤1的c：结晶板表面接枝季氨基团得到表面带有正电性的季氨基团的结晶板的过程为：1、将处理后的聚苯乙烯结晶板在20～200℃条件下，浸入浓硫酸和浓硝酸的处理液中浸泡1～20h，再用去离子水冲洗干净；2、称取氯化锡固体溶解于浓盐酸，使其终浓度为0.2～1g/ml，滴加到结晶板孔中，于0℃～100℃下反应1～100h，倒出反应液；再使用1％～20％的氢氧化钠溶液洗涤，然后用去离子水冲洗；3、在结晶板孔中加入浓度为1％～20％的2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的乙醇溶液，10～100℃保温1～24h，用无水乙醇和去离子水依次冲洗干净，得到表面带有正电性的季氨基团的结晶板。
所述浓硫酸和浓硝酸处理液的体积比为1:1～10:1，在0～25℃下配制。
有益效果
本发明提出的一种在结晶板表面接枝电荷来提高蛋白质结晶成功率的方法，可以根据蛋白质所带电性来选择带正电或带负电的结晶板从而达到提到蛋白质结晶成功率的目的。在本发明中，只需要简单步骤即可对大批结晶板进行处理，易于操作且可重复利用，简单可行。通过本发明，结晶成功率的提高最大可达到现有技术的2倍以上。
具体实施方式
现结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：过氧化氢酶结晶条件的筛选
第一步：通过表面处理得到表面接枝磺酸基团结晶板。具体为，在结晶板的小孔中加入98％硫酸，20℃下使用该处理液浸泡ps板10h，倒出并使用去离子水冲洗，再用10％的氢氧化钠溶液中和，得到表面有负电的磺酸基团的ps板；
第二步：将美国sigma公司的过氧化氢酶蛋白溶于ph为3，0.5m的hepes-na缓冲液中，达到终浓度为20mg/ml，得到过氧化氢酶蛋白溶液；
第三步：用hampton公司的indextm试剂盒的96种结晶试剂筛选过氧化氢酶晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为1：10滴加在结晶板坐滴孔中，得到蛋白质结晶体系；
第四步：将结晶体系置于8℃条件下静置结晶72h。显微镜下观察统计出现过氧化氢酶晶体的条件个数。
得到：63种结晶条件中出现了葡萄糖异构酶晶体，结晶成功率为65.625％。与未处理结晶板的对照组相比，成功率提高了2.5倍。
实施例2：蛋白酶k结晶条件的筛选
第一步：通过处理得到表面接枝羧基的结晶板。具体为，在10℃条件下，按照1：4的体积比配制浓硝酸和浓硫酸的混合处理液。ps板于60℃条件下，使用该处理液浸泡15h，再用去离子水冲洗干净。称取5g氯化锡固体溶解于10ml浓盐酸，滴加到结晶板孔中，于40℃反应20h，反应每隔1h轻微晃动结晶板以使液体分布均匀。反应完毕后，倒出反应液，使用15％的氢氧化钠溶液洗涤，然后用去离子水冲洗干净。在小孔中加入含有5％马来酸酐的乙醇溶液，50℃保温10h，倒出该溶液，用乙醇、氢氧化钠的去离子水溶液依次冲洗干净，得到表面带有负电性的羧基基团的ps板。；
第二步：将美国sigma公司的蛋白酶k蛋白溶于ph为3，0.5m的hepes-na缓冲液中，达到终浓度为60mg/ml，得到蛋白质溶液；
第三步：将60mg/ml氯化钠溶液与蛋白质溶液按照体积比30：1滴加在结晶板坐滴孔中，得到蛋白质结晶体系；
第四步：将结晶体系置于4℃条件下静置结晶24h。显微镜下观察统计出现蛋白酶k晶体的条件个数。
经过统计得到以下结果：69种结晶条件下出现了溶菌酶晶体，结晶成功率为71.88％。与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比，成功率提高了2.4倍。
实施例3：刀豆球蛋白结晶条件的筛选
第一步：通过处理得到表面接枝季氨基团的结晶板。具体为，在10℃条件下，按照1：1体积比配制浓硝酸和浓硫酸的混合处理液。ps板于30℃条件下，使用该处理液浸泡12h，再用去离子水冲洗干净。称取10g氯化锡固体溶解于10ml浓盐酸，滴加到结晶板孔中，于55℃反应25h，反应每隔1h轻微晃动结晶板以使液体分布均匀。反应完毕后，倒出反应液，使用5％的氢氧化钠溶液洗涤，然后用去离子水冲洗干净。在结晶板孔中加入含10％2，3-环氧丙基三甲基氯化铵乙醇溶液，50℃保温8h，用乙醇和去离子水依次冲洗干净，即得到表面带有正电性的季氨基团的结晶板；
第二步：将美国sigma公司的刀豆球蛋白溶于ph为7，0.01m的hepes-na缓冲液中，达到终浓度为30mg/ml，得到蛋白质溶液；
第三步：用hampton公司的indextm试剂盒的96种结晶试剂筛选刀豆球蛋白晶体，将结晶试剂与蛋白质溶液按照体积比为1：1滴加在结晶板坐滴孔中混合，得到蛋白质结晶体系；
第四步：将结晶体系置于20℃条件下静置结晶168h。显微镜下观察统计出现刀豆球蛋白晶体的条件个数。
经过统计得到以下结果：43种结晶条件下出现了刀豆球蛋白晶体，结晶成功率为44.79％。与现有技术中使用未处理的结晶板的对照组相比，成功率提高了2.69倍。