一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法与流程

本发明涉及生物工程方法技术领域，具体是一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法。

背景技术

昆虫主要通过嗅觉识别外界的化学信号，化学感知在昆虫的觅食、交配和躲避天敌活动中，起着至关重要的作用。昆虫在长期的进化过程中，形成了一套精密的嗅觉感受系统，嗅觉感官主要分布在昆虫的触角上，通过触角能够感知外界环境的化学刺激。昆虫触角中高表达的气味结合蛋白(odorantbindingproteins，obps)与嗅觉识别相关。昆虫气味结合蛋白(obps)是一类分子量较小(15～20ku)，广泛存在于昆虫的化学感受器淋巴液中的酸性蛋白。其是昆虫与外界进行信息交流的媒介，与外界的气味物质进行相互作用，对于维持昆虫的生命活动起到重要作用。因此克隆得到气味结合蛋白对于研究其识别机制具有重要意义。

淡足侧沟茧蜂microplitispallidipesszepligeti是蔬菜夜蛾中低龄幼虫的优势寄生蜂，是甜菜夜蛾spodopteraexigua和斜纹夜蛾spodopteralitura田间种群数量的重要调节因子。淡足侧沟茧蜂在田间对寄生昆虫具有较高的寄生效果，田间自然寄生率为6.3％～50％，研究发现淡足侧沟茧蜂能够识别不同健康状况的寄主，这种识别作用主要是通过其嗅觉蛋白即寄生蜂气味结合蛋白mpobp8来作用。因此，本发明提供一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取淡足侧沟茧蜂成蜂的总rna，然后合成第一链cdna；

(2)设计扩增淡足侧沟茧蜂寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的引物；并在正、反向引物中分别引入bamhⅰ和hindⅲ限制酶切位点核酸序列；

正向引物序列：5′-cgcgcgggatccatggattcaaatataaaatatat-3′；反向引物序列：5′-cgcgcgaagcttctactgggtcattttcagaggc-3′；

以淡足侧沟茧蜂成蜂触角cdna第一链为模板进行pcr扩增，pcr产物经凝胶电泳，回收目的片段；

(3)将目的片段用内切酶hindⅲ和bamhⅰ进行双酶切后，对酶切产物进行纯化；同时将pet32a(+)质粒用hindⅲ和bamhⅰ进行双酶切和纯化；纯化后的酶切产物在t4dnaligase体系下过夜连接；连接产物转化感受态菌株trans1-t1并测序，将测序正确的样品提取质粒；

(4)将重组质粒转化到表达感受态细胞bl21(de3)中，之后接种于lb培养基中培养；然后再转接于lb培养基中；且做空载体pet32a(+)质粒转化到表达感受态细胞bl21(de3)的对照；

(5)重组蛋白表达条件的优化；

(6)目的蛋白的分离纯化。

作为本发明进一步的方案：步骤(1)中，总反应体系为20ul，包括：5×rtreactionmix(反应混合液)4ul，randomprimer(引物)1ul，hifih^﹣rtase/rimix9(反转录酶)0.8ul，rnasefreeh2o(rna酶处理过的水)4.2ul，总rna10ul。

作为本发明进一步的方案：步骤(2)中pcr扩增总反应体系为20ul，包括正反引物各0.4ul，10×taqbuffer(pcr反应混合液)2ul，dntps(碱基)0.4ul，taqdnapolymerase(pcr聚合酶)0.4ul，cdna2ul，ddh2o(去离子水)14.4ul；反应条件：94℃预变性10min，94℃30s，50℃30s，72℃1min30s；72℃延伸10min。

作为本发明进一步的方案：步骤(4)具体为：将重组质粒转化到表达感受态细胞bl21(de3)中，之后接种于10ml含氨苄青霉素50ug/ml的lb培养基中，在摇床37℃，200r/min的条件下，振荡培养10h；然后按1:100比例转接于50mllb培养基中；且做空载体pet32a(+)质粒转化到表达感受态细胞bl21(de3)的对照。

作为本发明进一步的方案：步骤(5)具体包括：通过检测培养液不同的od600值；在不同的诱导温度、不同诱导持续时间和不同的iptg诱导浓度条件下，sds-page分析寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的表达量，得出最佳诱导条件。

作为本发明进一步的方案：步骤(6)具体包括：1)菌体的收集、破碎：离心，分别收集目的表达菌体及空白对照菌体；加入磷酸缓冲液pbs，将菌体悬浮，超声破碎；分别取目的表达菌体及空白对照菌体的全菌加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀；再离心，分别取上清和经磷酸缓冲液pbs处理的不溶物加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀；以上混匀后的各样品沸水浴处理；2)目的蛋白的分离纯化和浓缩：将超声破碎后收集的上清与ni-nta装柱后收集的穿透液加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀，待sds-page分析；用washbuffer洗杂，收集流出液，sds-page分析；用不同浓度的咪唑洗脱，所得样品待sds-page检测洗脱效果；收集洗脱液，并用millipore浓缩管浓缩，然后离心；用bca蛋白定量法测定目的蛋白含量。

作为本发明进一步的方案：步骤1)具体步骤为：在4℃，3000rpm条件下离心10min，分别收集50ml目的表达菌体及空白对照菌体；加入7ml磷酸缓冲液pbs，将菌体悬浮，超声破碎；分别取目的表达菌体及空白对照菌体的全菌各30μl加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀；再于12000r/min4℃离心20min，分别取上清和经磷酸缓冲液pbs处理的不溶物各30μl加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀；以上混匀后的各样品沸水浴处理3min～5min，置-20℃冰箱待用。

作为本发明进一步的方案：步骤(6)具体步骤为：将超声破碎后收集的上清与ni-nta装柱后收集的穿透液加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀，待sds-page分析；用5倍柱体积的washbuffer洗杂，流速控制为300cm/h，收集流出液，sds-page分析；用不同浓度的咪唑洗脱，流速控制为150cm/h，所得样品待sds-page检测洗脱效果；收集洗脱液，并用millipore浓缩管浓缩，4000r/min、4℃离心20-30min；用bca蛋白定量法测定目的蛋白含量。

一种根据上述制备方法制备得到的寄生蜂气味结合蛋白mpobp8，寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的核苷酸序列如下：

atggattcaaatataaaatatatgtgcttcttatatatatttattgttgttttcatgttttcttctgaggcaatcgatcaatcagacccacatgcatctacacgaaaaaaatgtagcagtgaatttaagttaagtgatgaaatcctcaaattaggagaagaaaatccgagcgatttcagctgctatctgttttgcttattcaaagatattaatattatgaacgaaaaaggagagtttgatcctaatctcgctgcgcaagaagtacaagataatttgagggaagctgctaggaaatatatattcatgtgttatgattcagtcaaaccaaatatgaccagcgatggatgcagaaacgctcttgaaatagtgcaatgtttcaaagaaaaagcacctgaaatgtatgagatgttaggactttttcacccaccattaaatgagcctctgaaaatgacccagtag；

寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的氨基酸序列如下：

mdsnikymcflyifivvfmfsseaidqsdphastrkkcssefklsdeilklgeenpsdfscylfclfkdinimnekgefdpnlaaqevqdnlreaarkyifmcydsvkpnmtsdgcrnaleivqcfkekapemyemlglfhpplneplkmtq。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法，得到的可溶性寄生蜂气味结合蛋白质量稳定可靠，对于研究其识别机制具有重要意义，具有较好的市场价值和社会价值。

附图说明

图1为不同温度下重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达示意图。

图2为不同诱导时间重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达示意图。

图3为不同iptg诱导浓度重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达示意图。

图4为加入iptg时机重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达示意图。

图5为重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达及纯化示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

一种寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

一、淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白基因的获得

(1)采用柱式动物组织总rna抽提纯化试剂盒提取淡足侧沟茧蜂成蜂(30头)的总rna，然后采用hifirtkit反转录试剂盒合成第一链cdna，总反应体系为20μl，包括：5×rtreactionmix4μl，randomprimer(0.1ug/μl)1μl，hifih^﹣rtase/rimix0.8μl，rnasefreeh2o4.2μl，总rna10μl(50ng-5ug)；

(2)设计扩增淡足侧沟茧蜂寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的引物，并在正、反向引物中分别引入bamhⅰ和hindⅲ限制酶切位点核酸序列；

正向引物序列：5′-cgcgcgggatccatggattcaaatataaaatatat-3′；正向引物序列见seqidno.3；反向引物序列：5′-cgcgcgaagcttctactgggtcattttcagaggc-3′；反向引物序列见seqidno.4；

以淡足侧沟茧蜂成蜂触角cdna第一链为模板进行pcr扩增，总反应体系为20μl，包括：正反引物各0.4μl，10×tagbuffer2μl，dntps(10mm)0.4μl，taqdnapolymerase(2u/μl)0.4μl，cdna2μl(≤50ng)，ddh2o14.4μl；反应条件：94℃预变性10min，94℃30s，50℃30s，72℃1min30s(35cycles)；72℃延伸10min；pcr产物经凝胶电泳，回收目的片段，20℃保存备用；

(3)将目的片段用内切酶hindⅲ和bamhⅰ进行双酶切后，对酶切产物进行纯化；同时将pet32a(+)质粒用hindⅲ和bamhⅰ进行双酶切和纯化；纯化后的酶切产物在t4dnaligase体系下16℃过夜连接；连接产物转化感受态菌株trans1-t1并测序，将测序正确的样品提取质粒，-20℃保存备用；

(4)将重组质粒转化到表达感受态细胞bl21(de3)中，之后接种于10mllb培养基(含氨苄青霉素50ug/ml)中，在摇床37℃，200r/min的条件下，振荡培养10h；然后按1:100比例转接于50mllb培养基中；且做空载体pet32a(+)质粒转化到表达感受态细胞bl21(de3)的对照；

二、重组蛋白表达条件的优化

(1)通过检测培养液不同的od600值(0.1-0.8)；在不同的诱导温度(25-37℃)、不同诱导持续时间(1-9h)和不同的iptg诱导浓度(0.1-1.0mm)条件下，sds-page分析寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的表达量，得出最佳诱导条件；

三、目的蛋白的分离纯化

(1)菌体的收集、破碎；在4℃，3000rpm条件下离心10min，分别收集50ml目的表达菌体及空白对照菌体；加入7ml磷酸缓冲液pbs(ph＝7.4)，将菌体悬浮，超声破碎(25％脉冲，超声总时20min，超声1s，间隔2s)；分别取目的表达菌体及空白对照菌体的全菌各30μl加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀；再于12000r/min4℃离心20min，分别取上清和经磷酸缓冲液pbs(ph＝7.4)处理的不溶物各30μl加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀；以上混匀后的各样品沸水浴处理3min～5min，置-20℃冰箱待用；

(2)目的蛋白的分离纯化和浓缩；将超声破碎后收集的上清与ni-nta装柱后收集的穿透液加入等量的2×sds-pagesamplebuffer混匀，待sds-page分析；用5倍柱体积的washbuffer洗杂，流速控制为300cm/h，收集流出液，sds-page分析；用不同浓度的咪唑洗脱，流速控制为150cm/h，所得样品待sds-page检测洗脱效果；收集洗脱液，并用millipore浓缩管浓缩，4000r/min、4℃离心20-30min；用bca蛋白定量法测定目的蛋白含量达90％以上。之后于-80℃保存。

本发明得到的寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的核苷酸序列如下：

atggattcaaatataaaatatatgtgcttcttatatatatttattgttgttttcatgttttcttctgaggcaatcgatcaatcagacccacatgcatctacacgaaaaaaatgtagcagtgaatttaagttaagtgatgaaatcctcaaattaggagaagaaaatccgagcgatttcagctgctatctgttttgcttattcaaagatattaatattatgaacgaaaaaggagagtttgatcctaatctcgctgcgcaagaagtacaagataatttgagggaagctgctaggaaatatatattcatgtgttatgattcagtcaaaccaaatatgaccagcgatggatgcagaaacgctcttgaaatagtgcaatgtttcaaagaaaaagcacctgaaatgtatgagatgttaggactttttcacccaccattaaatgagcctctgaaaatgacccagtag

寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的核苷酸序列见seqidno.1；

推导的寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的氨基酸序列如下：

mdsnikymcflyifivvfmfsseaidqsdphastrkkcssefklsdeilklgeenpsdfscylfclfkdinimnekgefdpnlaaqevqdnlreaarkyifmcydsvkpnmtsdgcrnaleivqcfkekapemyemlglfhpplneplkmtq

寄生蜂气味结合蛋白mpobp8的氨基酸序列见seqidno.2；

如图1-5所示，其中，图1为不同温度下重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达示意图；图2为不同诱导时间重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达示意图；图3为不同iptg诱导浓度重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达示意图；图4为加入iptg时机重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达示意图；图5为重组淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白mpobp8诱导表达及纯化示意图。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>459

<212>dna

<213>脱氧核糖核酸(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

atggattcaaatataaaatatatgtgcttcttatatatatttattgttgttttcatgttt60

tcttctgaggcaatcgatcaatcagacccacatgcatctacacgaaaaaaatgtagcagt120

gaatttaagttaagtgatgaaatcctcaaattaggagaagaaaatccgagcgatttcagc180

tgctatctgttttgcttattcaaagatattaatattatgaacgaaaaaggagagtttgat240

cctaatctcgctgcgcaagaagtacaagataatttgagggaagctgctaggaaatatata300

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gaaatagtgcaatgtttcaaagaaaaagcacctgaaatgtatgagatgttaggacttttt420

cacccaccattaaatgagcctctgaaaatgacccagtag459

<210>2

<211>155

<212>prt

<213>氨基酸(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>2

proargthrmetalaseralaileleuthrmetcysproleuthrile

151015

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202530

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354045

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130135140

proproleualaglyproleuleumetthrgly

145150155

<210>3

<211>35

<212>dna

<213>脱氧核糖核酸(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>3

cgcgcgggatccatggattcaaatataaaatatat35

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>脱氧核糖核酸(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>4

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