碳酸钙的制备方法与流程

本发明属于生物矿化技术领域，具体涉及一种碳酸钙的制备方法。

背景技术

生物矿化是微生物活动引起环境的化学变化而导致矿物质沉淀的现象。相比于化学法，微生物诱导碳酸钙生成的方法绿色环保，被应用于建筑修复、矿渣处理等领域。典型的微生物诱导碳酸钙的过程中，微生物能够分泌一种或多种代谢产物(co3^2-)与环境中的ca²⁺发生反应，进而导致碳酸钙沉淀。很多微生物都能够诱导碳酸钙生成，其中，产脲酶菌株巴氏芽孢八叠球菌(sporosarcinapasteurii)能够通过尿素水解作用诱导碳酸钙形成，利用脲酶催化尿素水解产生氨和碳酸盐。在这个反应中，1mol尿素被水解为1mol氨和1mol氨基甲酸(式1.3.1)，氨基甲酸自发水解为1mol氨和1mol碳酸(式1.3.2)。nh3和h2co3在水中进一步平衡形成碳酸氢盐(式1.3.3)和2mol氨、2mol氢氧根离子(式1.3.4)。产生的氢氧根离子使环境中的ph升高，从而改变碳酸氢盐的平衡，形成碳酸根离子(式1.3.5)。nh4⁺的产生增加了局部ph值，因此该反应可以自发的持续形成碳酸钙。

co(nh2)2+h2o→nh2cooh+nh3(1.3.1)

nh2cooh+h2o→nh3+h2co3(1.3.2)

利用模板法合成碳酸钙可以通过模板诱导碳酸钙的生长，来控制碳酸钙的形貌。目前，利用模板法合成碳酸钙多见于化学法合成碳酸钙，模板法在微生物法合成碳酸钙中尚不常见。我们利用微生物诱导生成的碳酸钙为模板用微生物法制备了碳酸钙。而对于其它模板，例如：聚苯乙烯磺酸钠及化学合成的碳酸钙，则无法作为微生物法制备碳酸钙的模板。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种碳酸钙的制备方法，以便解决上述问题的至少之一。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种碳酸钙的制备方法，包括以下步骤：(1)配制细菌生长的培养基，灭菌后，加入过滤除菌的尿素，得到含尿素的培养基，将巴氏芽孢八叠球菌菌株接种入所述含尿素的培养基中，过夜振荡培养，得到巴氏芽孢八叠球菌菌液；(2)配制钙盐溶液，过滤除菌后加入所述含尿素的培养基中，得到产碳酸钙培养基，取步骤(1)制备的所述巴氏芽孢八叠球菌菌液，去掉培养基后加入新鲜液体培养基混悬，将混悬后的菌液加入所述产碳酸钙培养基中，振荡培养，形成碳酸钙；取出形成碳酸钙后的菌液，彻底去除培养基，然后烘干制得微生物成因的碳酸钙；(3)取步骤(1)制备的巴氏芽孢八叠球菌菌液，去掉培养基后加入所述含尿素的培养基混悬，使得细菌微环境ph恢复至中性；使用所述产碳酸钙培养基稀释菌液至od600为0.01～0.1，取步骤(2)得到的所述微生物成因的碳酸钙加入稀释后的菌液中得到新的碳酸钙。

优选地，步骤(1)中，所述细菌生长的培养基为营养肉汤培养基或酵母提取物培养基。

优选地，所述营养肉汤培养基的组成为：按质量分数计，蛋白胨1％，牛肉膏1％，氯化钠0.5％，硫酸铵1％。

优选地，所述酵母提取物培养基的组成为：按质量分数计，酵母粉2％，硫酸铵1％，三羟甲基氨基甲烷0.15％。

优选地，所述含尿素的培养基中，尿素的质量分数为2％。

优选地，步骤(1)中，巴氏芽孢八叠球菌菌株培养的温度为20～35℃，转速为150～250rpm。

优选地，步骤(2)中，所述钙盐溶液包括氯化钙溶液。

优选地，步骤(2)中，所述形成碳酸钙后的菌液彻底去除培养基的方法为：离心后去掉上清液，再使用超纯水重悬，重复至少三次。

优选地，步骤(2)中，所述微生物成因的碳酸钙的烘干温度为50～100℃。

优选地，步骤(2)中，所述产碳酸钙培养基中钙盐的浓度≥25mmol/l。

从上述技术方案可以看出，本发明的碳酸钙的制备方法具有以下有益效果：

(1)利用模板法诱导碳酸钙的生成，可以使碳酸钙在特定的位点生长；

(2)本发明采用的巴氏芽孢八叠球菌是一种嗜碱性的芽孢菌，可以忍受高碱性的极端环境，因此可以作为生物建筑的菌株；

(3)由于巴氏芽孢八叠球菌广泛存在于自然环境中，且无毒害作用。细菌在利用尿素水解诱导碳酸钙沉淀生成时，不需要引入其他外来的微生物，能够保持原有的生态环境。且与混凝土的相容性好，负面效应弱，不会对结构和环境造成不可逆的反应，对生态平衡具有积极的作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中显微镜下观察到的碳酸钙在以微生物成因的碳酸钙的模板上生长的过程；

图2为本发明实施例1中25mmcacl2时碳酸钙的生长速度；

图3为本发明实施例2中100mmcacl2时碳酸钙的生长速度。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明公开了一种碳酸钙的制备方法，包括以下步骤：制备含尿素的培养基，将巴氏芽孢八叠球菌菌株接种入其中，培养得到巴氏芽孢八叠球菌菌液；制备产碳酸钙培养基，取巴氏芽孢八叠球菌菌液，处理后加入产碳酸钙培养基中，振荡培养形成碳酸钙；取出形成碳酸钙后的菌液，去除培养基然后烘干，制得微生物成因的碳酸钙；取巴氏芽孢八叠球菌菌液，使细菌微环境ph恢复至中性；用产碳酸钙培养基稀释菌液至od600为0.01～0.1，取微生物成因的碳酸钙加入稀释后的菌液中得到新的碳酸钙。本发明的碳酸钙的制备方法利用模板法诱导碳酸钙的生成，可以使碳酸钙在特定的位点生长，有广阔的应用前景。

具体地，本发明公开的碳酸钙的制备方法，包括以下步骤：(1)配制细菌生长的培养基，灭菌后，加入过滤除菌的尿素，得到含尿素的培养基，将巴氏芽孢八叠球菌菌株接种入所述含尿素的培养基中，过夜振荡培养，得到巴氏芽孢八叠球菌菌液；(2)配制钙盐溶液，过滤除菌后加入所述含尿素的培养基中，得到产碳酸钙培养基，取步骤(1)制备的所述巴氏芽孢八叠球菌菌液，去掉培养基后加入新鲜液体培养基混悬，将混悬后的菌液加入所述产碳酸钙培养基中，振荡培养，形成碳酸钙；取出形成碳酸钙后的菌液，彻底去除培养基，然后烘干制得微生物成因的碳酸钙；(3)取步骤(1)制备的巴氏芽孢八叠球菌菌液，去掉培养基后加入所述含尿素的培养基混悬，使得细菌微环境ph恢复至中性；使用所述产碳酸钙培养基稀释菌液至od600为0.01～0.1，取步骤(2)得到的所述微生物成因的碳酸钙加入稀释后的菌液中得到新的碳酸钙。

步骤(1)中，所述细菌生长的培养基为营养肉汤培养基或酵母提取物培养基。

所述营养肉汤培养基的组成为：按质量分数计，蛋白胨1％，牛肉膏1％，氯化钠0.5％，硫酸铵1％。

所述酵母提取物培养基的组成为：按质量分数计，酵母粉2％，硫酸铵1％，三羟甲基氨基甲烷0.15％。

所述含尿素的培养基中，尿素的质量分数为2％。

步骤(1)中，巴氏芽孢八叠球菌菌株培养的温度为20～35℃，转速为150～250rpm。

步骤(2)中，所述钙盐溶液包括氯化钙溶液。

步骤(2)中，所述形成碳酸钙后的菌液彻底去除培养基的方法为：离心后去掉上清液，再使用超纯水重悬，重复至少三次。

步骤(2)中，所述微生物成因的碳酸钙的烘干温度为50～100℃。

步骤(2)中，所述产碳酸钙培养基中钙盐的浓度≥25mmol/l。

本发明实施例中所用的巴氏芽孢八叠球菌菌株来源购买自美国atcc细胞库。

以下结合具体实施例和附图，对本发明提供的碳酸钙的制备方法作进一步的详细说明。

实施例1

制备碳酸钙的步骤

(1)配制营养肉汤培养基，原料成分如表1，121℃高温灭菌20min后，加入过滤除菌的尿素(2％)，从而得到含尿素的营养肉汤培养基。将培养在琼脂平板上的菌株接种入含尿素的营养肉汤液体培养基的试管中，30℃下220rpm转速下过夜振荡培养，得到对数后期的菌液。

表1培养基方案

(2)配制0.37g/ml的氯化钙溶液，过滤除菌后取1ml加入配制好的100ml含有尿素的营养肉汤培养基中，得到含有25mm氯化钙和尿素的营养肉汤培养基。取1ml过夜培养之后的菌液以6000rpm、1min条件离心后去掉上清液，加入1ml新鲜的培养基重悬，使得细菌微环境ph恢复至中性。测量菌液od600，使用含氯化钙和尿素的营养肉汤培养基稀释菌液得到1mlod600为0.01的菌液。再取适量微生物成因的碳酸钙加入其中。取400μl样品于全自动倒置荧光显微镜下，以100倍观察，并以3秒每帧的速度拍摄样品变化过程。

结果表征

图1为显微镜下观察到的碳酸钙在以微生物成因的碳酸钙的模板上生长的过程。如图1所示，在以微生物成因的碳酸钙(图1a)位点上，新的碳酸钙晶体不断生长(图1b-d)，最终观察到碳酸钙的再生长过程。

图2为本发明实施例1中25mmcacl2时碳酸钙的生长速度。如图2所示，碳酸钙在位点上生长初期，生长速度最快，达到1.6μm/min。随着晶体的不断增大，生长速率逐渐降低，在大约60min时停止生长。

实施例2

制备碳酸钙的步骤

(1)配制营养肉汤培养基，原料成分如表1，121℃高温灭菌20min后，加入过滤除菌的尿素(2％)，从而得到含尿素的营养肉汤培养基。将培养在琼脂平板上的菌株接种入含尿素的营养肉汤液体培养基的试管中，30℃下220rpm转速下过夜振荡培养，得到对数后期的菌液。

(2)配制0.74g/ml的氯化钙溶液，过滤除菌后取2ml加入配制好的100ml含有尿素的营养肉汤培养基中，得到含有100mm氯化钙和尿素的营养肉汤培养基。取1ml过夜培养之后的菌液以6000rpm、1min条件离心后去掉上清液，加入1ml新鲜的培养基重悬，使得细菌微环境ph恢复至中性。测量菌液od600，使用含有氯化钙和尿素的营养肉汤培养基稀释菌液得到1mlod600为0.01的菌液。再取适量微生物成因的碳酸钙加入其中。取400μl样品于全自动倒置荧光显微镜下，以100x观察，并以3s/frame的速度记录样品变化过程。最终观察到碳酸钙的再生长过程。

结果表征

图3为本发明实施例2中100mmcacl2时碳酸钙的生长速度。如图3所示，碳酸钙在位点上生长初期，生长速度最快，达到1.8μm/min。随着晶体的不断增大，生长速率逐渐降低，在大约140min时停止生长。氯化钙浓度越高，碳酸钙在模板上的生长速度越快，生长时间越长，最终形成的碳酸钙颗粒尺寸越大。

综上所述，本发明的碳酸钙的制备方法利用模板法诱导碳酸钙的生成，可以使碳酸钙在特定的位点生长，有广阔的应用前景。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。