本发明涉及昆虫体内共生菌的分子检测
技术领域：
，更具体地，涉及一种检测鉴定昆虫体内wolbachia感染的引物组、方法和试剂盒。
背景技术：
：wolbachia是广泛分布于节肢动物生殖组织内的一类共生细菌，约75％的物种感染wolbachia。wolbachia与宿主有共生关系，例如引起淋巴丝虫病的丝虫与其体内的wolbachia是互惠共生关系，wolbachia控制着丝虫的生长、发育和在蚊子体内的生存。检测出wolbachia就是防止媒介昆虫传播淋巴丝虫病的首要条件。另外，wolbachia还对宿主具有生殖调控的作用。wolbachia对寄主的作用主要体现在其对生殖的调控方面，在进化过程中与寄主逐渐形成了协同进化的关系(werrenetal.,2008)，形成了多种调节宿主生殖方式的机制。这些机制主要包括：1、引起寄主的细胞质不亲和(cytoplasmicincompatibility，ci)，影响着蝇类、蚊类等类群的种内杂交产生很少后代或者没有后代。2、诱导孤雌生殖(parthenogeneticinduction，pi)；诱导孤雌生殖现象(pi)多发生于单-双倍体性别决定系统的昆虫中。单-双倍体性别决定系统是指在正常情况下，未受精的卵(单倍体)发育成雄性，而受精卵(双倍体)发育成雌性。3、引起雄性的雌性化(feminization)；4、杀雄作用(malekilling)是指寄主在发育过程中，雄性胚胎或者幼虫不能成活。检测出wolbachia就可以利用相关调控机理对害虫进行治理，对益虫进行利用。目前已报道的检测wolbachia的方法主要是依靠特异pcr或特异探针杂交技术。其中，16s、wsp、fts这三个基因及其引物是最常用于wolbachia检测的几种靶标基因。这些引物存在着以下的欠缺：1、假阴性结果，例如wsp引物(81f和691r))。但是wolbachia在不同的宿主有不同的变异，因此在利用现在的16s引物扩增某些昆虫体内wolbachia的过程中遇到一些假阴性的结果，导致最后错误的结论。2、非特异性扩增，结合位点过多，pcr结果经常出现非专一的条带，无从判断是否为阳性结果。例如：16s(wol-16s-f，wol-16s-r)，wsp引物(81f和691r)和fts引物(ftsz，ftsa和ftsb)。3、非wolbachia目标检测，现在常用的16s引物为通用引物，如果pcr扩增出阳性结果后，还需要进一步测序才能确定是否为wolbachia或是其他的微生物，针对wolbachia感染鉴定的特异性还欠缺，例如：16s(27f，1494r，1513r)。因此，开发一种特异引物就显得尤为重要。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有wolbachia检测引物和方法存在假阴性、非特异性的缺陷和不足，利用ncbi网上的现有的wolbachia16s基因序列重新设计并通过大量筛选后，获得更灵敏、更精确的16s特异引物，以便能够进行wolbachia的鉴定。本发明的第一个目的是提供一种检测鉴定昆虫体内wolbachia感染的特异性扩增引物tw16s1。本发明的第二个目的是提供一种检测鉴定昆虫体内wolbachia感染的方法。本发明的第三个目的是提供一种检测鉴定昆虫体内wolbachia感染的试剂盒。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种检测鉴定昆虫体内wolbachia感染的特异性扩增引物tw16s1，所述引物tw16s1包括正向引物f和反向引物r，其序列依次如seqidno：1～2所示。tw16s1-f：5’-ataccctggtagtccacgct-3’(seqidno：1)；tw16s1-r：5’-gcagtgtgtacaagacccga-3’(seqidno：2)。同时，本发明还请求保护上述特异性扩增引物tw16s1在检测鉴定昆虫体内wolbachia感染或在制备昆虫体内wolbachia感染检测试剂或试剂盒中的应用。一种检测鉴定昆虫体内wolbachia感染的方法，包括如下步骤：s1.提取待测昆虫总dna；s2.以s1的dna为模板，利用权利要求1所述引物进行pcr扩增反应；s3.将s2的pcr扩增反应产物电泳检测，根据检测结果进行判断。优选地，s2所述pcr扩增反应的体系为25μl：dna模板1μl，tw16s1-f(10μm)1μl，tw16s1-r(10μm)1μl，2xtsingkemastermix12.5μl，5xgcbuffer5μl，灭菌水4.5μl。优选地，s2所述pcr扩增条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸25s，40个循环；72℃延伸2min。优选地，将s3的扩增产物测序，并构建系统发育树，从而进行精确鉴定。同时，本发明还保护所述方法在制备昆虫体内wolbachia感染检测试剂或试剂盒中的应用。一种检测鉴定昆虫体内wolbachia感染的试剂盒，包含上述特异性扩增引物tw16s1。优选地，还包括pcr扩增反应所需的试剂。优选地，还包括待测昆虫总dna提取所需试剂。优选地，所述试剂盒pcr扩增反应的体系为25μl：dna模板1μl，tw16s1-f(10μm)1μl，tw16s1-r(10μm)1μl，2xtsingkemastermix12.5μl，5xgcbuffer5μl，灭菌水4.5μl。优选地，所述试剂盒pcr扩增条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸25s，40个循环；72℃延伸2min。同时，所述试剂盒在检测鉴定昆虫体内wolbachia感染中的应用亦在本发明保护范围内。优选地，所述昆虫为赤眼蜂。更优选地，所述昆虫为短管赤眼蜂trcichogrammapretiosum、trichogrammanerudai、微小赤眼蜂trichogrammaminutum、卷蛾赤眼蜂trichogrammacacoeciae、食胚赤眼蜂trichogrammaembryophagum、甘蓝夜蛾赤眼蜂trichogrammabrassicae、螟黄赤眼蜂trichogrammachilonis、广赤眼蜂trichogrammaevanesscens、玉米螟赤眼蜂trichogrammaostriniae、trichogrammaturkestanica和米蛾卵corcyracephalonica。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本专利利用ncbi网上的现有的wolbachia16s基因序列重新设计并通过大量筛选后，获得了更灵敏、更精确的16s特异引物tw16s1，能够进行wolbachia的精确鉴定。利用本发明提供的特异引物pcr对tw16s1能筛选出假阴性、非特异性的样品，从而提高检出率。从提dna到获得结果仅需要4个小时左右。可以精确、快速地发现检测出样品中是否受wolbachia感染，为进一步得用进行疾病预防和对昆虫进行生殖调控提供基础，具有较大的应用前景。附图说明图1为本发明特异引物tw16s1在wolbachia16srrna基因上的位置。图2为本发明特异引物tw16s1与现在常用的wolbachia扩增引物检测结果电泳对比图。m表示makerdl2000；01-11依次为：短管赤眼蜂t.pretiosum、t.neruda、微小赤眼蜂t.minutum、卷蛾赤眼蜂t.cacoeciae、食胚赤眼蜂t.embryophagum、甘蓝夜蛾赤眼蜂t.brassicae、螟黄赤眼蜂t.chilonis、广赤眼蜂t.evanesscens、玉米螟赤眼蜂t.ostriniae、t.turkestanica和米蛾卵corcyracephalonica；ck为空白对照。图3为本发明特异引物tw16s1扩增得到的序列构建的wolbachia16srrnagene的系统发育树。wolbachia菌系均以宿主种名表示；种名前带有三角形符号的是本专利测序获得的序列；其余序列均是从genbank上下载的并在后面附上其序号列，种名前的大写字母(如a)表示该菌系的wolbachia所属的超群。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1wolbachia检测引物设计及筛选1、赤眼蜂种群总dna的提取根据昆虫痕量dna模板制备方法，加以改进后得到。操作步骤如下：(1)每个赤眼蜂种群随机挑取10头蜂，先用无水乙醇浸泡24h后，再用无菌水清洗5次，最后用75％的乙醇清洗一遍，用滤纸吸干后，置于200μl的已灭菌pcr管中，并做好编号。(2)将蛋白酶k工作液(20mg/ml)与ste缓冲液(100mmol/lnacl,10mmol/ltris-hcl,1mmol/ledta,ph8.0)以1：9的比例混合均匀，得到用于提取dna的含pk的ste缓冲液(以下简称ste)。(3)向pcr管中加入1μl的含ste。(4)用烧熔的200μl已灭菌的枪头研磨虫体，至所有虫体全部破碎后，取100μl的ste冲洗研磨枪头到pcr管中。(5)混合均匀后，短速离心，置于pcr仪中56℃恒温消化2h。(6)95℃变性10min，冷却至4℃。(7)短速离心后，取上清置于新的已灭菌pcr管中，做好编号，此为各赤眼蜂种群的dna模板，可直接用于pcr反应或-20℃保存待用。2、wolbachia检测引物设计及筛选由于目前只有短管赤眼蜂的基因组发表，故设计的引物以短管赤眼蜂作为宿主背景进行全基因组特导引物的筛选，以避免所设计出来的引物与宿主基因具有匹配的位点，造成非特异性，产生多个结合位点，体现在电泳检测中为多条带的结果。引物的设计包括如下步骤：(1)根据目前已有wolbachia超群(a-q，除了g)，参考文章(bingetal.,2014；glowskaetal.,2015；maetal.,2017)，在ncbi上下载了含有所有超群(a-f，h-q)的wolbachia16s基因片段，在mega7上比对，寻找保守区域。本发明所用16s基因序列号与位点详见表1。表1用于本专利引物设计的参与序列与位点所属超群-序列号宿主种名上游引物位置：729-748下游引物位置：1325-1344超群a-m84687nasoniavitripennisataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群b-eu499317bryobiapraetiosaataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群b-l02888trichogrammadeionataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群c-aj010276onchocercaochengiataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群d-af069068litomosoidessigmodontisataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群e-af179630folsomiacandidaataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群f-dq068882myrmeleonmobilisataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群h-ay764279zootermopsisangusticollisataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群i-ay335923ctenocephalidesfelisataccctggtagtccacgcttcgggttttgtacacgctga超群j-aj548802dipetalonemagracileataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群k-eu400316bryobiaspataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群l-eu833482radopholussimilisataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群m-jn384085tuberolachnussalignusataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群n-jn384094toxopteraaurantiiataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc超群o-kf454771bemisiatabaciataccctggtagtccacgcttcgggtcttgtacacactgc注：超群p和q下载的16s基因序列只有前半段不到800bp，故不参与引物设计。(2)因为赤眼蜂属于膜翅目，而膜翅目身上的wolbahia大多数属于超群b，所以选取超群b的16s序列作为设计引物的参考片段。(genbankaccessionno:eu499317，保守区域是495-1371)。(3)使用引物设计软件primerpremier5和ncbi网站上的引物设计工具ncbiprimer-blast来设计针对宿主为赤眼蜂的wolbachia16srrnagene的引物。(4)在ncbiprimer-blast上以16s基因保守片段设计和超群b16s基因序列全长分别设计得到的引物中，根据正反引物的gc含量、引物自交互交碱基数、tm值等条件，分别挑选到2对和3对引物；还有已发表文章的16s基因引物，再经过用短管赤眼蜂基因组为背景做引物特异检测后，对短管赤眼蜂特异的两对16s基因的两对引物w-ef/，w-er*(werrenetal.,2000)和16folbf/，16folbr3(casiraghietal.,2004)；共7对wolbachia16sgene引物，以“引物1～7”作标记，进行16s基因特异引物的筛选工作，各引物详情如表2。表2用于筛选wolbachia16srrna基因特异引物的引物详情(5)第一次筛选：用确定含有wolbachia的短管赤眼蜂作为阳性dna模板，把7对引物全部进行梯度温度pcr扩增，以确定各引物的最佳退火温度。pcr体系为25μl：dna模板1μl，tw16s1-f(10μm)1μl，tw16s1-r(10μm)1μl，2xtsingkemastermix12.5μl，5xgcbuffer5μl，灭菌水4.5μl。pcr扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，梯度温度58℃～68℃退火10s，72℃延伸25s，40个循环；72℃延伸2min；pcr反应终止后产物冷却至4℃。将pcr扩增产物取4μl，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下观察各引物各个退火温度下的条带，得知引物1的最佳退火温度是65℃，其余6对引物的最佳退火温度是60℃。(6)采用上述各引物对，以部分赤眼蜂种群(trichogrammanerudai的t.ne(d)、短管赤眼蜂trcichogrammapretiosum的t.p(w)、微小赤眼蜂trichogrammaminutum的t.min(a)、卷蛾赤眼蜂trichogrammacacoecia的t.ca(d)和t.ca(k)、食胚赤眼蜂trichogrammaembryophagum的t.emb(k)、)提取的dna和米蛾卵(corcyracephalonica)的dna提取液做为dna底物，用各引物对应的退火温度，进行pcr扩增(pcr体系和扩增程序同(5)，只是退火温度不同)。扩增后用4μl样品电泳检测，然后将所有有对应引物目标条带的样品都送广州擎科生物技术有限公司测序。(7)将各引物测序得到的序列在mega7.0上拼接，并在ncbi上进行比对，最终得到各对引物试测的结果(如表3)；结果显示，引物1是其中表现最好的wolbachia16srrnagene的引物，命名为tw16s1，即seqidno：1。表3本发明筛选所用七对引物的试测结果编号引物1引物2引物3引物4引物5引物6引物7t.ne(d)w-wxw--t.p(w)wwwwwwwt.min(a)w--x---t.ca(d)ww-w---t.emb(k)w--x---t.ca(k)w--xw--米蛾卵wwwwwww注：“w”表示测序得到的序列经过blast后是wolbachia；“x”表示测序得到的序列经过blast后不是wolbachia；“-”表示电泳结果无目标条带。将本发明所设计的tw16s1引物与现在常用的引物进行pcr扩增对比，其结果如图2所示：本发明设计的引物(tw16s1)扩增结果为单一目的片段，而且灵敏度高，pcr结果可用于直接测序。而其它的引物出现的结果为：1、非特导性扩增，例如16s，wsp(81f和691r)和fts(ftsz，ftsa和ftsb)；2、假阴性，例如：广赤眼蜂trichogrammaevanesscens的wsp(81f和691r)扩增结果和玉米螟赤眼蜂trichogrammaostriniae的16s和wsp(81f和691r)扩增结果都为假阴性。可见，运用之前文献报道的引物，并不能扩增出赤眼蜂体内wolbachia的16s基因，但用本专利所设计的引物可以清晰看到阳性的扩增段片，并且不含杂带可以直接测序；如不需获得wolbachia的序列，直接通过电泳结果看其是够含有目标条带，即可判断赤眼蜂是否感染了wolbachia。blast结果表明，得到的序列均是wolbachia16srrna基因的序列。将得到的序列和下载的部分序列经过mega7.0软件系统发育分析，结果显示如图3所示，实验所获得的赤眼蜂wolbachia16s序列与genbank上的其他物种的wolbachia16s具有同源性。实施例2一种检测昆虫体内wolbachia感染的试剂盒1、一种检测昆虫体内wolbachia感染的试剂盒，包含特异性扩增引物tw16s1-f/r，其序列如下所示：tw16s1-f：5’-ataccctggtagtccacgct-3’(seqidno：1)；tw16s1-r：5’-gcagtgtgtacaagacccga-3’(seqidno：2)；所述试剂盒还包含pcr扩增反应所需试剂：2xtsingkemastermix，5xgcbuffer，灭菌水。所述试剂盒还包含昆虫总dna提取试剂：1.5ml/2.0ml离心管，pcr管，无水乙醇，75％的乙醇，无菌水，蛋白酶k，ste缓冲液。2、试剂盒使用方法利用所述试剂盒进行昆虫体内wolbachia感染检测的方法包括如下步骤：s1.提取待测昆虫总dna；s2.以s1的dna为模板，利用上述引物进行pcr扩增反应；s3.将s2的pcr扩增反应产物电泳检测，从而进行判断。具体地，s1所述昆虫dna提取包括如下步骤：(1)挑取待测昆虫，先用无水乙醇浸泡24h后，再用无菌水清洗5次，最后用75％的乙醇清洗一遍，用滤纸吸干后，置于200μl的已灭菌pcr管中，并做好编号。(2)将蛋白酶k工作液(20mg/ml)与ste缓冲液(100mmol/lnacl,10mmol/ltris-hcl,1mmol/ledta,ph8.0)1以1：9的比例混合均匀，得到用于提取dna的含pk的ste缓冲液(以下简称ste)。(3)向pcr管中加入1μl的含ste。(4)用烧熔的200μl已灭菌的枪头研磨虫体，至所有虫体全部破碎后，取100μl的ste冲洗研磨枪头到pcr管中。(5)混合均匀后，短速离心，置于pcr仪中56℃恒温消化2h。(6)95℃变性10min，冷却至4℃。(7)短速离心后，取上清置于新的已灭菌pcr管中，做好编号，此为各赤眼蜂种群的dna模板，可直接用于pcr反应或-20℃保存待用。具体地，s2所述pcr扩增反应的体系为25μl：dna模板1μl，tw16s1-f(10μm)1μl，tw16s1-r(10μm)1μl，2xtsingkemastermix12.5μl，5xgcbuffer5μl，灭菌水4.5μl。具体地，，s2所述pcr扩增条件为98℃预变性3min；98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸25s，40个循环；72℃延伸2min。具体地，s3所述检测为每个pcr扩增产物取4μl，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。在紫外灯下观察所扩增出的片段都是单一的目标条带，并拍照，同时pcr产物可送测序，根据测序结果构建系统发育树。本发明所述试剂盒可用于检测赤眼蜂，尤其是短管赤眼蜂trcichogrammapretiosum、trichogrammanerudai、微小赤眼蜂trichogrammaminutum、卷蛾赤眼蜂trichogrammacacoeciae、食胚赤眼蜂trichogrammaembryophagum、甘蓝夜蛾赤眼蜂trichogrammabrassicae、螟黄赤眼蜂trichogrammachilonis、广赤眼蜂trichogrammaevanesscens、玉米螟赤眼蜂trichogrammaostriniae、trichogrammaturkestanica和米蛾卵corcyracephalonica。利用本试剂盒能筛选出假阴性、非特异性的样品，从而提高检出率。从提dna到获得结果仅需要4个小时左右。可以精确、快速地发现检测出样品中是否受wolbachia感染，为进一步得用进行疾病预防和对昆虫进行生殖调控提供基础。序列表<110>华南农业大学<120>一种检测鉴定昆虫体内wolbachia感染的特异性引物、方法和试剂盒<130>yg18103930aa042<141>2018-05-22<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>沃尔巴克体(wolbachia)<400>1ataccctggtagtccacgct20<210>2<211>20<212>dna<213>沃尔巴克体(wolbachia)<400>2gcagtgtgtacaagacccga20当前第1页12