本发明属于生物工程技术领域，具体是一种短管赤眼蜂dna酶及其制备方法与应用。
背景技术：
dna酶广泛存在于多种哺乳动物、虾类、昆虫和植物中，对于个体的发育、细胞正常的老化凋亡、以及防御系统的构建具有重要的生物学功能。dna酶是一种多功能核酸内切酶,可以以非特异性的方式切割dna,作用于两个脱氧核糖核苷酸之间的3',5'-磷酸二酯键，将dna链切割开并将其降解成单个核苷酸或寡聚核苷酸。其中研究最多的是哺乳动物和人类的dna酶，例如来源于牛胰腺的dnasei被广泛应用于生物学研究和医学分子检测试剂盒，而来源于人的重组dnasei还被应用于一些疾病的治疗，例如囊肿性纤维化(cysticfibrosis,cf)、肺不张和复杂性肺炎伴胸腔积液和脓胸等。
在科学研究和分子临床诊断中，dna酶是一个功能强大的工具,可用于一系列的分子生物学应用,包括:反转录pcr(rt-pcr，包括荧光定量法和传统的凝胶成像法)去除模板中dna污染造成的假阳性，组织和细胞rna提取后基因组dna污染的去除，核酸法检测病毒和致病菌时模板中dna污染的去除，以及基因表达调控中dna顺式作用原件的蛋白质特异性结合鉴定等等。
近些年来的研究发现，dna酶也是昆虫防御系统的重要组成部分，例如对黄蜂毒液的主要成分进行分析，发现包括组胺、五羟色胺、蛋白酶、缓激肽、dna酶和透明质酸酶等。相对于人和哺乳动物的dna酶，昆虫的dna酶相关的研究相对较少，对它们的活性研究以及应用实例也处在相对缺乏的状态。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种短管赤眼蜂dna酶及其制备方法与应用。
本发明采用的技术方案如下：通过高通量的dna和蛋白序列的比对以及活性中心保守序列的分析，发现了一个来源于短管赤眼蜂的全新dna酶，该酶由一个以前功能未知的基因编码(trichogrammapretiosumuncharacterized,genbankaccessionnumber:loc111693613)。
本发明提供的一种短管赤眼蜂dna酶，其氨基酸序列如seqidno:3或seqidno:4所示。
本发明还提供一种编码短管赤眼蜂dna酶的基因，其核苷酸序列如seqidno:1或seqidno:2所示。
本发明还提供一种重组载体，在质粒ppic9k上插入了含有上述短管赤眼蜂dna酶的编码基因，其核苷酸序列如seqidno:1或seqidno:2所示。
本发明还提供一种重组细胞，将上述重组载体转化入宿主细胞中获得，优选毕赤氏酵母gs115。
本发明还提供短管赤眼蜂dna酶的制备方法，短管赤眼蜂dna酶是一个以前从未被阐明的未知基因(genbankaccessionnumber:loc111693613)所编码。虽然该基因在dna和蛋白序列上与已知的牛和人的dnasei、北极甜虾的双链特异性dna酶等同源性较低，但是在活性中心的保守催化氨基酸残基以及空间结构与这些已知的dna酶高度相似。首先经过信号肽序列分析，确定了具有dna酶活性的成熟蛋白的序列，并且根据毕赤氏酵母表达系统进行密码子优化以后，将短管赤眼蜂dna酶基因克隆到酵母表达载体中，并通过电击转化方法得到多拷贝整合到酵母基因组dna中的表达系统，并进行高密度发酵和乙醇诱导表达得到短管赤眼蜂dna酶，体外dna降解实验表明，短管赤眼蜂dna酶能有效降解双链dna，其活性与来源于牛胰腺的dnasei相当，短管赤眼蜂dna酶具有较强的脱氧核糖核酸酶活性，并且其活性高度依赖于二价镁离子(mg2+)，加入高于镁离子浓度的螯合剂edta后可有效抑制其酶活。
本发明的短管赤眼蜂dna酶经过纯化后，具有较强的dna降解活性，成功应用于去除pcr或qrt-pcr反应体系中残留的痕量dna污染，提高致病菌核酸检测试剂盒的准确性。
本发明的有益效果是：本发明的短管赤眼蜂dna酶具有较强的dna降解活性，成功应用于去除pcr、rna提取和反转录或qrt-pcr反应体系中残留的痕量dna污染，提高致病菌核酸检测试剂盒的准确性。此外，微生物发酵方法生产蛋白质或抗体过程中，从全细胞裂解液中提取蛋白时，加入该dna酶能有效降低粘度，有效去除基因组dna杂质，提高纯度，降低提纯工艺的难度。
附图说明
图1为本发明短管赤眼蜂dna酶活性中心及附近序列与其它一些已知的dna酶的序列比对；
图2为本发明短管赤眼蜂dna酶的蛋白序列n端信号肽分析；
图3为本发明正确携带短管赤眼蜂的dna酶基因的ppic9k质粒图谱；
图4为用毕赤氏酵母分泌表达的短管赤眼蜂dna酶的发酵上清液对质粒dna的降解活性检测；
图5为用毕赤氏酵母分泌表达的短管赤眼蜂dna酶经过纯化后，应用于致病菌核酸检测试剂盒的模板污染物的去除结果检测；
图6为毕赤氏酵母分泌表达的短管赤眼蜂dna酶经过纯化后的sds-page电泳考马斯亮蓝染色结果示意图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明所涉及到的术语除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“dna酶”意指可以特异性或非特异性方式将线性或者环状的脱氧核糖核酸的3',5'-磷酸二酯键，将dna链切割开并将其降解成单个核苷酸或二聚、三聚或者寡聚核苷酸的具有催化活性的蛋白质。
术语“信号肽”意指一个短的肽(通常16-30氨基酸长)，位于新合成的分泌蛋白质的n-端，这些蛋白质包括那些最终定位于胞外或者某些细胞器之内(内质网，高尔基体或体)的从细胞内分泌的蛋白。信号肽在将目的蛋白转运到细胞器或者胞外后，将被特异性的酶切除，从而获得成熟的蛋白质。
术语“pcr”意指聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr。聚合酶链式反应(pcr)是体外酶促合成特异dna片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有dna、rna的地方。聚合酶链反应(polymerasechainreaction，简称pcr)又称无细胞分子克隆或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增技术。
术语“引物”意指一小段单链dna或rna，作为dna复制的起始点，除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的dna复制和聚合酶链式反应(pcr)中人工合成的引物(通常为dna引物)。之所以需要引物是因为在dna合成中dna聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的dna链上。除非特定限制，否则上游引物为在dna复制时，作为dna模板3’端的复制起始点的引物，下游引物为在dna复制时，作为dna模板5’端的复制起始点的引物。
术语“缓冲液”意指一类当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液ph变化作用的溶液。
实施例1、短管赤眼蜂dna基因全合成及克隆
通过高通量的dna和蛋白序列数据库的比对以及活性中心保守序列的分析，我们在genbank基因库中发现了一个来源于短管赤眼蜂的功能未知的基因(genbankaccessionnumber:loc111693613)，该基因编码的蛋白虽然在dna序列和全蛋白序列上与现在已知的dna酶同源性较低，例如，和蝗虫的非特异性核酸酶(genbankaccessionnumber:kx652408.1)的同源性只有36％，但是通过对催化中心保守序列的分析，发现该短管赤眼蜂蛋白的c端与已知的dna酶同源性较高。图1是短管赤眼蜂基因loc111693613编码的蛋白序列与几个已知的核酸酶序列的同源性比较。chio为雪蟹(chionoecetesopilio)的双链特异性核酸酶蛋白序列，cule为致倦库蚊(culexquinquefasciatus)的脱氧核糖核酸酶i蛋白序列，tric为本发明所述的短管赤眼蜂(trichogrammapreciosum)功能未知基因loc111693613编码的疑似核酸酶序列，mars为日本囊对虾(marsupenaeusjaponicus)的脱氧核糖核酸酶i序列，leth为半翅目大田鳖属(lethocerusdistinctifemur)的毒液dna酶。比较的结果发现，短管赤眼蜂基因loc111693613在c端，尤其是靠近核酸酶活性中心的序列与另外几种核酸酶有较高的同源性，并且含有dna酶典型的活性中心保守催化氨基酸k/rgh(氨基酸第227-229位)其中的his229是典型的催化氨基酸残基，在催化氨基酸下游的20个氨基酸位点还含有典型的辅助因子结合位点天门冬酰胺asn259。基于以上的生物信息学序列分析，我们推测该基因编码一个全新的dna酶。为了验证，我们构建了表达短管赤眼蜂的dna酶基因的酵母真核表达载体。
如果采用大肠杆菌等革兰氏阴性细菌外源蛋白表达系统，表达的dna酶会在细胞内部积累。但是dna酶对细胞本身的dna有一定的毒性，会在表达过程中降解宿主的基因组dna以及本身的表达质粒载体dna，从而杀死宿主细胞。且高等动物编码的蛋白，在大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌里面表达有可能会有活性低、缺乏翻译后修饰、无法正确折叠以及形成不溶性包涵体等问题，基于以上考量，我们优选了毕赤氏酵母pichiapastoris分泌表达系统来表达dna酶。毕赤氏酵母可以对表达的蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰，使得表达的动物蛋白比原核系统表达的活性更高。而且毕赤氏酵母可以通过在目的蛋白的n-端加上α-factor等信号肽，将蛋白分泌到胞外，一方面可以避免由于短时间内大量表达目的蛋白而导致的浓度过高，蛋白来不及正确折叠而相互交联聚集形成包涵体的现象，另一方面避免了dna酶对宿主基因组dna的损伤，并且可以大大简化后提取纯化的工艺流程。
由于细胞对dna酶的敏感性，动物细胞往往会在其n端加上一个信号肽，使得酶在细胞内部刚合成时处于无活性的酶原状态，而只有分泌到细胞外，将信号肽切割以后才能形成有活性的成熟酶。我们最初选用了全长的短管赤眼蜂疑似dna酶基因，经过适合酵母表达的密码子优化后，进行了基因合成，序列seqidno:1和seqidno:3分别是全长的dna序列及其编码的蛋白序列。经克隆表达后，发现没有明显可检测到的酶活。经signalp-4.1软件分析后，发现n端的16个氨基酸高度疑似为信号肽(图2为signalp-4.1软件分析结果，seqidno:5和seqidno:7分别是预测的信号肽dna序列和多肽序列)。于是采用pcr扩增不含n端16个氨基酸信号肽的dna序列，并通过闪电克隆试剂盒或者经典的限制性内切酶酶切-t4连接酶等方法，将该dna片段克隆到毕赤氏酵母表达系统中。
具体操作如下：
第1步，将短管赤眼蜂基因loc111693613(编码疑似dnase，缩写为tpdnase)序列进行针对毕赤氏酵母的密码子优化，将dna序列通过全序列基因合成，并连接到克隆质粒puc57的ecorv位点。为了将此基因克隆到毕赤氏酵母质粒ppic9k中,采用pcr扩增的方法，用pfu、pfuultra以及phusiondnapolymerase等高保真聚合酶，使用引物tpdnase-f和tpdnase-r将tpdnase基因(不含n端信号肽的成熟蛋白序列)从puc57克隆载体中扩增出来，所述引物tpdnase-f和tpdnase-r的核苷酸序列如seqidno:7和seqidno:8所示，序列seqidno:2和seqidno:4分别是不含信号肽的的编码成熟的tpdnase的dna序列及其编码的蛋白序列。
(1)pcr反应体系：
(2)pcr反应程序：
第2步、使用任意的商用pcr仪，例如thermoscientificarktikthermocyclerpcr仪进行扩增反应。反应结束以后，使用任意市售的pcr产物纯化试剂盒，如gen-focibiotech(annarbor，mi，usa)公司生产的pcr纯化试剂盒等，按照生产商的说明对pcr产物进行纯化。
第3步、将毕赤氏酵母表达载体ppic9k进行snabi和noti双酶切，将酶切产物经过热变性失活以后，跑0.7％琼脂糖电泳，并且在紫外灯下用手术刀片切下酶切过的线性化的ppic9k载体大片段条带，使用任意市售的dna胶回收纯化试剂盒，如gen-foci(annarbor，mi，usa)的胶回收试剂盒等，按照生产商的说明从琼脂糖凝胶中回收酶切过的ppic9k载体，用于目的基因的克隆连接，胶回收步骤可以防止载体自连。
第4步、采用闪电克隆试剂盒(金福赛(北京)生物科技)，通过同源重组的方法，将pcr扩增获得的表达tpdnase的基因dna片段与snabi/noti酶切过的ppic9k载体连接，得到真核表达编码tpdnase基因的克隆。具体连接方法如下：将纯化过的pcr产物和线性化的ppic9k载体按照1:1至10:1的比例，优选3:1的比例混合(例如，90ng：30ng)，加入反应总体积1/2的2x闪电克隆mix(金福赛(北京)生物科技)，mix中包含闪电克隆酶、连接反应缓冲液以及nad+辅酶，50℃，15-60分钟，优选30分钟进行连接。反应完成后，取1μ连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，并涂在含有50ug/ml卡那霉素的lb(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％nacl，ph7.0)抗性平皿上37℃过夜培养。挑单菌落，培养并提取质粒，通过菌落pcr和基因测序来筛选正确携带tpdnase基因的ppic9k质粒阳性克隆，所述质粒即为ppic9k-t.pretiosumwaspdnase，图谱如图3所示。编码短管赤眼蜂的dna酶的基因被克隆到了ppic9k质粒的snabi/noti位点，并于5’-上游的α-factor信号肽序列读码框一致。
实施例2、表达载体构建
制备毕赤氏酵母gs115的感受态细胞，用电击法将表达短管赤眼蜂dna酶的质粒ppic9k-t.pretiosumwaspdnase转入毕赤氏酵母菌株，并筛选阳性克隆。
第一步、毕赤氏酵母gs115的感受态细胞的制备：
(1)将保藏的毕赤氏酵母菌株gs115在ypd板上划线活化，30℃培养2天。
(2)将活化好的酵母接种到5毫升ypd培养基中,30℃,200rpm震荡培养约20小时至od260到2-3。
(3)接种1/400体积(约250ul)酵母过夜培养物到100毫升ypd培养基中，30℃,200rpm震荡培养约20小时到od600到达1-2。
(4)4℃,2000rpm离心5分钟收集细胞，小心倒掉上清液。
(5)用24mlypd/hepes缓冲液(20mlypd,4ml1mhepes-kohph8.0，过滤灭菌)轻柔的重悬细胞，加入0.6ml1mdtt，并在室温孵育30分钟。
(6)4℃,2000rpm离心5分钟收集细胞，小心倒掉上清液。
(7)用3毫升冰预冷的灭菌1m山梨醇缓冲液重悬细胞,然后2000rpm离心5分钟收集细胞。
(8)重复用3毫升冰预冷的灭菌1m山梨醇缓冲液洗涤细胞二次(一共3次)。
(9)用1ml冰预冷的灭菌1m山梨醇缓冲液重悬酵母细胞,感受态细胞最终浓度约1010细胞/毫升。
第二步、电击法转化：
将表达短管赤眼蜂dna酶的ppic9k-t.pretiosumwaspdnase质粒经测序确认后，用质粒提取试剂盒进行提取，然后用saci限制性内切酶进行酶切线性化，经纯化后，取1-10uldna,加入到80ul新鲜制备的gs115毕赤氏酵母感受态细胞中，轻轻混匀后，转移到2mm狭缝的电击杯中，使用bio-radgenepulser或相似的电穿孔仪，用推荐的程序电击法转化酵母gs115感受态细胞。电击完成后，加入1ml冰预冷的灭菌1m山梨醇缓冲液重悬细胞，将细胞涂布到含有200ug/ml遗传霉素抗生素的ypd平板上筛选tpdnase基因序列整合到gs115酵母基因组中的阳性克隆。根据invitrogen的研究结果，目的蛋白的表达量和插入到酵母基因组中的目的基因拷贝数成正比。将各个阳性克隆划单菌落后，分别涂到ypd+500到4000ug/ml遗传霉素抗生素平板上，筛选多拷贝插入、表达量高的克隆。
实施例3、短管赤眼蜂dna酶的表达和纯化
通过甲醇诱导aox1启动子驱动的dna酶在毕赤氏酵母中的表达，采用发酵的方法进行tpdnase的酵母表达。
在5l发酵罐中，采用bmgy培养基(yeastextract1％，peptone2％，磷酸钾缓冲液(ph6.0)100mmol/l，ynb1.34％，生物素20mg/l，methanol3％)，30℃发酵培养，溶氧整体控制在20-30％，在葡萄糖耗尽之后开始流加甲醇至终浓度1％进行dna酶诱导表达。采用流加方式，将甲醇浓度控制在0.8-1％，诱导60小时之后发酵结束，进行短管赤眼蜂dna酶的后处理纯化。
毕赤氏酵母表达的酶蛋白是分泌到胞外的，所以可以直接离心或过滤去除菌体。取上清，超滤浓缩至1/5体积后，用ph6.5的pbs磷酸盐缓冲液进行一次超滤溶剂置换和脱盐，后直接上柱纯化。采用sp-sepharose离子交换层析介质(gehealthcarelifesciences,pittsburgh,pa,usa),进行第一步离子交换层析纯化，第二步用羟基磷灰石介质进行柱层析，去除绝大部分的其他杂质，最后得到纯度达到99％以上的短管赤眼蜂dna酶。纯化后的蛋白跑sds-page胶，用考马斯亮蓝染色的结果如图6所示(泳道：1、蛋白质分子量标准；2、纯化后的短管赤眼蜂dna酶。
实施例4、短管赤眼蜂dna酶的活性检测
采用降解质粒dna的方法对短管赤眼蜂dna酶的活性进行检测。在常用的dna酶ph6.0-8.0下，优选ph7.0-8.0下，更优选，ph7.5下，在1-10分钟孵育时间内，采用的温度范围为30至40℃，优选37℃，通过检测不同浓度的短管赤眼蜂dna酶对质粒dna的降解能力来测定其活性。所有纯化的短管赤眼蜂dna酶在反应缓冲液(10mmtris-hcl,ph7.5,5mmmgcl2,1mmcacl2,)中进行1x、1/2x、1/5、1/10x和1/20x的梯度稀释，在适宜温度下进行孵育，产物进行热失活处理后跑琼脂糖胶，根据质粒dna的降解程度来测定酶活性。
短管赤眼蜂dna酶活性测定具体步骤：
(1)将20ul的150ng/ul的闭合环状双链质粒dna、3ul的10x反应缓冲液、0.5ul的短管赤眼蜂dna酶(各种稀释度以及不含dna酶的对照)以及6.5ul灭菌双蒸水加样到一个1.5ml的离心管中并混匀。
(2)在37℃孵育1-10分钟，优选的是5分钟。
(3)反应完成后，在70℃孵育5-20分钟，优选的是10分钟，以失活dna酶。
(4)13000rpm离心1分钟，从每管反应中取1-10ul,优选3ul上样到琼脂糖凝胶中，用适宜的电压进行电泳分离。
(5)电泳结束后染色并用凝胶成像仪照相分析。
结果如图4所示，图中，m为dna分子量标准；泳道1为未加dna酶的质粒对照；泳道2为加入0.5ul的1x短管赤眼蜂dna酶的质粒降解结果；泳道3为加入0.5ul的1/2x短管赤眼蜂dna酶的质粒降解结果；泳道4为加入0.5ul1/5x短管赤眼蜂dna酶的质粒降解结果；泳道5为加入0.5ul的1/10x短管赤眼蜂dna酶的质粒降解结果；泳道6为加入0.5ul的1/20x短管赤眼蜂dna酶的质粒降解结果。对图中结果分析得到，未加dna酶的对照，质粒dna在电泳中呈现正常的条带；而加入不同稀释度的短管赤眼蜂dna酶后，质粒dna受到了降解，且降解程度随着酶浓度的增加而提高。在加入1/2x和1x的短管赤眼蜂dna酶的反应中，质粒dna被充分降解成≤0.1kb的小片段。在稀释20倍的短管赤眼蜂dna酶反应中，仍能有效降解质粒dna。本实施例明确阐明了新的短管赤眼蜂dna酶能够在适宜条件下高效降解脱氧核糖核酸dna，为将短管赤眼蜂dna酶应用rna样品中dna污染的去除和提高致病菌核酸检测试剂盒的准确性等应用提供了便利条件。
实施例5、在致病菌核酸检测试剂盒中添加短管赤眼蜂dna酶提高检测的准确性。
核酸法检测致病菌和病毒是现有的最准确和最高效的方法，其原理是首先提取病人的唾液、血液、口腔咽拭子等生物样本，提取核酸后，作为模板，采用致病菌或病毒特异性的引物和探针进行pcr检测或者rt-pcr检测。该方法不仅能检测致病菌的有无，还能检测同一种致病菌的不同亚型。但是此方法的潜在局限性是由于用于dna扩增反应的酶或者其它组分或多或少存在dna污染，从而造成假阳性的结果，即原本不含致病菌的样本也可能被检测出阳性结果。但是如果我们使用dna酶对反应液进行预处理，则会大大增加检测反应的准确性，基本消除假阳性的结果。在本实施例中，我们用短管赤眼蜂dna酶来处理了一个市售的金黄色葡萄球菌污染检测试剂盒。
具体步骤为：(1)按照金黄色葡萄球菌污染检测试剂盒的说明书配制pcr反应体系，不加入模板dna。(2)体系中加入1/100体积的短管赤眼蜂dna酶，37℃反应10分钟。(3)70℃水浴处理15分钟以灭活dna酶。(4)13000rpm离心5分钟，将处理过的反应液转移到新的灭菌pcr管中。(5)加入模板dna或者用1ul灭菌水代替模板，进行pcr扩增反应，取3ul跑琼脂糖胶，照相并进行结果分析。
结果如图5所示，其中，m为dna分子量标准；泳道1为加入含金黄色葡萄球菌的dna模板的pcr结果，泳道2为只加入灭菌双蒸水为模板的pcr结果；泳道3为反应体系用短管赤眼蜂dna酶提前处理过，并加入含金黄色葡萄球菌的dna模板的pcr结果；泳道4为为反应体系用短管赤眼蜂dna酶提前处理过，并加入灭菌双蒸水为模板的pcr结果；泳道1、2分别是未经dna酶处理的金黄色葡萄球菌污染检测试剂，我们发现，加入含金黄色葡萄球菌的dna模板(泳道1)或加入不含细菌dna的灭菌水作为模板对照(泳道2)都能扩增出目的条带，即假阳性比较严重。而检测试剂经过我们的短管赤眼蜂dna酶处理之后，加入含金黄色葡萄球菌的dna模板仍然能扩增出目的条带(泳道3)，而加入不含细菌dna的灭菌水作为模板对照则无明显条带出现(泳道4)。本实验说明，短管赤眼蜂dna酶处理能够去除反应体系中残留的痕量dna污染，大大提高致病菌pcr核酸检测试剂盒的准确性。
序列表
<110>南通大学
<120>一种短管赤眼蜂dna酶及其制备方法与应用
<141>2018-05-29
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>386
<212>prt
<213>短管赤眼蜂(trichogrammapretiosum)
<400>1
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<210>2
<211>1161
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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