本发明涉及与猪种繁殖性状相关的pacsin2基因分子标记及应用。
(二)
背景技术：
浙江省地处长江三角洲南翼，是中国东南沿海省份之一。北上为上海、江苏，南下为福建，东临东海，西边与安徽、江西接壤。东西和南北间距均大约为450公里，陆地面积仅10.55万平方公里，属于中国面积较小的城市。“七山一水二分田”是自古以来浙江省的说法，因其山地和丘陵面积占比74.63％，平原占比20.32％，水域面积约为5.05％。
据史料记载，因浙江省人多地少，山多平原少耕地面积不多，故农民多数通过养猪来增加家庭经济收入和供给食物；而劳力充沛外加浙江省的生态条件较好，养猪饲料资源丰富，为养猪业的发展提供了良好的条件。根据《中国畜禽遗传志·猪志》[1]中的记录，目前主要有七个主要地方品种分别分布在浙江省不同区域，由南向北分布依次为碧湖猪、嵊县花猪、金华两头乌、宁海岔路黒猪、兰溪花猪、淳安花猪和嘉兴黑猪七个主要地方品种。每个品种都有着自己悠长的养殖历史，如宁海岔路黑猪拥有300年以上的养殖历史，兰溪花猪的养殖在清朝的时候就有历史记录，而嵊县花猪的养殖历史可以追溯到明朝万历年间。品种的划分依据是主要来自于地域的划分，如因靠近太湖流域而归属于太湖猪系的嘉兴黑猪；因靠近安徽而归属于皖浙猪系的淳安花猪；金华两头乌和兰溪花猪虽都处于绍兴金华地区，但是猪种间的形体特征相距明显。因此可见，根据地域的品种划分的准确性和合理性有待进一步考证。
浙江省地方猪种缺乏市场竞争力，从而在不同程度的受到了灭绝的威胁，保种工作的重要性逐渐被人们所意识到，但是由于没有很好的体系以及开展的时间并不久导致保种的工作进展较为缓慢。到目前为止，浙江省七个地方品种中只有金华猪，嵊县花猪，嘉兴黑猪和淳安花猪有着较为完整的保种体系和措施。其中金华猪和嘉兴黑猪在50年代就开始采取了保种措施，保种水平在国内处领先状态，到目前为止保种效果良好，也有新的品系被陆续培养出。岔路黑猪、碧湖猪和兰溪花猪等其他地方猪种的现状却不容乐观：如岔路黑猪没有规模化的养殖，主要还是靠散户来养殖，故管理，记录，配种的工作的进行并不规范，导致保种工作的难以进行；兰溪花猪的保种工作也并不顺利，由于缺乏专业人士的管理和指导，系谱资料、生产资料等记录混乱、缺失，近亲繁殖的现象也较为严重；碧湖猪已经很难鉴定其血统的纯正性，后续工作难以进行。故而浙江省地方猪种的保种工作面临着许多的挑战。
(三)
技术实现要素：
本发明目的是提供涉及与猪种繁殖性状相关的pacsin2基因分子标记及应用。
本发明采用的技术方案是：
与猪种繁殖性状相关的pacsin2基因分子标记，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
繁殖力性状包括有：母猪的排卵率、窝产仔数、产活仔数、仔猪初生重、乳头数、泌乳力、育成仔猪数和断奶窝重等。产仔数和初生重、断奶仔猪重、育成仔猪数等性状都有着较为密切的关系。在现代养猪业生产当中，母猪的繁殖性能是影响猪场经济效益的最重要的因素之一。
母猪的繁殖性状包括有窝产仔数、初生仔猪重以及断奶仔猪重等，其中窝产仔数和产活仔数是衡量母猪经济性状的重要指标。有研究表示，窝产仔数和产活仔数两个性状同初生窝重、断奶窝重、断奶仔数数等繁殖性状之间存在着相关性，相关系数分别为0.93、0.61和0.70。因此繁殖性状的改良一直是这些年来我国和欧美等国家对于猪育种研究工作的重点以及所主攻的目标。
经研究发现，本发明pacsin2基因与繁殖力性状窝产仔数(ls)相关。窝产仔数：包括母猪生仔猪的实际正常活仔数、死亡仔猪数和畸形活仔猪数，其中死亡仔猪包含正常胎、木乃伊胎和畸形胎。窝产仔数是反映猪种的繁殖能力的重要指标。影响窝产仔数的因素有遗传、排卵、饲养管理、营养、胎次等，一般情况下母猪初胎的产仔数最少，接着持续增加直到第六胎左右达到生产峰值，然后产力开始下降。母猪产仔数的上限由母猪的排卵数所决定，其他的还有受到胚胎存活率和子宫容量的影响，最后实际的产仔数还是受这三者的相互关系影响。
本发明还涉及所述的分子标记在地方猪种育种中的应用。可通过调控pacsin2基因表达量，来对猪种繁殖性状进行调控。
所述地方猪种为下列之一：嵊县花猪、金华猪、淳安花猪。
据统计，近年来我国母猪一年平均产活仔总数只有大约15头，对比相同指标欧美等西方发达国家能够达到20～26头左右，相比之下欧美发达国家母猪一年平均产活仔数比我国要高出33.3％～73.3％，差距相当大。但是许多地方猪种的每胎次平均产仔数和产活仔数量并不比欧美发达国家低，导致这个差距的原因是母猪繁殖流程系统的优化以及管理，如缩短仔猪断奶日期并能够达到断奶标准，从而能缩短母猪哺乳期；缩短母猪哺乳期结束到再次发情的周期；提高人工授精的成功率，减少因没有受精而导致时间的浪费等等。如果每头母猪可以多生产一头仔猪，那么全国每年就可以多出栏几百万头商品猪；若每2到3年可以多产一个胎次，那对于经济带来的收益也将非常巨大。因提高了产量而可以少饲养的母猪可以节约数以百万吨的饲料。母猪的繁殖性状受许多因素的影响，除了环境因素外，影响最大的就是本身的遗传方面。现在国内外的育种人员通过寻找与繁殖性状相关联的遗传标记以及与之相关的遗传力较高的其他性状，并通过直接选择和间接选择来提高繁殖性能。深入和加强对猪繁殖性状的研究，对提高母猪繁殖力以及增加养猪的经济效益有着十分重要的意义，也为加快种猪的改良和培育工作奠定基础。
我国的地方猪种品种繁多并且拥有许多优良的种质特性，特别是浙江地方猪种，繁殖力高，性早熟，肉质鲜美并且抗病力强。浙江省地方猪种包括金华猪、嵊县花猪、嘉兴黑猪、淳安花猪、岔路黑猪、碧湖猪和兰溪花猪。繁殖性状对于地方猪种的育种工作来说十分重要，但由于繁殖性状属于比较复杂的性状，根据目前的研究报导，早期使用微卫星等分子标记检测浙江省地方猪种在繁殖性状上的主效基因，因其数量少，覆盖面小不足以在全基因组的范围上筛选和解释该性状的遗传机制。繁殖性状的遗传力较低，利用常规的育种方法选育难度较大，且进展缓慢。随着分子育种技术的发展与普及，鉴别繁殖性状的主效基因或相关遗传标记，通过标记辅助选育技术能够缩短育种周期，可有效地加速育种进程。利用snp生物芯片技术和全基因组关联分析(gwas)技术能够使用较低的成本和较高的准确率筛选出与繁殖性状关联性强的遗传标记，从而进一步筛选出相应的候选基因，为后期的功能验证以及选种选育，培养更高繁殖力的商品猪种打下基础。
本发明的有益效果主要体现在：本发明首次对浙江省的地方猪种进行gwas分析，来分析snps遗传标记同地方猪种繁殖性状的关联性，从而获得若干最强关联性位点，通过反向定位获得与猪种繁殖性状相关的pacsin2基因分子标记，为地方猪种选种选育提供了基础。
(四)附图说明
图1为嵊县花猪snps分布；
图2为金华猪snps分布；
图3为淳安花猪snps分布；
图4为meta分析snps分布。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
一、材料与方法
1、实验动物
试验所采用的样本分别是3个猪种的群体：114头嵊县花猪，来自于绍兴市嵊花种猪有限公司；185头金华猪，来自于金华家农二头乌种猪有限公司和金华市农科所；31头淳安花猪，来自于淳安县茅山淳安花猪场，这三个群体都是在产母猪。
2、dna的提取和猪50ksnp芯片基因型判型
三个群体的血斑卡样本分别采集于：嵊县花猪采集于2017年6月24日；金华猪采集于2017年6月28日和29日；淳安花猪采集于2017年6月15日。从猪的耳静脉采取血液滴在血斑卡上，血迹充满血斑卡中间的干血斑保存层的黑色圆圈，滴完后放在阴凉通风处干燥至变色，在卡上写清样本编号，合上血斑卡上下层，收集血斑卡常温运输至公司进行dna提取和芯片检测。最终上芯片实验需要大概300ng的基因组dna，运输的时候至少需要1微克的干燥的基因组dna。提取过后的基因组dna要求dna经过琼脂糖凝胶电泳检测，有清晰的条带，长度大于10kb，没有明显的降解，dna样本的od260/280应在1.7-2.1之间。将质检合格的dna样品利用illumina平台的ggpporcine50ksnp芯片进行基因型分型。
3、表型数据
三个猪种的6个繁殖性状的数据来自于绍兴市嵊花种猪有限公司、金华家农二头乌种猪有限公司、金华市农科所和淳安县茅山淳安花猪场的数据记录，这6个繁殖性状分别是产仔数(ls)、产活仔数(lsa)、产公仔数(nm)、产母仔数(nf)、出生窝重(bw)、仔猪平均日增重(adg)。
4、统计分析软件
excel：微软office办公软件之一，用来记录统计分析的表型数据也就是三个猪种的6个繁殖性状数据，做一些简单的数据清理、排布以及计算；
r：一种用于统计分析软件、绘图的语言和操作环境。r是一种基于gnu系统的一个自由、免费、源代码开放的软件，是一个用于统计计算和统计制图的优秀工具。本试验的gwas分析主要的流程在r语言环境中实现。r的官方网址：https://www.r-project.org/；
rstudio：一种专门为r做的集成开发环境，可以实现r的所有功能并做到功能优化，编辑和保存方便，使操作界面变得友好简便。rstudio的官方网址：https://www.rstudio.com/。
5、统计分析
将原始数据整理格式，读入rstudio，运用r语言对原始数据中的snps和样本个体进行质控，筛除掉不符合条件的标记。对于质控后的数据采用一般线性混合模型来计算各snp和繁殖性状之间的关联性，分析模型为：
y＝xβ+zμ+e
其中，y为对应的繁殖性状表型值，x和z是对应的固定效应和随机效应的关联矩阵，β为均值、性别和批次的固定效应向量，μ为所测的snp的替代效应，e为残差。
运用r语言中的genabel包[55]，做以下工作：1.根据包的数据输入要求将芯片判型数据结果整理成对应的格式，生成基因型部分数据，再将来自各猪场的三个猪种6个繁殖性状的表型数据读入并整理成表型部分数据，将两部分数据结合生成“geno.raw”格式的文件保存；2.在r中载入genabel包，作性状概况初步统计，生成文件记录；3.进行第一次质量控制，筛除标记的指标为：最小等位基因频率(maf)<0.05，snp标记检出率(callrateofsnps)<0.95,样本个体检出率(callrateofindividuals)<0.95，亲缘系数(ibs)>0.95，过高的杂合度以及低于校正后的哈迪温伯格平衡值(hwe，fdr<0.2)；4.将样本个体进行亲缘系数聚类，去除亲缘系数值高的个体；5.对剩余的样本个体和遗传标记作第二次质量控制，产生的结果是最终用来分析的样本和标记；6.进行性状描述，生成结果以及snps位点分布图；7.作gwas分析、确定显著性阈值并生成曼哈顿点图和q-q图，输出所有高于显著性阈值的位点及其信息；8.选取各性状显著性强的位点在ncbi等网站获取其详细信息。
运用r语言中的genabel包分别作三个群体的独立gwas和三个群体基于gwas的meta分析。gwas分析中，用了bonferroni校正多重检验[56]来确定关联分析的显著性阈值,其中染色体水平显著阈值＝1/有效snp位点数量；基因组水平显著阈值＝0.05/有效snp位点数量。由于bonferroni校正太为严格，故也采用了较为宽松的fdr校正多重检验[57-58]来确定显著性阈值。校正的方法如下：将snp标记的对应p-value按照p1≤p2≤…≤pk的顺序排列，其中k是有效snp个数；寻找到满足条件：pi≤i/k*0.05的最大的p-value，其中i是对比的第i个样本序号；最后得到的这个最大的p-value即是fdr校正的显著性阈值。
6、候选基因搜寻
根据gwas分析的结果输出和繁殖性状关联性最强的snp位点，再依据snp位点的名称和位置信息在ensembl(http://www.ensembl.org/sus_scrofa/info/index)和ncbi(http://www.ncbi.nlm.n-ih.gov/)上的猪基因组数据库中对应参考寻找这些snps所在或者是最相近的基因，参照基因注释来得出是否可能为性状候选基因。
二、结果与分析
1、繁殖性状描述
将嵊县花猪、金华猪和淳安花猪的性状原始数据和基因型数据整理格式并录入rstudio，合并成“geno.raw”格式文件，利用r语言的genabel包对数据进行第一轮质量控制，得到有效的个体数分别是113头、182头和28头；接着对三个猪种和meta分析分别作形状描述，生成记录文件；结果得到的有效嵊县花猪snp个数为22661个，金华猪34430个，淳安花猪19899个，meta分析有效snp个数为38881个，具体性状描述数据见表1。
表1：嵊县花猪、金华猪和淳安花猪的繁殖性状描述
注：na表示数据缺失
2、质量控制
经过第一轮质控之后，运行r语言genabel包中的ibs函数计算各个猪种个体之间的亲缘系数，并使用kmean函数根据亲缘系数对样本个体进行聚类，筛去亲缘系数过高的个体。作第二轮质控：1.筛除亲缘系数过高样本个体，其中嵊县花猪独立分析25个，金华猪独立分析44个，淳安花猪独立分析10个；2.筛除最小等位基因频率小于0.05的snp标记，其中嵊县花猪独立分析25个，金华猪独立分析6570个，淳安花猪独立分析4236个，meta分析882个；3.筛除遗传标记检出率小于0.95的位点，其中嵊县花猪独立分析23个，金华猪独立分析158个，淳安花猪独立分析323个，meta分析124个；4.筛除低于校正后的哈迪温伯格平衡值(hwe，fdr<0.2)的遗传标记，其中嵊县花猪独立分析92个，金华猪独立分析554个，淳安花猪独立分析38个，meta分析11581个。
经过两轮的质量控制之后，最终得到sxhz独立gwas分析：88个个体和22521个snps,其中1号染色体上snps位点最多有2093个，12号染色体上snps位点最少，只有465个；jhz独立gwas分析：138个个体和27183个snps，其中1号染色体上snps位点最多有2454个，18号染色体上snps位点最少，只有577个；cahz独立gwas分析：18个个体和15345个snps，其中1号染色体上snps位点最多有1392个，x染色体上snps位点最少，只有257个；meta分析：221个个体和26358个snps，其中1号染色体上snps最多有2528个，18号染色体上snps位点最少，只有535个。对应snps的编号位置信息，制作成snps的分布图如图1～4所示。
3、全基因组关联分析
将两轮质控之后嵊县花猪独立gwas分析的22521个snps，金华猪独立gwas分析的27183个snps，淳安花猪独立gwas分析的15345个snps和用于meta分析的26358个snps保存，运用genabel包里的广义线性混合模型和对应的函数，计算出每个snp位点与繁殖性状对应的关联性p值，根据bonferroni校正多重检验确定的显著性阈值和fdr校正多重检验确定的显著性阈值，得到最终的筛选结果，并作曼哈顿点图和q-q图来呈现snps与性状相关联性与其他信息，再根据筛选出的snp位点的名称位置信息等在ensembl和ncbi网站上查找可能的候选基因。
3.1嵊县花猪独立gwas分析结果
嵊县花猪的6个繁殖性状中，ls有16个snps达到fdr校正显著水平，性状lsa有28个snps达到fdr校正显著水平，性状nm有33个snps达到fdr校正显著水平，性状nf有33个snps达到fdr校正显著水平，性状bw有15个snps达到fdr校正显著水平，性状adg有35个snps达到fdr校正显著水平。对照显著性最强的snps位点的名称和位置信息，并通过ensembl和ncbi网站搜寻候选基因，初步确定嵊县花猪的性状ls、lsa、nm、nf、bw、adg所对应的候选基因分别是sema4d、eya4、zc3h12d、banp、dip2b和tusc3。
3.2金华猪独立gwas分析结果
金华猪的繁殖性状中，ls有33个snps达到fdr校正显著水平，性状lsa有35个snps达到fdr校正显著水平，性状nm有23个snps达到fdr校正显著水平，性状nf有33个snps达到fdr校正显著水平。对照显著性最强的snps位点的名称和位置信息，并通过ensembl和ncbi网站搜寻候选基因，初步确定金华猪的性状ls、lsa、nm、nf所对应的候选基因分别是spink14、spink14、grip1和ppp3ca。3.3淳安花猪独立gwas分析结果
淳安花猪的繁殖性状中，ls有22个snps达到fdr校正显著水平，性状lsa有18个snps达到fdr校正显著水平，性状nm有14个snps达到fdr校正显著水平，性状nf有8个snps达到fdr校正显著水平，性状bw有7个snps达到fdr校正显著水平。对照显著性最强的snps位点的名称和位置信息，并通过ensembl和ncbi网站搜寻候选基因，初步确定淳安花猪的性状ls、lsa、nm、nf、bw所对应的候选基因分别是rad51ap2、rad51ap2、trim21、olfm3和pbx1。
3.4meta分析结果
meta分析的6个繁殖性状中，ls有51个snps达到fdr校正显著水平，有1个snp达到bonferroni校正染色体显著水平，性状lsa有44个snps达到fdr校正显著水平，有1个snp达到bonferroni校正染色体显著水平，性状nm有36个snps达到fdr校正显著水平，性状nf有81个snps达到fdr校正显著水平，有4个snps达到bonferroni校正染色体显著水平，性状bw有70个snps达到fdr校正显著水平，有2个snps达到bonferroni校正染色体显著水平，性状adg有55个snps达到fdr校正显著水平，有8个snps达到bonferroni校正染色体显著水平。对照显著性最强的snps位点的名称和位置信息，并通过ensembl和ncbi网站搜寻候选基因，初步确定性状ls、lsa、nm、nf、bw、adg对应的候选基因分别是pacsin2、pacsin2、atp8a2、znf32、ctnna2和fat1。
三、讨论
本研究对嵊县花猪、金华猪和淳安花猪3个群体的6种繁殖性状做了独立gwas分析和基于gwas的meta分析，其中嵊县花猪的独立gwas分析中，采用fdr校正多重检验确定的显著性阈值，共获得160个snps达到显著水平；金华猪群体的独立gwas分析中，采用fdr校正多重检验确定的显著性阈值，共获得124个snps达到显著水平；淳安花猪群体的独立gwas分析中，采用fdr校正多重检验确定的显著性阈值，共获得69个snps达到显著水平，但由于淳安花猪样本量太小，结合qq-plot图结果分析，准确性不高故而不采用；而3个猪种的meta分析中，得到了337个snps呈fdr校正显著，16个snps呈bonferroni校正染色体水平显著。
基于gwas的meta分析比独立gwas得到了更多的snps位点是因为meta把对性状有着相同作用的不同群体的snp位点进行合并，扩大了样本量，增加了gwas分析的可靠性，合并样本也有可能发现新的snps位点。关于繁殖性状产公仔数(nm)和产母仔数(nf)一般认为完全由性染色体决定，但近年来也有科研工作者提出了在受精过程中，卵细胞和精子对于突变基因型是由偏向性的的观点，故在本研究中讨论snps对nm和nf的影响还是有一定意义的。
根据meta分析，通过繁殖性状ls、lsa、nm、nf、bw和adg的snps位点定位的候选基因分别为：pacsin2,pacsin2,atp8a2,znf32,ctnna2和fat1。pacsin2位于5号染色体的5853377bp到5985174bp处，能够调控金属蛋白酶和adam13解聚素，其特征基因序列见seqidno.1，可作为pacsin2基因分子标记。从基因注释和网上的各文献看来，未见定位的基因与研究的繁殖性状的相关关联和报导。
母猪的各繁殖性状都不同程度地受环境的影响。提供一致的生长环境，相同的饲料、喂食量，采取相同的断奶天数，扩大样本量这些都能够增加研究的可靠度，使得分析结果更加准确。不同品种的表型数据存在的差异说明了品种间繁殖性状存在着差异，不同的品种定位的显著性位点不相同说明品种间存在着基因上差异。对于这3个猪种6个繁殖性状的gwas分析研究能够发现影响这些性状的一些因素，为我们对于猪繁殖性状提升的育种工作带来帮助。
序列表
<110>浙江大学
<120>与猪种繁殖性状相关的pacsin2基因分子标记及应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>9903
<212>dna
<213>未知(unknown)
<400>1
ggggcgctctgggctggcggcagaagcggcagcggctgggtagggcagggctgggtaacg60
cggccagagcgagggcgggagccgggccggagccggagtcggagccggggcaggagtcac120
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ggatggaaaattttctctaacttcagaaggcacatgtgcagtggtttgtattaacatact3480
ccatggctatgtgagatttatgtgacttttttcctacttggagtggaaggagcatggatg3540
gagactaggagccccggctctgtccagccctttcctcagtcacataacttaaggtctcag3600
ttttcatgtttgtaaaagtagggccttagaggtccttaaccttgtgagaatctgatagca3660
attagagctgtcttcccagaaagcgcacttggggacagcatcagaggctggaccccagac3720
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