一种微卫星不稳定状态的复合扩增检测体系及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种微卫星不稳定状态的复合扩增检测体系及其应用。
背景技术：
微卫星序列是由1-6个碱基组成的短串联重复，高度可变，在真核生物基因组中无处不在。由于高度可变性，微卫星在人群中趋于变化，因此被广泛用作分子标记、连锁作图、谱系作图和基因型鉴定的目的。人类基因组中大约3％的区域含有微卫星序列，具有单核苷酸重复序列特征，其中poly(a/t)片段最为丰富。微卫星突变率位点间差别很大，每个位点的变异范围在10-6～10-2之间，同时微卫星变异的倾向随着重复数增加而变大。微卫星不稳定(msi)是指在dna复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象，常由错配修复(mmr)功能缺陷引起。msi现象于1993年被jacobs等人在结直肠癌中首次发现，与癌症发生有关，可用于癌症检测。大量研究表明，msi是由错配修复(mmr)基因发生缺陷引起的，与肿瘤的发生密切相关。1997年nci(美国国家癌症研究所)发布指南(常被称为贝塞斯达指南：bethesdaguidelines)，推荐d17s250、d2s123、d5s346、bat-25、bat-26五个位点作为msi检测的相关位点，同时制定了相对应的判断标准。即在msi检测位点为五个时；大于等于2个位点突变定义为msi-h，1个位点突变定义为msi-l，没有突变位点定义为mss；检测位点大于5个时：突变位点大于等于30％为msi-h，突变位点大于等于10％小于29％为msi-l，突变位点小于10％为mss。在2015年，国际肿瘤综合网(nationalcomprehensivecancernetwork，nccn)和美国临床肿瘤学会(americansocietyofclinicaloncology，asco)都更新了结直肠癌相关的指南，指南规定所有的结直肠癌病人都应该进行肿瘤dna错配修复(mmr)缺陷状态的检测，可以通过免疫组化检测mmr蛋白或者通过pcr技术进行msi检测。两个指南虽明确了dna错配修复缺陷状态的两种检测方法(mmr蛋白免疫组化检测法和msi微卫星dna的pcr检测法)；但两个指南都没有明确msi检测应选择那些位点。2017年5月24日，美国fda批准了医药界巨头默沙东(msd)的keytruda(pembrolizumab)治疗带有微卫星不稳定性高(msi-h)或者错配修复缺陷(dmmr)的实体瘤患者。这是fda首次批准不依据肿瘤的来源，而是依照生物标志物进行区分的抗肿瘤疗法。据披露该项目采用的msi检测位点为bat-25、bat-26、nr-21、nr-24、mono27，同贝塞斯达指南所推荐的五个位点只有2个位点相同，其判断的标准同贝塞斯达指南所推荐的一致。另外随着研究的深入，最近有文献报道，一些重复区域在40bp以上的长单核苷酸重复位点(long-mononucleotiderepeat，lmr)具有更高的突变频率及更好的灵敏度。lmr在临床样本中的突变频率比常规的微卫星位点(重复区域为20-30bp)有显著增加。这些lmr位点可以更准确的反应基因组微卫星不稳定的情况，使msi的检测灵敏性、特异性得到进一步提升。cn107299139a公开了一种用于检测微卫星不稳定性的组合物及其应用，用于检测微卫星不稳定性的组合物包括分别针对用于检测待检样品中与微卫星不稳定性相关的特异性目的基因的引物对，用于检测微卫星不稳定性的试剂盒采用特异性的多重荧光pcr片段分析毛细管电泳法检测bat26、bat25、nr21、nr24、nr27、mono27、d5s346、d2s123和d17s250这9个位点和pentac、pentad、amel这3个位点的微卫星分布情况，用于判断微卫星是处于稳定还是不稳定状态。cn102230004a涉及肿瘤细胞微卫星不稳定状态的复合扩增体系及检测试剂盒，该发明选取8个准单态性单核苷酸重复位点(nr-21、nr-22、nr-24、nr-27、bat-25、bat-26、mono-27、cat-25)对msi进行检测。同时，我们加入1个性别位点(amel)，建立9个位点的多重复合扩增体系，增加了性别决定位点amel，一定程度上可防止实验操作员混淆样本而得出错误结果。cn106498090a公开了一种用于检测dna错配修复系统的试剂盒及其用途，该试剂盒包含一扩增体系，该扩增体系包含pcr引物混合液和pcr反应液；所述的pcr引物混合液包含微卫星位点。所述的pcr引物混合液包含微卫星位点，该微卫星位点包含：nr-21、nr-24、bat-25、bat-26、mono-27、bat-48、bat-49a、bat-49b、bat-50a、bat-50b、bat-51a、bat-51b、bat-51c、bat-51d、bat-51e、bat-51f、bat-52a、bat-52b、bat-53a、bat-53b、bat-53c、bat-54、bat-55、bat-56a、bat-56b、bat-57、bat-59、bat-59b、bat-60a、bat-60b、bat-60c、bat-62、bat-63a、bat-63b、bat-68a、bat-68b、bat-69、bat-72、bat-73、bat-79、bat-83、bat-90、bgt-60、pentac、pentad、pentae中的任意一种或两种以上串联重复位点单核苷酸a或者g大于40个重复。但上述现有技术中提供的检测体系最终的检测结果参差不齐，特异性和灵敏度都有待提高，且没有明确的判断标准，亟待优化和改善。因此，提供一种微卫星不稳定状态的复合扩增检测体系，以提高检测结果的灵敏度和特异性，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种微卫星不稳定状态的复合扩增体系及其应用，所述体系筛选多个检测位点，并添加了试剂内参位点，优化检测条件及引物浓度，最终实现了对检测样品的高效、准确和灵敏的检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种微卫星不稳定状态的复合扩增检测体系，所述扩增检测体系的扩增位点包括9个单核苷酸重复位点；其中，所述9个单核苷酸重复位点为：nr-21、nr-24、bat-25、bat-26、mono-27、bat-52、bat-56、bat-59和bat-60。由于微卫星不稳定检测在肿瘤免疫治疗过程中起到越来越重要的指导作用，本发明基于目前的需要，提供了一种基于荧光pcr-毛细管电泳片段分析的方法来检测人体肿瘤细胞中微卫星不稳定的状态，根据目前国际上和文献报道的使用比较广泛的msi位点，经过多重复杂实验进行筛选和验证，最终选取了9个单核苷酸重复位点，其中包含5个常规单核苷酸重复位点：nr-21、nr-24、bat-25、bat-26和mono-27；4个长单核苷酸(lmr)重复位点：bat-52、bat-56、bat-59和bat-60，9个位点的检测结果相互联系并辅佐验证，最终实现对样品的高效准确检测，通过对病人肿瘤样本和正常组织进行msi检测，比较两者的不同并得出最终msi稳定性状态的结果。优选地，所述扩增检测体系中的扩增位点还包括内参系统位点。优选地，所述内参系统位点包括2个五核苷酸重复位点。优选地，所述2个五核苷酸重复位点为pentac和pentad。优选地，所述内参系统位点还包括2个试剂内参位点。优选地，所述2个试剂内参位点的设计模板为puc18质粒序列，位点为qs90和qs330，扩增产物为90bp和330bp的pcr扩增引物。本发明所述的扩增体系还包含2个样本内参五核苷酸位点pentac和pentad。样本内参位点的作用是核对同一例病人的肿瘤样本与正常组织样本的对应性，以防大量实验中造成样本混淆不配对的现象，致使检测结果出现错误。本发明所述的扩增体系还包含2个试剂内参位点qs90和qs330。试剂内参位点的作用是检测本扩增体系的有效性，无论是否加入待检样本dna，经过一个完整的扩增及检测流程，本复合扩增体系的结果中均会出现qs90和qs330的扩增信号。本发明选取的9个msi位点(nr-21、nr-24、bat-25、bat-26、mono-27、bat-52、bat-56、bat-59和bat-60)具有高度的灵敏度和特异性，用于检测微卫星不稳定状态比较准确可靠，另外，通过比较病人肿瘤细胞和正常细胞的这9个位点的变化，能够区分出不同类型的msi状态，比如9个位点中有3个及以上位点发生变化，则定义为msi-h(微卫星高不稳定状态)，只有1个或2个位点变化的定义为msi-l(微卫星低不稳定状态)，没有任何位点发生变化的定义为mss(微卫星稳定状态)。除了上述的9个msi检测位点，发明人还加入了2个五核苷酸位点(pentac和pentad)，选取这两个五核苷酸重复序列，是因为这两个位点在人群中具有高水平的多态性和低程度的微卫星不稳定性，能够唯一的识别样本是否来自于同一个病人，防止样品污染，作为有效的样本质控；同时还创造性的加入了试剂内参位点用于监测本发明复合扩增体系的有效性，避免因为试剂失效对检测结果造成的困扰。优选地，所述扩增检测体系中的被扩增位点，分别由四种不同颜色的荧光素标记，四种不同颜色的标记组合为：第一组qs90、bat-26、pentad、nr-24、qs330；第二组nr-21、mono-27和bat-60；第三组bat-25、bat-59和pentac；第四组bat-56和bat-52。优选地，所述四种不同颜色的荧光素包括：fam、hex、tet、joe、tam、ned、vic、cy3、cy5、rox或tamra中的任意四种，优选为fam、joe、tam、rox。具体地，所述四种不同颜色的荧光素标记组合为：qs90、bat-26、pentad、nr-24、qs330标记fam；nr-21、mono-27、bat-60标记joe；bat-25、bat-59、pentac标记tam；bat-56、bat-52标记rox。优选地，所述每个被扩增位点由一对引物扩增，其中一个引物的5’末端带有荧光素标记。优选地，所述9个单核苷酸重复位点的引物分别为：nr-21的引物核苷酸序列如seqidno.1-2所示；nr-24的引物的核苷酸序列如seqidno.3-4所示；bat-25的引物的核苷酸序列如seqidno.5-6所示；bat-26的引物的核苷酸序列如seqidno.7-8所示；mono-27的引物的核苷酸序列如seqidno.9-10所示；bat-52的引物的核苷酸序列如seqidno.11-12所示；bat-56的引物的核苷酸序列如seqidno.13-14所示；bat-59的引物的核苷酸序列如seqidno.15-16所示；bat-60的引物的核苷酸序列如seqidno.17-18所示。优选地，所示2个五核苷酸重复位点的引物分别为：pentac的引物的核苷酸序列如seqidno.19-20所示；pentad的引物的核苷酸序列如seqidno.21-22所示；所述复合扩增检测体系具体引物序列表见表1；表1.本发明msi位点及样本内参基因引物名称及序列信息优选地，所述试剂内参位点的引物分别为：qs330的引物的核苷酸序列如seqidno.23-24所示；qs90的引物的核苷酸序列如seqidno.25-26所示。本发明所述的复合扩增体系中涉及到的2个试剂内参位点的设计参考为puc18质粒，参考puc18质粒的序列，分别设计扩增产物为90bp和330bp的pcr扩增引物，本扩增体系中所用的试剂内参模板为puc18质粒，所述qs位点引物序列见表2；表2.本发明试剂内参位点引物名称及序列信息本发明中，若所述扩增体系的总体积为10μl，则其中pcr缓冲液5μl，10×引物混合物1.0μl，热启动taq酶0.05μl，试剂内参模板1.0μl，模板dna1μl，去离子水1.95μl。第二方面，本发明提供一种检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的复合扩增检测体系。优选地，所述试剂盒包括pcr缓冲液、10×引物混合物、热启动taq酶、试剂内参模板、模板dna和去离子水。优选地，所述扩增体系的扩增条件为：94℃热启动，60-90秒；94℃变性，30-60秒；58-62℃退火，70-90秒；扩增30-40个循环；60℃终延伸，30-60分钟。优选地，所述10×引物混合物的引物浓度分别为：nr-21的引物浓度为0.134-0.215μmol/l，例如可以是0.134μmol/l、0.140μmol/l、0.150μmol/l、0.160μmol/l、0.170μmol/l、0.180μmol/l、0.190μmol/l、0.200μmol/l、0.210μmol/l或0.215μmol/l；nnr-24的引物浓度为0.178-0.207μmol/l，例如可以是0.178μmol/l、0.180μmol/l、0.190μmol/l、0.200μmol/l或0.207μmol/l；bat-25的引物浓度为0.230-0.259μmol/l，例如可以是0.230μmol/l、0.240μmol/l、0.250μmol/l或0.259μmol/l；bat-26的引物浓度为0.145-0.173μmol/l，例如可以是0.145μmol/l、0.150μmol/l、0.160μmol/l、0.170μmol/l或0.173μmol/l；mono-27的引物浓度为0.098-0.112μmol/l，例如可以是0.098μmol/l、0.100μmol/l、0.110μmol/l或0.112μmol/l；bat-52的引物浓度为0.108-0.150μmol/l，例如可以是0.108μmol/l、0.110μmol/l、0.120μmol/l、0.130μmol/l、0.140μmol/l或0.150μmol/l；bat-56的引物浓度为0.085-0.120μmol/l，例如可以是0.085μmol/l、0.090μmol/l、0.100μmol/l、0.110μmol/l或0.120μmol/l；bat-59的引物浓度为0.265-0.310μmol/l，例如可以是0.265μmol/l、0.270μmol/l、0.280μmol/l、0.290μmol/l、0.300μmol/l或0.310μmol/l；bat-60的引物浓度为0.250-0.285μmol/l，例如可以是0.250μmol/l、0.260μmol/l、0.270μmol/l、0.280μmol/l或0.285μmol/l；pentac的引物浓度为0.076-0.100μmol/l，例如可以是0.076μmol/l、0.080μmol/l、0.090μmol/l或0.100μmol/l；pentad的引物浓度为0.125-0.145μmol/l，例如可以是0.125μmol/l、0.130μmol/l、0.140μmol/l或0.145μmol/l；qs330的引物浓度为0.505-0.850μmol/l，例如可以是0.505μmol/l、0.600μmol/l、0.700μmol/l、0.800μmol/l或0.850μmol/l；qs90的引物浓度为0.060-0.080μmol/l，例如可以是0.060μmol/l、0.070μmol/l或0.080μmol/l。所述的10×引物混合物中的引物浓度比例见表3；表3.本发明复合扩增体系各位点引物浓度信息第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的扩增检测体系和/或第二方面所述的试剂盒用于制备检测癌症的药物和/或试剂。优选地，所述癌症为实体癌，包括宫内膜癌、结肠腺癌、胃腺癌、直肠腺癌、肾透明细胞癌、卵巢浆液性囊腺癌、前列腺癌、肺腺癌、头颈部鳞癌、肝细胞肝癌、肺鳞癌、膀胱尿路上皮癌、多形性成胶质细胞瘤、脑低级胶质瘤、乳腺浸润性癌、肾乳头状细胞癌、皮肤黑色素瘤或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明提供msi检测体系能够在一管反应中同时扩增13个位点，具有较高的特异性和灵敏性，相比市场上其他公司的产品在实验时间、检测灵敏度、准确性方面均有较大程度的提高；同时加入了样本内参和试剂内参的位点，使得在整个msi检测过程中避免了样本的混淆和试剂失效等因素的干扰，具有较高的应用价值，主要用于病人肿瘤组织微卫星不稳定状态的检测；(2)本发明提供的扩增体系操作简单，节省原料，成本较低，且整个扩增流程所需时间短，方便操作，结果便于分析，更为准确、灵敏，可大规模检测分析临床样本，更快更准确的提供检测结果。附图说明图1为采用本发明检测的k562细胞系dna的msi状态的分型图谱；图2(a)为采用本发明检测的结直肠癌(crc)病人a0051的正常组织msi状态的分型图谱；图2(b)为采用本发明检测的结直肠癌(crc)病人a0051的肿瘤组织msi状态的分型图谱；图3(a)为采用本发明检测的结直肠癌(crc)病人a0076的正常组织msi状态的分型图谱；图3(b)为采用本发明检测的结直肠癌(crc)病人a0076的肿瘤组织msi状态的分型图谱；图4(a)为采用本发明检测的结直肠癌(crc)病人a0078正常组织msi状态的分型图谱；图4(b)为采用本发明检测的结直肠癌(crc)病人a0078的肿瘤组织msi状态的分型图谱。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例1微卫星不稳定复合扩增体系的设计与建立1.引物组合的设计首先，经复杂实验设计并选取具有高度灵敏性及特异性的微卫星位点，包括5个单核苷酸位点和4个长单核苷酸(lmr)重复位点，包括：nr-21、nr-24、bat-25、bat-26、mono-27、bat-52、bat-56、bat-59和bat-60，以及2个样本内参位点。我们参照文献报道的这11个位点所在基因的genebank序列号，从ncbi核酸数据库找到各位点所对应的基因序列，各位点的genebank号见表4，每个位点对应的引物对序列见引物序列表4；表4.msi位点信息msi位点genebank号主要重复序列nr-21xm_033393.121(a)nr-24x60152.124(a)bat-25l04143.125(a)bat-26u41210.126(a)mono-27ac00768427(a)bat-52nt_011651.1852(a)bat-56nt_011726.1356(a)bat-59ac090424.1859(a)bat-60nt_00818360(a)pentacal138752.53-15(aaaag)pentadac003656.12-17(aaaag)本发明所述的复合扩增体系中涉及到的2个试剂内参位点的设计参考为puc18质粒，参考puc18质粒的序列，分别设计扩增产物为90bp和330bp的pcr扩增引物，本扩增体系中所用的试剂内参模板为puc18质粒。引物设计原则：本发明中用于检测msi的13对引物是由primer5和ncbiblast软件设计完成；多重pcr成功的先决条件是最佳的设计引物对，多重pcr引物长度在19-29个核苷酸之间，多重pcr引物的gc含量在40％-60％之间。多重pcr各引物的tm值≥60℃，本发明将各引物的tm值尽量控制在相同的水平，保证所有引物对能在同一退火温度下扩增。设计完成后将各引物对用ncbiblast软件进行比对，确保各引物在合适范围内能够比对到比较单一的结果。各对引物的扩增产物大小至少相差10bp以上。另外，所有设计的引物用autodimer软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用情况，确保特异性和防止二聚体的出现。引物设计并合成好之后，首先进行单重pcr引物验证，分别用k562细胞系dna，和结直肠癌病人dna进行验证，分别用13对引物进行单重扩增，扩增完成后将扩增产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果，对pcr的体系和扩增条件作出调整；最终保证在同一扩增体系和同一扩增条件下，13对引物都能获得单一特异性条带。2.荧光标记系统建立单重pcr荧光标记引物验证，将上一步验证好的13对引物进行荧光标记，分成四组。第一组qs90、bat-26、pentad、nr-24、qs330标记fam；第二组nr-21、mono-27、bat-60标记vic；bat-25、bat-59、pentac标记ned；第四组bat-56、bat-52标记pet；然后按照上一步的体系和扩增条件进行单重扩增。扩增产物置于abi3500dx遗传分析仪上进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率；其后，将同一荧光标记的对多引物混合置于同一个反应管中扩增，将扩增产物置于abi3500dx遗传分析仪上进行毛细管电泳检测，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率，以及判断同一荧光标记的多对引物混合扩增是否引起非特异性；最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的浓度，将13对引物混合置于同一个反应管中，再根据复合扩增的电泳结果来调节各引物对的浓度比例，使各引物对的扩增效率基本上一致为准，结果见图1所示；由图1可知，k562细胞系dna扩增的结果明确显示了该细胞系dna的基因分型，同时该结果证明了本扩增体系的结果：无非特异扩增，每个检测位点只有1个或者2个目的峰型，扩增效率基本上满足一致要求。本发明所述的复合扩增体系的扩增产物的长度范围为90-330bp之间，本发明的检测组分中的等位基因标准物为liz600，采用liz橙色荧光素标记，可以明确的标记区分检测样本中各个微卫星位点及内参位点的长度大小。3.检测样本类型本发明所述的微卫星不稳定检测体系所适用的样本要求为：肿瘤样本和正常组织样本需为同一例病人的配对样本。肿瘤样本可以是石蜡包埋组织样本、新鲜冰冻组织样本、新鲜样本等；正常组织样本可以是癌旁正常组织样本、血液样本(无血液病，edta抗凝)等；所述的肿瘤样本来源为不限癌症种类的实体瘤患者。实施例2试剂盒的组装将pcr缓冲液、10×引物混合物、热启动taq酶、试剂内参模板、模板dna、去离子水和说明书组装成试剂盒。实施例3肿瘤组织样本检测选取了3例结直肠癌病人(病人血液样本作为对照样本)，采用本发明复合扩增体系，对其肿瘤细胞微卫星不稳定状态进行检测，具体操作步骤如下：1.ffpe样本dna提取使用qiagen公司的qiaampdnaffpetissuekit分别对结直肠癌病人的肿瘤和癌旁ffpe样本进行dna提取，然后使用nanodrop进行dna浓度和质量检测，ffpe样本提取的dna最好用qubit重新定量，最后稀释成5ng/μl浓度。2.pcr扩增2.110×msi引物混合液准备首先将荧光标记的13对引物使用tebuffer溶解成100μm母液，然后按表3的要求配置成10×引物混合液；2.2扩增体系准备按照下表5所示的扩增体系配制pcr扩增体系；表5.msi扩增体系msi复合扩增体系10μlpcr缓冲液(含mg2+、dntp)5μl热启动taq酶0.05μl10x引物混合物1μl试剂内参模板(puc18质粒)1μl模板dna1μl去离子水1.95μl2.3扩增条件本发明所述的pcr扩增反应使用的pcr仪为abi7500，在整个扩增循环过程中不采集荧光信号；具体的反应程序见表6，其扩增产物可于4℃避光保存一周；表6.本发明复合扩增体系的pcr反应程序3.毛细管电泳检测按照毛细管电泳机器的上样说明，在abi3500dx上进行检测，得出图谱结果，见图2(a)-图2(b)、图3(a)-图3(b)及图4(a)-图4(b)所示。由图2(a)-图2(b)、图3(a)-图3(b)及图4(a)-图4(b)可知，病例a0051的正常癌旁组织(图2a)和肿瘤组织(图2b)的检测结果相比，两者的msi分型一致，所有检测位点没有出现大于或等于5bp及以上的位移，所以判断该例样本的msi分型为mss；病例a0076的正常癌旁组织(图3a)和肿瘤组织(图3b)的检测结果相比，两者的msi分型不一致，所有检测位点(bat-25、bat-26、bat-52、bat-56、bat-59、bat-60、mono-27、nr-21、nr-24)均出现了大于5bp以上的位移，所以判断该例样本的msi分型为msi-h；病例a0078的正常癌旁组织(图4a)和肿瘤组织(图4b)的检测结果相比，两者的msi分型不一致，两个检测位点(bat-59、mono-27)出现了大于5bp以上的位移，其余7个位点(bat-25、bat-26、bat-52、bat-56、bat-60、nr-21、nr-24)的msi分型两者一致，所以判断该例样本的msi分型为msi-l。4.结果解读和说明根据微卫星不稳定状态检测判定标准，肿瘤组织中的9个微卫星位点(nr-21、nr-24、bat-25、bat-26、mono-27、bat-52、bat-56、bat-59和bat-60)与正常组织相比，9个位点中有3个及以上位点发生变化，则定义为msi-h(微卫星高不稳定状态)，只有1个或2个位点变化的定义为msi-l(微卫星低不稳定状态)，没有任何位点发生变化的定义为mss(微卫星稳定状态)。并且同时2个五核苷酸位点pentac和pentad均未发生改变，说明肿瘤组织和正常组织来自于同一个人，未发生样品污染；2个试剂内参位点qs90和qs330均有有效扩增产物信号，因此判定整个微卫星不稳定检测体系有效。针对具体的样本的结果判读如下表7：表7.肿瘤样本检测结果实施例4与市面上常见同类产品的比较本实施例选取了promega公司的同类产品microsatelliteinstabilityanalysis微卫星不稳定状态分析(md1641)进行比较，实验总共选取了53例对肿瘤样本(含配对的正常组织)进行同步对比测试，在对这53例对肿瘤样本(含配对的正常组织)的检测结果，结果见表8所示；表8.53例对肿瘤样本(含配对的正常组织)的检测结果对比(promega试剂产品和本发明体系)分析表8后发现其中：有1例样本用promega试剂盒检测结果为mss，用本发明所述的复合扩增体系检测结果为msi-l；有1例样本用promega试剂盒检测结果为mss，用本发明所述的复合扩增体系检测结果为msi-h；有2例样本用promega试剂盒检测结果为msi-l，用本发明所述的复合扩增体系检测结果为msi-h；其余49例样本用两种试剂检测结果一致，结果见见表9；表9.promega试剂产品和本发明体系检测结果分类统计同时对本发明及promega试剂产品进行灵敏度特异性等参数的比较，比较结果发现在以上述53例对肿瘤样本(含配对的正常组织)的结果进行统计计算后发现，本发明的灵敏度优于promage试剂产品；在以promega试剂产品作为标准比较时，结果见表10；表10.以promega试剂产品作为标准比较结果的一致性及灵敏度、特异度灵敏度＝100.00％；灵敏度＝正样本预测结果数/实际正样本数漏诊率＝0.00％；漏诊率＝被预测为负的正样本结果数/实际正样本数误诊率＝5.41％；误诊率＝被预测为正的负样本结果数/实际负样本数特异度＝94.59％；特异度＝负样本预测结果数/实际负样本数本发明的检测灵敏度达到100％，由于本发明在其中4例对肿瘤样本(含配对的正常组织)的检测结果与promega试剂产品不是完全符合，但是本发明的结果检测出了promage试剂产品未检测出的结果，所以本发明的特异性是优于promage试剂产品，因此在进行结果比较时，将本发明的结果作为统计标，的话，promage试剂产品的灵敏度为本发明的88.89％，漏诊率为11.11％，特异度为94.6％，结果见表11；表11.以本发明试剂产品作为标准比较结果的一致性及灵敏度、特异度灵敏度＝88.89％；灵敏度＝正样本预测结果数/实际正样本数；漏诊率＝11.11％；漏诊率＝被预测为负的正样本结果数/实际正样本数；误诊率＝0.00％；误诊率＝被预测为正的负样本结果数/实际负样本数；特异度＝100.00％；特异度＝负样本预测结果数/实际负样本数。综上所述，本发明提供的复合扩增检测体系选取的9个msi位点(nr-21、nr-24、bat-25、bat-26、mono-27、bat-52、bat-56、bat-59和bat-60)具有高度的灵敏度和特异性，用于检测微卫星不稳定状态比较准确可靠；同时创造性的加入了试剂内参位点用于监测本发明复合扩增体系的有效性，避免因为试剂失效对检测结果造成的困扰；本发明所用的扩增体系简单，节省原料，成本较低，且整个扩增流程所需时间短，方便操作，主要用于病人肿瘤组织微卫星不稳定状态的检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>凯杰（苏州）转化医学研究有限公司<120>一种微卫星不稳定状态的复合扩增检测体系及其应用<130>2018年<160>26<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工合成<400>1ccctttcagcagaattccagcc22<210>2<211>21<212>dna<213>人工合成<400>2acaaacaagaaaagtgttgct21<210>3<211>24<212>dna<213>人工合成<400>3gcccttcctcaagacctaaaatag24<210>4<211>21<212>dna<213>人工合成<400>4aggcaggagaatggcgtgaac21<210>5<211>22<212>dna<213>人工合成<400>5gtgggagtgattctctaaagag22<210>6<211>19<212>dna<213>人工合成<400>6tatggctctaaaatgctct19<210>7<211>21<212>dna<213>人工合成<400>7gacttcagccagtatatgaaa21<210>8<211>29<212>dna<213>人工合成<400>8ctcctttataagcttcttcagtatatgtc29<210>9<211>25<212>dna<213>人工合成<400>9agattgcagtgagctgagattgcgc25<210>10<211>25<212>dna<213>人工合成<400>10tctcctttcttaagggtggatcaaa25<210>11<211>21<212>dna<213>人工合成<400>11ctggcagtgagaatttcaagc21<210>12<211>23<212>dna<213>人工合成<400>12agggccctgggtttcaagcacaa23<210>13<211>25<212>dna<213>人工合成<400>13agaaatctgagtactcctgggcatg25<210>14<211>24<212>dna<213>人工合成<400>14atctaattaactagtcccgcgata24<210>15<211>24<212>dna<213>人工合成<400>15gaggctgcagtgagccaatatcga24<210>16<211>25<212>dna<213>人工合成<400>16ggacttttcttgtttcatatttttc25<210>17<211>26<212>dna<213>人工合成<400>17atgcctacattgtagaagggtctcat26<210>18<211>23<212>dna<213>人工合成<400>18gcatgattttattctttcgggat23<210>19<211>19<212>dna<213>人工合成<400>19ccaagcgcacccccaattc19<210>20<211>19<212>dna<213>人工合成<400>20tgccctacccacttgtcat19<210>21<211>22<212>dna<213>人工合成<400>21gagcctggaaggtcgaagctga22<210>22<211>25<212>dna<213>人工合成<400>22gtcatgattttgtgatatctaagaa25<210>23<211>19<212>dna<213>人工合成<400>23gaccgagttgctcttgccc19<210>24<211>26<212>dna<213>人工合成<400>24atccgctcatgagacaataaccctga26<210>25<211>21<212>dna<213>人工合成<400>25caggaaccgtaaaaaggccgc21<210>26<211>22<212>dna<213>人工合成<400>26ctctgacttgagcgtcgatttt22当前第1页12