本发明涉及生物细胞技术领域，具体涉及一种嗜中性粒细胞的富集分离方法，尤其是闭鳔鱼类嗜中性粒细胞的富集分离方法。
背景技术：
硬骨鱼类，大多数都有鳔。鱼鳔的体积约占身体的5％左右。鱼鳔位于体腔背方的长形薄囊，内含空气，通过鱼鳔肌调节鱼鳔的收缩和膨胀可以使鱼在水中上升或下沉。鳔有一根鳔管与食道相通，称为喉鳔，属较低等的硬骨鱼类的鳔，如鲤鱼。无鳔管的鳔，称为闭鳔，闭鳔由一个完全闭合的膜形成的小气室组成，属高等硬骨鱼类的鳔，如罗非鱼、大口黑鲈、花鲈等。
嗜中性粒细胞呈圆形，胞质淡红色。胞核幼稚型的呈杆状或马蹄形，成熟的呈分叶状，三叶的较多见。嗜中性粒细胞来源于骨髓的造血干细胞，在骨髓中分化发育后，进入血液或免疫组织。嗜中性粒细胞绝大部分分布在骨髓和结缔组织，血液中的数量分布占比只有2％，但在血液中嗜中性粒细胞的数量约占白细胞总数的55％以上，其在杀灭异物病原中发挥强大的防御作用。
当病原菌入侵宿主某部位时，感染部位特异定居的巨噬细胞等免疫细胞释放大量趋化因子，吸引中性粒细胞向感染部位聚集，募集而来的中性粒细胞受细菌产物、抗原抗体复合物等作用时，细胞的颗粒内容物向细胞外释放。释出的酸性蛋白酶和中性蛋白酶，可以分解血管基膜、肾小球基膜、结缔组织的胶原蛋白与弹性蛋白以及血浆中的补体c5、c15和激肽原等。这些释放的分解产物有的又是中性粒细胞趋化因子，能继续吸引募集更多的中性粒细胞和其他免疫细胞，形成复杂的趋化因子网络系统。巨噬细胞与中性粒细胞在炎症部位的相互招募和聚集促进了吞噬细胞间的协同合作，这不仅能增强它们的杀菌作用，而且能促进感染性炎症的恢复。
炎症部位定居的巨噬细胞和募集而来的中性粒细胞，通过固定的模式识别受体(prrs)识别病原菌细胞内保守的病原相关分子模式(pamps)。中性粒细胞的片足与产生趋化因子的异物接触后，接触处周围的胞质形成隆起，将异物包围，形成含有异物的吞噬体或吞噬泡。嗜中性粒细胞膜表面有iggfc受体和补体c3受体，可加速吞噬作用。细胞随着吞噬作用的开始，导致细胞膜紊乱而引起呼吸爆发，细胞耗氧量增加，产生大量的过氧化物及超氧化物等细胞毒性效应分子，对寄生虫具有杀伤活性。在ifn-γ和tnf刺激下，则可产生更多的过氧代谢阴离子，杀死胞外病原。中性粒细胞在杀死吞噬的细菌等异物后，本身也死亡，死亡的中性粒细胞则成为脓细胞。
因此，如何高效的富集分离到嗜中性粒细胞，尤其是从闭鳔鱼类中得到高纯度的嗜中性粒细胞，具有重要的意义。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种嗜中性粒细胞的富集分离方法，通过在鱼鳔内注射灭活菌液趋化嗜中性粒细胞，诱导嗜中性细胞趋化募集到鳔中，分离出数量多且单一的嗜中性粒细胞，方法简单高效，所得嗜中性粒细胞纯度高。
为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种嗜中性粒细胞的富集分离方法，具体过程如下：
1)用第一注射器向闭鳔类鱼体的鱼鳔内注射大肠杆菌灭活菌液后，继续培养；
2)用第二注射器沿原注射孔向步骤1)所得闭鳔类鱼体的鱼鳔内注射hbss，轻轻颠倒鱼体；
3)用第三注射器从闭鳔类鱼体的原注射孔中抽出嗜中性粒细胞悬液。
进一步地，所述步骤1)中，闭鳔类鱼体在注射前经过室内养殖观察以排除鱼体携带病原的可能，所述室内养殖的条件如下：隔天换水约1/3，溶氧保持在5.0mg/l以上，ph7.0～8.0，水温(30±2)℃，每天投喂饲料两次，每次投喂饲料质量约为鱼体质量的3％。
进一步地，所述步骤1)中，大肠杆菌灭活菌液的配制过程如下：
a)大肠杆菌菌种解冻并培养，长出菌落后挑取单菌落培养至稳定期；
b)培养的菌液离心收集菌体，用pbs缓冲液洗涤菌体；
c)重悬菌液再次离心收集菌体，加入2mg/ml福尔马林重悬菌体灭活，灭活时间为18-24小时；
d)灭活菌液离心收集菌体并称重；菌体用hbss悬浮，浓度控制为5mg/ml(菌体/hbss)。
进一步优选地，所述步骤1)中，大肠杆菌灭活菌液的配制过程如下：
a)冻存保存的大肠杆菌菌种常温解冻并在固体培养基上划线培养，长出菌落后挑取单菌落置于液体培养基培养至稳定期；
b)培养的菌液置于冷冻离心机在≥4000r/min4℃条件下离心10分钟，去除上清，收集菌体，用50-100ml预冷的pbs缓冲液(0.033mol/l)洗涤菌体；
c)重悬菌液再次于冷冻离心机在4000r/min4℃离心10分钟，去除上清，收集菌体，加入20-50ml福尔马林(甲醛，2mg/ml)重悬菌体灭活18-24小时；
d)灭活菌液置于冷冻离心机在≥4000r/min4℃条件下离心10分钟，去除上清，收集菌体并称重；菌体用hbss悬浮，浓度控制为5mg/ml(菌体/hbss)。
进一步地，所述第一注射器为1ml一次性注射器。
进一步地，所述大肠杆菌灭活菌液的注射量为每50g鱼体注射0.2ml。
进一步地，所述闭鳔类鱼体为罗非鱼。所述步骤1)中注射的位置为罗非鱼侧线鳞上一排鳞片的第二个鳞片。
进一步地，所述原注射孔是指步骤1)中第一注射器注射后在鱼体上留下的孔。
进一步地，所述步骤1)中继续培养的条件如下:注射后的鱼放回25-30℃水温的鱼缸继续培养12-24小时。
进一步地，所述第二注射器为5ml一次性注射器。
进一步地，所述hbss的注射量为0.8-2ml。优选地，所述hbss是指100单位/mlhbss中加入肝素的hbss溶液。
进一步地，所述步骤2)中轻轻颠倒鱼体的次数约2～10次。
进一步地，所述第三注射器为装有50ml切平的注射器针头的5ml注射器(如图1所示)。
富集分离嗜中性粒细胞有助于嗜中性粒细胞的趋化作用机制、嗜中性粒细胞的吞噬和分泌作用机制、巨噬细胞与嗜中性粒细胞的协同抗炎杀菌作用以及嗜中性粒细胞与病原菌的免疫互作机制的研究。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提出了嗜中性粒细胞的富集分离方法，尤其是一种闭鳔鱼类嗜中性粒细胞的富集分离方法，通过这种方法可以分离到较高纯度的嗜中性粒细胞悬液，克服了通过抽取鱼体血液再进行培养分离方法的工作量大，容易污染，周期长，纯度低的缺点。本发明操作简便、特异性强，适用于对鱼体嗜中性粒细胞的趋化与吞噬免疫机制研究及嗜中性粒细胞与病原的抗病致病互作机制研究，为探究嗜中性粒细胞的趋化作用机制、嗜中性粒细胞的吞噬和分泌作用机制、巨噬细胞与嗜中性粒细胞的协同抗炎杀菌作用以及嗜中性粒细胞与病原菌的免疫互作机制的研究提供线路。
附图说明
图1为本发明优选实施例中50ml切平的注射器针头的制备过程；
图2为本发明优选实施例中分别采用不同方法分离的嗜中性粒细胞悬液涂片示意图，a为全血细胞涂片，b为通过抗凝血密度梯度离心法提取的嗜中性粒细胞悬液涂片，c为通过本发明优选实施例的方法提取的嗜中性粒细胞悬液涂片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
1.实验材料：
1.1实验鱼：挑选50-200g的健康闭鳔鱼类(如罗非鱼)，在室内养殖条件下暂养观察2周。实验前抽样检测确认实验鱼不携带病菌、寄生虫等病原，并解剖鱼体，确定其鳔的位置及腔体大小形状，确定注射位置(如确定注射部位为侧线鳞上一排鳞片的第二个鳞片(鳃盖后)那里)。隔天换水约1/3，溶氧保持在5.0mg/l以上，ph7.0～8.0，水温(30±2)℃，每天投喂饲料两次，每次投喂饲料质量约为鱼体质量的3％。
1.2大肠杆菌灭活菌液：冻存保存的大肠杆菌(escherichiacoli)菌种常温解冻并在固体培养基上划线培养，长出菌落后挑取单菌落置于液体培养基培养至稳定期；培养的菌液置于冷冻离心机在≥4000r/min4℃条件下离心10分钟，去除上清，收集菌体，用50-100ml预冷的pbs缓冲液(0.033mol/l)洗涤菌体；重悬菌液再次于冷冻离心机在4000r/min4℃离心10分钟，去除上清，收集菌体，加入20-50ml福尔马林(甲醛，2mg/ml)重悬菌体灭活18-24小时；灭活菌液置于冷冻离心机在≥4000r/min4℃条件下离心10分钟，去除上清，收集菌体并称重；菌体用hbss(hanks’bufferedsaltsolution，汉克斯缓冲盐溶液，无钙镁离子)悬浮，浓度控制为5mg/ml(菌体/hbss)。
1.3注射器：准备1、5和50ml一次性注射器，将50ml注射器针头按图1所示将尖的针头切成平的针头后用于5ml的注射器。
2.分离细胞：按每条鱼用1ml一次性注射器按50g注射0.2ml大肠杆菌灭活菌液，注射位置为鱼鳔，确定注射精确部位(如罗非鱼在侧线鳞上一排鳞片的第二个鳞片那里)，注射和分离细胞都要在同一面扎针，要不然鱼鳔会漏气和萎蔫；注射后的鱼放回25-30℃水温的鱼缸继续培养12-24小时；向鱼体原注射孔注射0.8-2mlhbss(按100units/mlhbss加入肝素)，将鱼体轻轻颠倒几次，洗下鱼鳔腔体上的嗜中性粒细胞，将50ml切平的注射器针头装到5ml的注射器上，向鱼体原注射孔插入缓缓抽出嗜中性粒细胞悬液。
实施例2
细胞检测：用10-100ul规格的移液器吸取10-30ul嗜中性粒细胞悬液，涂于载玻片上，使用南京建成生物工程研究所的瑞氏-姬姆萨复合染液(wright-giemsastain)试剂盒进行染色，滴加试剂一2-3滴，使其迅速盖满悬液，染色约1分钟，以固定细胞；在加入试剂二3-5滴，轻摇玻片或用洗耳球对准细胞悬液涂片吹气使染液充分混匀，染色5-8分钟。水洗30秒，用生物显微镜进行观测。
运用上述方法对全血细胞悬液、通过抗凝血密度梯度离心法提取的嗜中性粒细胞悬液、本发明实施例1方法提取的嗜中性粒细胞悬液的图片进行比对，结果如图2所示。
正常的全血细胞中，白细胞的占比不足10％，而嗜中性粒细胞占白细胞总数的50～70％；通过传统密度梯度离心与纯化获取嗜中性粒细胞，可以获得较高纯度的嗜中性粒细胞，但这种方法存在几点制约性：1)需要抽取大量的血液进行梯度离心纯化；2)必须精确掌握梯度离心分离液配制、离心速度及时间以及分离层细胞的分离；3)在密度梯度离心之前，加入红细胞沉降剂去除红细胞，但这样会损失一部分白细胞(约30％)。本发明实施例1方法提取嗜中性粒细胞悬液，具有操作简便，活体富集细胞，且富集的嗜中性粒细胞具有纯度高和细胞活性强等优势。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。